邢慧穎，黃莉，2*，丁波，趙望鋒，趙吉信，張小鳳，王興瑞

1(濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州，256600)2(山省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州，256600)

植物多酚是具有苯環(huán)并結(jié)合多個羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)總稱，主要包括黃酮類化合物、酚酸類化合物和其他類化合物，因其具有較強的抗氧化以及清除自由基的能力[1]，能夠預(yù)防高血糖、高血脂、心腦血管等慢性疾病、降低癌癥風險以及抵抗神經(jīng)性疾病[2]，被廣泛應(yīng)用于食品、藥理、營養(yǎng)、生化等領(lǐng)域[3]。植物多酚廣泛存在于植物的皮、根、葉、果實及果皮中，如綠原酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallo-catechin gallate，簡稱EGCG)、蘆丁、槲皮素、鼠尾草酸主要存在于金銀花、茶葉、銀杏、山楂葉、迷迭香等植物的花、葉中，含量豐富。EGCG、蘆丁、槲皮素屬于典型黃酮類化合物，鼠尾草酸和綠原酸是酚酸類化合物。將富含多酚化合物的物質(zhì)開發(fā)成功能性的食品，對人類健康具有重要作用。

植物多酚被人體吸收才能發(fā)揮其生物活性，但其被人體吸收受分子的極性和分子大小的影響[4]。分子的極性常用油水分配系數(shù)來表征，表征化合物親脂性和透過生物膜的能力，是預(yù)測跨膜轉(zhuǎn)運的重要參數(shù)[5]，現(xiàn)已被廣泛用來預(yù)測多酚在生物體內(nèi)的膜滲透性[6-8]。植物多酚若要被人體消化吸收，須以分子形式透過生物膜，即須具備一定的親水性及親脂性。多酚被機體消化和利用的程度可以用生物可接受率和生物利用度來衡量。生物可接受率是指營養(yǎng)素被機體攝入后，經(jīng)胃、小腸消化后，營養(yǎng)元素及可被小腸吸收利用的功能成分量占攝入總量的比值。生物利用度是營養(yǎng)素進入人體循環(huán)的量的比例，即營養(yǎng)素由胃腸道吸收，經(jīng)過肝臟而到達體循環(huán)血液中的量占攝入量的百分比[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(純度≥98%)、鼠尾草酸(純度≥98%)、綠原酸(純度≥98%)、槲皮素(純度≥98%)、蘆丁(純度≥98%)，南京道斯夫生物科技有限公司；透析袋(MD34)，美國聯(lián)合碳化透析袋，上海橋星貿(mào)易有限公司。α-淀粉酶(≥3 700 U/mg)、胃蛋白酶(3 000～3 500 U/mg)、胰蛋白酶(≥300 U/mg)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，1-正辛醇等試劑均為分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 設(shè)備

T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;低溫離心機，賽默飛世爾科技中國有限公司;雷磁PHS-3C pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;ZD-85氣浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;安捷倫1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚油水分配系數(shù)的測定

配制pH值為1.5、5.8、7.8的磷酸鹽緩沖溶液，取正辛醇與各pH值的磷酸鹽緩沖液等體積混合，振蕩12 h，在室溫下靜置24 h，上層溶液即為磷酸鹽緩沖液飽和的正辛醇，下層溶液即為正辛醇飽和的磷酸鹽緩沖液。用水飽和的正辛醇溶液配制飽和的EGCG、鼠尾草酸、綠原酸、槲皮素、蘆丁溶液10 mL，3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液5 mL，再加入等體積pH相同的正辛醇飽和的磷酸鹽緩沖液，置于錐形瓶中。將正辛醇-水混合物先超聲30 min，再在氣浴恒溫振蕩器中(37 ℃、200 r/min)振搖1 h，取出后避光靜置2 h。取原正辛醇多酚溶液(ρ總)和振蕩后的上層溶液(飽和正辛醇中溶解的多酚，ρ0)，用0.45 μm濾膜過濾后置于進樣瓶中，用高效液相色譜儀測定。水相濃度ρW=ρ總-ρ0，按照分配系數(shù)的公式：lgP=lgρ0/ρW計算其表觀油水分配系數(shù)[13]。

1.2.2 高效液相色譜法測定多酚的油水分配系數(shù)

使用安捷倫TC-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。綠原酸、槲皮素、蘆丁、鼠尾草酸使用的流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液(體積比13∶87)、甲醇-0.4%磷酸溶液(體積比45∶55)、甲醇-0.4%磷酸溶液(體積比35∶65)、乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比60∶40)；EGCG的流動相：A:乙腈-乙酸- EDTA-2Na (體積比90∶8∶2，定容至1 000 mL)，B乙腈-乙酸- EDTA-2Na (體積比80∶18∶2，定容至1 000 mL)，梯度條件：100% A保持10 min，100% A→68%A 5 min；0% B→32%B；15 min后→100%A。柱溫30 ℃、流速1.0 mL/min、進樣量:10 μL，檢測波長依次為327、368、360、230和278 nm。

1.2.3 DPPH自由基清除能力的測定

參照MANOHAR等[14]的方法。將0.5 mL多酚待測液與3 mL 50 μmol/L的DPPH乙醇溶液混合,放置在室溫下避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測定其吸光度，并且按公式(1)計算DPPH自由基清除率:

(1)

式中:AC為對照的吸光度，AS為樣品的吸光度。

1.2.4 還原能力(鐵氰化鉀法)

參照趙文思等[15]的方法，將0.5 mL待測液與2.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6，0.2 mol/L)和2.5 mL 1%鐵氰化鉀充分混合，放置在50 ℃溫度下加熱20 min，快速冷卻，再向溶液中加入10%三氯乙酸 2.5 mL，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水，與0.5 mL 0.1% 三氯化鐵溶液，充分混勻，隨后靜置10 min，在700 nm下測吸光度，用吸光度A700可直接表示還原能力，且吸光度越大還原能力越強。

1.2.5 體外模擬人體口腔、胃、腸消化處理

體外模擬消化過程參照文獻[16]中的方法。準確稱取12.50 mg各多酚樣品與25 mL蒸餾水混勻，置于氣浴恒溫振蕩器(37 ℃、100 r/min)中振蕩10 min，取出一半樣品進行低溫冷凍離心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，取上清液10 mL，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?，作為未消化樣品；另一半樣品進入消化模擬階段，分別為口腔消化(0.119 g Na2HPO4，0.009 5 g KH2PO4，0.4 g NaCl加蒸餾水定容到50 mL，溶液pH調(diào)至6.75，加入0.455 g α-淀粉酶)、胃消化(用1 mol/L鹽酸將消化液pH調(diào)至1.5～2.0，加入10 mL 4 mg/mL的胃蛋白酶溶液)、小腸消化(10 mL 1.2 mg/mL胰酶和2.4 mg/mL豬膽鹽混合液,用0.1 mol/L NaHCO3調(diào)pH為7.4)，分別取出10 mL經(jīng)胃、腸液消化的樣品進行低溫冷凍離心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?，作為胃、腸消化樣品；取20 mL模擬腸消化樣品放入燒杯中，再放入裝有10 mL 0.05 mol/L KH2PO4(pH 7.0)的透析袋，在 37 ℃、100 r/min條件下振蕩4 h，透析袋中的成分為可吸收樣品(in)，透析袋外樣品為不可吸收樣品(out)，迅速進行低溫冷凍離心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，從in取上清液10 mL，從out中取上清液7 mL，放置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 多酚含量和總抗氧化能力的測定

經(jīng)過胃腸消化階段后各多酚的含量采用高效液相法測定，方法同1.2.2。以DPPH方法表征多酚的總抗氧化能力。

1.2.7 多酚、抗氧化性的生物可接受率和生物利用度理論計算

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：ρ腸為多酚經(jīng)過小腸消化后保留的多酚含量，mg/mL；ρ未消化為多酚的初始質(zhì)量濃度，mg/mL；ρIN為透析袋中總多酚的量，mg/mL；A腸為多酚經(jīng)過小腸消化后保留的抗氧化活性；A未消化為多酚的初始抗氧化活性；AIN為透析袋中多酚的抗氧化活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1 (分析軟件, St Paul, MN) 軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 11.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對不同植物多酚親水親油性的影響

油水分配系數(shù)是用于表示化合物親脂性和透過生物膜能力的重要參數(shù)，常用于評價藥物在人體胃腸道的吸收和轉(zhuǎn)運情況[17]。根據(jù)油水分配系數(shù)lgP的范圍，可以判斷多酚的親水/親油性，能否跨膜轉(zhuǎn)運和被吸收的情況。當lgP<0，化合物顯示水溶性，lgP>0，化合物則表現(xiàn)出脂溶性，當lgP<-2時，化合物親水性太強，不能穿過脂質(zhì)膜；當lgP>3，則化合物的疏水性太強，很難從細胞膜另一側(cè)釋放出來并進入附近的血管或淋巴管[18]。人體內(nèi)胃腸道pH值范圍在1.4～8.0[19]，因此，選擇pH 1.5、5.8、7.8分別代表胃液、十二指腸液、小腸液的pH值，其與多酚的結(jié)構(gòu)、含量變化及在胃腸道吸收程度有很大的影響。表1為鼠尾草酸、槲皮素、蘆丁、EGCG和綠原酸在pH 1.5、5.8、7.8的標準曲線及線性濃度范圍，表2為5種多酚在3個pH值條件下的油水分配系數(shù)。由表2可知，在pH 1.5、5.8、7.8時，鼠尾草酸和槲皮素的lgP為[0,3]，蘆丁的lgP值[-1,1]，說明這3種多酚在胃腸環(huán)境中具有良好的親脂親水性，多酚化合物可以穿過細胞膜并從細胞膜另一側(cè)釋放出來，被人體吸收利用；EGCG和綠原酸在pH 1.5和pH 5.8時，lgP值在[-1,1]，能被人體吸收利用，而在pH 7.8時，lgP在[-3,0]，因其水溶性較強而不易穿過腸黏膜并被人體吸收。pH對多酚化合物親水親油性的影響，本質(zhì)原因可以歸結(jié)為pH對其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。如：EGCG在pH 2～6穩(wěn)定，在中性和堿性水溶液中極不穩(wěn)定，羥基去質(zhì)子化生成過氧化物和氧化產(chǎn)物或者二聚體[20]；綠原酸在酸性條件下較為穩(wěn)定，呈分子形態(tài)存在，在偏中性和弱堿性條件下呈解離態(tài)或其同分異構(gòu)體形式存在[21]。因此，EGCG和綠原酸在pH 7.8親水性較強與其羥基質(zhì)子化或解離有關(guān)。

表1 不同極性植物多酚在不同pH值下油水分配系數(shù)標準曲線

表2 不同極性植物多酚在不同pH值下油水分配系數(shù)

2.2 不同極性植物多酚抗氧化能力的比較

不同極性植物多酚對DPPH自由基清除能力和對亞鐵離子的還原能力如圖1所示。鼠尾草酸、槲皮素、蘆丁、EGCG和綠原酸對DPPH自由基的清除率分別為(63.09±2.59)%、(79.20±1.08)%、(71.92±1.87)%、(89.60±1.30)%和(80.24±1.52)%，差異顯著(P<0.05)；對Fe2+還原能力為( 0.70±0.02)、(0.82±0.01)、(0.72±0.02)、(1.16±0.06)和(0.91±0.07) mmol/L，差異顯著(P<0.05)。多酚化合物因具有供氫或電子并具有螯合金屬的能力而具有較強的抗氧化能力[22]。在5種極性不同的酚類化合物中，EGCG的自由基清除能力和還原能力最強，而鼠尾草酸的最弱，這可能與酚類化合物中酚羥基的數(shù)據(jù)有關(guān)。EGCG是酯型黃酮類化合物，具有8個羥基，可以清除大量的自由基，包括單線態(tài)氧、超氧陰離子、過氧自由基和羥自由基[22]，因此，水溶性的EGCG表現(xiàn)出較強的自由基清除能力和亞鐵離子還原能力；鼠尾草酸是一種酚型的二萜類化合物，苯環(huán)上有2個羥基易離子化成為良好的供氫體。EGCG和鼠尾草酸具有較強的羥自由基的清除能力。EGCG亞鐵離子還原能力表征的是多酚樣品總的還原能力，還原能力越強，抗氧化活性就越高。EGCG的苯環(huán)上有多個活潑的鄰位羥基，可將Fe3+還原為Fe2+, 因此其表現(xiàn)出較強的亞鐵離子還原能力。

圖1 不同極性植物多酚抗氧化能力

2.3 多酚含量的生物可接受率和生物利用度

生物可接受率指數(shù)和生物利用度指數(shù)可以表征多酚進入小腸及穿過小腸黏膜進入血液中的比例，一般地，多酚只有保持其完整的結(jié)構(gòu)才能被吸收后發(fā)揮其生物活性[17]。多酚含量的生物可接受率和生物利用度如圖2所示，鼠尾草酸、槲皮素、蘆丁、EGCG和綠原酸5種多酚含量的生物可接受率分別為0.45±0.04、0.32±0.00、1.05±0.03、0.15±0.00、0.38±0.01，生物利用度分別為0.18±0.00、0.65±0.02、0.50±0.01、0.17±0.00、0.33±0.01，多酚生物利用度差異顯著(P<0.05)。由此可知，對多酚的生物活性利用度高低的順序依次為槲皮素>蘆丁>綠原酸>鼠尾草酸>EGCG。

圖2 不同多酚體外模擬多酚含量的生物可接受率和生物利用度

相同質(zhì)量的酚類化合物經(jīng)過胃腸道消化過程后，酚類物質(zhì)含量發(fā)生了顯著的變化(P<0.05)。酚類含量的變化可能與所采用的體外消化測試模型有關(guān)，此模型主要涉及了參與消化的機械力(以振搖的方式實現(xiàn))和化學(xué)力(體液pH值、消化酶類)，并未涉及到微生物在腸道中對食物消化吸收的影響，因此，此模型檢測的數(shù)據(jù)不能完全預(yù)測多酚在人體吸收的程度。此外，酚類化合物經(jīng)過口腔、胃消化和小腸消化3個階段后，受到酸(pH 1.5的胃液)、堿(pH 7.4的NaHCO3小腸液)的水解作用和酶(淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶)的作用，結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，如圖3所示。鼠尾草酸是親脂性較強的酚酸類化合物，經(jīng)過消化過程后，在色譜圖上產(chǎn)生了2個明顯的主峰，說明有部分鼠尾草酸結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其他4種多酚的色譜圖也有類似變化。從多酚含量的生物可接受率看，蘆丁的多酚生物可接受率>1，這可能是由于蘆丁在水相中溶解度很小，經(jīng)過胃腸消化階段后，溶解度增加所致；其余4種多酚生物可接受率均<1，說明經(jīng)過胃腸消化后，多酚因酸和酶的水解作用含量下降，BOHN等的研究結(jié)果也證實了這一點[23]。鼠尾草酸和綠原酸的多酚生物可接受率指數(shù)較高，這說明胃腸道消化液對綠原酸和鼠尾草酸的影響小，而對EGCG、槲皮素和蘆丁的影響比較顯著(P<0.05)，在胃腸道環(huán)境中，酚酸類化合物的結(jié)構(gòu)比黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。李俶等研究了7 種多酚單體在消化過程中的穩(wěn)定性[24]，發(fā)現(xiàn)單個酚酸類成分受胃液pH的影響較小，而類黃酮成分在胃液中則發(fā)生降解；酚類化合物在腸道的堿性環(huán)境中可以水解[25]，黃酮類結(jié)構(gòu)相比酚酸類結(jié)構(gòu)對胃腸道消化液的pH值更敏感，大部分多酚成分在腸液中不穩(wěn)定。在小腸消化階段，胰蛋白酶、膽汁鹽、脂肪酶、淀粉酶等使黃酮類非極性多酚形成水溶性的混合膠束[23]，這個可能是導(dǎo)致多酚的生物可接受率較低的原因。在pH 1.5、5.8條件下，5種多酚單體的lgP在[-1, 2]，具有較好的親水親油性，可以穿過胃腸道黏膜跨膜轉(zhuǎn)運；在模擬腸道環(huán)境(pH 7.8)中，鼠尾草酸、槲皮素和蘆丁的lgP為[-1,2]，具有良好的親水親油性，但EGCG和綠原酸的lgP<-1，親水性較強，不能跨腸道黏膜轉(zhuǎn)運而進入到血液中這也是其生物可利用度低的主要原因。研究表明口服茶多酚中，不超過5%能進入小鼠的體循環(huán)，大約1.68%消化的茶多酚中只有0.16%能進入到血液中，1.1%出現(xiàn)在尿液中，0.42%出現(xiàn)在糞便中[26]。槲皮素一般以糖苷鍵的形式與糖相連而存在，分子的大小和極性導(dǎo)致其很難穿過腸膜，標準的槲皮素分子在小腸的吸收度大約為24%[27]，這與本實驗的研究結(jié)果(槲皮素的多酚生物利用度約21%)非常接近,但BISCHOFF報道65%～81%的槲皮素能穿過小腸上皮細胞進入肝臟并被進一步代謝利用[28]，其生物利用度遠高于本實驗結(jié)果。綠原酸的親水性較強，穿透小腸黏膜進入血液的能力也較弱，因此，其生物利用度也較低，但王曉梅等也證實綠原酸可以很好地穿透胃、小腸和大腸均能吸收，且在胃和小腸中可以原結(jié)構(gòu)吸收進入血液[29]。綠原酸在pH 1.5、pH 5.8條件下，-1

圖3 不同多酚體外模擬消化后HPLC的變化

2.4 多酚抗氧化活性的生物可接受率和生物利用度

多酚的抗氧化活性是其引起消費者關(guān)注的重要因素之一，多酚經(jīng)過消化系統(tǒng)后結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，多酚含量下降，檢測抗氧化活性的變化是必要的。如圖4所示，鼠尾草酸、槲皮素、蘆丁、EGCG和綠原酸5種多酚的抗氧化性生物可接受率指數(shù)分別為0.17±0.00、0.31±0.01、0.14±0.00、1.77±0.03、2.18±0.00，多酚的抗氧化性生物可接受率指數(shù)差異顯著(P<0.05)，且綠原酸和EGCG的抗氧化性生物可接受率>1，這可能與其所含酚羥基基團數(shù)量有關(guān)，這與圖1多酚對DPPH自由基清除能力和亞鐵離子還原能力的結(jié)果相一致，此外，也可能與其在腸液環(huán)境中具有較強的親水性有關(guān)(如表1數(shù)據(jù)所示)，如EGCG在堿性條件下可以生成黃烷-3-醇二聚體和醌類二聚體，綠原酸(5-O-咖啡?？鼘幩?可能轉(zhuǎn)變成其同分異構(gòu)體3-或4-O-咖啡酰奎寧酸[30]，具有較強的抗氧化性，因此EGCG和綠原酸抗氧化性生物可接受率較高。

圖4 不同多酚體外模擬抗氧化性的生物可接受率和生物利用度

抗氧化性生物利用度指數(shù)分別為0.09±0.01、0.76±0.01、0.16±0.01、0.17±0.01、0.21±0.03，多酚的抗氧化性生物利用度的大小順序為槲皮素>綠原酸>EGCG>蘆丁>鼠尾草酸。槲皮素的抗氧化性生物利用度顯著高于其他多酚(P<0.05)，這可能與槲皮素具有較高的多酚生物可接受率指數(shù)和多酚生物利用度指數(shù)有關(guān)，槲皮素可能經(jīng)過胃腸消化體系后，因結(jié)構(gòu)未受影響而以原結(jié)構(gòu)吸收，所以其保留了很強的抗氧化性。EGCG雖然具有較高的抗氧化性生物可接受率指數(shù)，但其抗氧化性生物利用度很低，這與EGCG親水性較強而不能穿過滲透膜有關(guān)。蘆丁在體內(nèi)主要為酯水解的Ⅰ相代謝，其利用率會降低；槲皮素在體內(nèi)為Ⅱ相代謝，槲皮素經(jīng)Ⅱ相代謝后以槲皮素或其他化合物而被腸道重吸收[31]，因此其利用率和抗氧化性會高于蘆丁。

通過模擬體外消化系統(tǒng)，可以從理論上推斷5種多酚化合物的生物利用程度，但多酚化合物在腸道中還會受微生物作用而發(fā)生降解作用，如槲皮素會被產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)和脆弱類桿菌(B.fragilis)、大腸桿菌(E.coli)等菌屬降解[32]；綠原酸經(jīng)口攝入后可以到達結(jié)腸，并被細菌酯酶代謝生成咖啡酸和阿魏酸，二氫咖啡酸和二氫葉酸是其在血漿中和尿液中的主要代謝產(chǎn)物，且綠原酸在人體中的生物利用度主要取決于結(jié)腸中的微生物菌群對其轉(zhuǎn)化程度[33]。EGCG進入腸道后，先被腸道微生物遲緩埃格特菌(Eggerthellalenta)分解生成1-(3,4-二羥苯基)-3-(2,4,6-三羥苯基)丙烷-2-醇，再被普氏梭桿菌(Flavonifractorplautii)分解生成5-(3,4-二羥基苯基)-γ-戊內(nèi)酯和4-羥基-5-(3,4-羥苯基)戊酸，并表現(xiàn)出強抗氧化性。槲皮素可被腸道微生物分解為高藜蘆酸、3-(3-羥苯基)丙酸、3,4-二羥基苯甲酸和4-羥基苯甲酸[34]。

3 結(jié)論

綠原酸、蘆丁、鼠尾草酸、EGCG、槲皮素5種多酚廣泛分布于植物食品原料中。在pH 1.5和pH 5.8條件下，綠原酸、蘆丁、EGCG的-1