李曉嬌，楊麗華，陳玉梅，曹凱紅，何健民

(保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山，678000)

清香木(Pistaciaweinmannifolia) 屬漆樹科黃連木屬植物，為常綠灌木或小喬木，別名香葉樹、紫柚木、青香樹，性喜溫暖、耐干熱[1-2]。分布于我國(guó)云南中西部、北部及四川南部等海拔在1 000～2 700 m的干熱河谷地帶[3]。清香木的樹皮、樹葉、果實(shí)等可用來提取芳香油，還可供藥用，有消炎解毒、收斂止瀉功效[4]。

目前精油的提取方法主要有共水法、水蒸氣蒸餾法、溶劑浸提法、超臨界流體法、亞臨界CO2萃取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取等[5-8]，其中使用最廣泛的是共水蒸餾、水蒸氣蒸餾法和同時(shí)蒸餾萃取法，由于共水法操作簡(jiǎn)單、設(shè)備便宜，但蒸餾時(shí)間長(zhǎng)精油成分易分解[9]，因此本文為縮短蒸餾時(shí)間采用了超聲輔助-共水法(ultrasonic assisted-common water method，UWD)、微波輔助-共水法(microwave assisted-common water method，MWD)和有機(jī)溶劑萃取-共水法(同時(shí)蒸餾萃取法)(simultaneous distillation extraction，SDE)3種方法提取清香木葉精油。

近些年，國(guó)內(nèi)外對(duì)清香木葉揮發(fā)性成分及其生物活性研究還相對(duì)較少，周葆華[10]采用水蒸汽蒸餾法提取清香木葉揮發(fā)油，并使用氣相色譜質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定出28種化合物。隨后，又采用杯碟法和Alamarblue法檢測(cè)了其抑菌和抗腫瘤活性[11]，研究發(fā)現(xiàn)清香木葉揮發(fā)油中的活性成分對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、紅酵母均有較強(qiáng)的抑制活性，對(duì)體外肺癌株細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺滅作用。蔡寶國(guó)等[12]則采用頂空固相微萃取和GC-MS從清香木中分離出76 種化合物，喬永峰等[4]采用蒸餾萃取和GC-MS 聯(lián)用法從清香木的綠葉和嫩紅葉中分別分離到了45和48種化合物。綜上所述，對(duì)清香木葉的研究主要集中在成分分析和抑菌活性方面，而對(duì)提取工藝和抗氧化活性方面的研究還鮮有報(bào)道，本研究希望通過UWD、MWD和SDE 3種方法提取清香木葉精油，并測(cè)定其主要成分，考察每種精油的抗氧化和抑菌活性，以期為拓展清香木葉在醫(yī)藥、食品、化妝品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香木葉于2019年10月采摘于保山學(xué)院。

無水乙醚、無水乙醇、無水NaSO4、抗壞血酸、二甲亞砜、NaOH(均為分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)、沒食子酸丙酯(propylgallatum，PG)，酷爾化學(xué)北京科技有限公司；慶大霉素，上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌，本校微生物實(shí)驗(yàn)室保存；葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂，石獅市環(huán)球瓊膠工業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱、HWS-12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；JJ-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV2600紫外可見分光光度計(jì)，島津；SK250HP超聲清洗機(jī)，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；G80F23CN3L-C2微波爐，廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司；V-5100可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 清香木葉精油的提取方法

1.3.1.1 超聲輔助-共水法提取清香木葉精油(UWD精油)

參照華燕青等[13]的方法略加改動(dòng)，將鮮清香木葉剪至2～3 mm小段，稱取100 g樣品，置于1 000 mL圓底燒瓶中，按照1∶5 (g∶mL)加入500 mL蒸餾水，置于超聲清洗機(jī)中，功率250 W超聲20 min后取出，共水蒸餾至精油餾出量不再增加(3 h)，收集玻璃分水器中上層精油，并用無水Na2SO4干燥，過濾，得無色透亮清香木葉精油，4 ℃下保存，備用。出油率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.1.2 微波輔助-共水法提取清香木葉精油(MWD精油)

參照李靜等[14]的方法，前處理方法同1.3.1.1,將樣品置于微波爐中，功率480 W加熱7 min后取出，共水蒸餾至精油餾出量不增加(3 h)，收集玻璃分水器中上層精油，并用無水Na2SO4干燥、過濾，得淡黃色透亮清香木葉精油，4 ℃下保存、備用。

1.3.1.3 同時(shí)蒸餾萃取法提取清香木葉精油(SDE精油)

參照龍園園等[15]的方法樣品前處理方法同1.3.1.1，同時(shí)連接蒸餾萃取裝置，一端接口連接裝有樣品的圓底燒瓶并置于電熱套中加熱，另一端接口用250 mL圓底燒瓶裝80 mL乙醚恒溫水浴加熱，調(diào)整水浴溫度為35 ℃。冷凝回流3～4 h，始終保持大圓底燒瓶中為微沸狀態(tài)，加熱完畢后冷卻片刻，收集乙醚萃取液，蒸餾除去乙醚，得清香木葉精油，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 三種方法提取的清香木葉精油的成分分析[16-17]

采用GC-MS對(duì)3種方法提取的清香木葉精油進(jìn)行成分分析。氣相色譜條件為色譜柱子型號(hào)DB-17, 規(guī)格30 m×0.25 mm×0.25 μm，載氣為He，進(jìn)樣口溫度為230 ℃，流量為1.0 mL/min，升溫程序：起始50 ℃，保持4 min；5 ℃/min升溫到70 ℃；20 ℃/min升溫到120 ℃；10 ℃/min升溫到170 ℃；5 ℃/min升溫到200 ℃；40 ℃/min升溫到280 ℃。質(zhì)譜條件為離子源為EI，電離能70 eV，離子源溫度為200 ℃。

1.3.3 三種方法提取的清香木葉精油的抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考邢玉娟等[18]的方法略有改動(dòng)，用95%乙醇分別將3種方法提取的清香木葉精油配置成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/mL 的精油溶液。將2.0 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)和2.0 mL 不同質(zhì)量濃度的精油樣品溶液混合均勻，于暗處放置30 min，以95%乙醇為參比，在517 nm 處測(cè)定混合溶液的吸光值A(chǔ)。將DPPH溶液用等體積95%乙醇溶液代替，與2.0 mL精油樣品溶液混勻后在暗處?kù)o置30 min并測(cè)吸光值A(chǔ)0，再將精油溶液用等體積95%乙醇溶液代替，與2.0 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)混勻后在暗處?kù)o置30 min并測(cè)吸光值A(chǔ)1，每一個(gè)精油濃度平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)取平均值，抗氧化劑PG作為陽(yáng)性對(duì)照。按公式(2)計(jì)算DPPH·清除率：

(2)

1.3.3.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

參考王芳等[19]和權(quán)美平等[20]的方法，取等體積的2 mmol/L ABTS溶液與70 mmol/L過硫酸鉀溶液混合后于暗處反應(yīng)12 h，得ABTS+·溶液，后用95%乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光度為0.70±0.05，此吸光度值即為A0。用95%乙醇分別將3種不同方法提取的清香木葉精油配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/mL的精油溶液。將0.2 mL不同質(zhì)量濃度精油樣品加入3.8 mL ABTS+·溶液中，待反應(yīng)15 min后測(cè)其吸光度A1?？寡趸瘎㏄G作為陽(yáng)性對(duì)照。所有測(cè)定平行進(jìn)行3次取平均值，按公式(3)計(jì)算ABTS+·清除率：

(3)

1.3.4 三種方法提取的清香木葉精油的抑菌活性測(cè)定

1.3.4.1 培養(yǎng)基制作

固體培養(yǎng)基：稱取牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，NaCl 15 g，量取蒸餾水1 000 mL，煮沸到瓊脂全部融化，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4，121 ℃、0.1 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，滅菌后于超凈工作臺(tái)中向培養(yǎng)皿中倒入約25 mL培養(yǎng)基，冷卻后倒置培養(yǎng)皿，備用。

液體培養(yǎng)基：稱取牛肉膏0.9 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g以蒸餾水配置300 mL pH 7.4～7.6的液體培養(yǎng)基。121 ℃、0.1 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，備用。

1.3.4.2 菌種的活化[21]

無菌環(huán)境，接種環(huán)劃線將供試菌種接種于固體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)72 h。菌種培養(yǎng)：配制液體培養(yǎng)基，高壓滅菌處理冷卻后分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，放置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)20 h，使菌種濃度達(dá)到106～107CFU/mL，即紫外分光光度計(jì)最大吸收波長(zhǎng)(600 nm)處測(cè)定吸光度在1.4～1.5。若吸光度<1.4，則繼續(xù)培養(yǎng)至適宜濃度。若吸光度>1.5，則需加適量無菌生理鹽水稀釋。

1.3.4.3 三種方法提取的清香木葉精油的抑菌效果測(cè)定

采用二倍稀釋法[22]，用二甲亞砜配制質(zhì)量濃度為0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005 g/mL的精油溶液，并采用濾紙片法[23]測(cè)定不同質(zhì)量濃度精油對(duì)3種菌的抑菌圈直徑。用移液槍吸取150 μL(106～107CFU/mL)菌液，均勻涂布于待用的培養(yǎng)皿表面，將已滅菌的6 mm的圓形濾紙片平鋪在培養(yǎng)皿表面，每個(gè)培養(yǎng)皿放3個(gè)濾紙片，在分別移取5 μL的精油溶液滴在3個(gè)濾紙片上，然后將培養(yǎng)皿倒置于37 ℃的生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌情況，十字交叉法用游標(biāo)卡尺測(cè)量各個(gè)抑菌圈的直徑(mm)，記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果取重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值來評(píng)價(jià)抑菌效果。以二甲亞砜溶液為空白作對(duì)照試驗(yàn)，試驗(yàn)平行3次。

1.3.4.4 三種方法提取的清香木葉精油的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度測(cè)定

用液體培養(yǎng)基以二倍稀釋法對(duì)3種精油進(jìn)行稀釋，配制10 mL質(zhì)量濃度為0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005 g/mL的培養(yǎng)基精油混合溶液于25 mL試管中，冷卻后加入0.1 mL[(1.0～10)×106CFU/mL]供試菌菌懸液，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，取1 mL培養(yǎng)液涂布于平板培養(yǎng)基上，再在35 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以完全無菌生長(zhǎng)的濃度為其最低抑菌濃度(minimum inhibtion concentration，MIC)。再分別從精油濃度不低于MIC 的試管中取1 mL培養(yǎng)液涂于平板培養(yǎng)基上，于35 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以無菌生長(zhǎng)或菌落總數(shù)5的精油濃度為最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)[24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel、Origin 9.5軟件作圖，SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種方法提取的清香木葉精油的GC-MS成分比較

通過GC-MS對(duì)3種方法提取的清香木葉精油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，UWD法、MWD法、SDE法提取的精油分別鑒定出12、10、10種化合物，占峰面積的95.42%、97.00%、98.01%，結(jié)果如表1所示。由表2可知，3種方法中出油率最高的為MWD法，其次是UWD法，而SDE法的出油率比前2種方法要低，這是因?yàn)樵谡舫鋈軇┮颐褧r(shí)，有部分精油隨之蒸出。3種方法提取的清香木葉精油主要是萜烯類化合物，均含有較高的α-蒎烯(UWD精油40.62%、MWD精油59.53%、SDE精油34.69%)，該結(jié)果與喬永鋒等[4]研究得到的清香木葉精油的主要成分相同，但與周葆華[11]和蔡寶國(guó)等[12]研究得到的清香木葉主要成分有所差別，可能是由于環(huán)境、地域的不同造成揮發(fā)成分的組成和含量不同。UWD精油和SDE精油的主要成分基本相似，其 α-蒎烯、(S)-(-)-檸檬烯、(+)-香橙烯的總含量超過70%，而MWD精油的主要成分中沒有(S)-(-)-檸檬烯和(+)-香橙烯，但含有較高含量的γ-松油烯(13.42%)、α-側(cè)柏烯(11.82%)。α-蒎烯有松木、針葉及樹脂樣的氣息，因此3種方法提取的清香木葉精油均有松木香味，且較為濃郁，形成了云南清香木具有獨(dú)特芳香氣味。

表2 三種方法提取的清香木葉精油的主要成分比較

表1 三種方法提取的清香木葉精油的GC-MS成分

2.2 三種方法提取的清香木葉精油的抗氧化活性比較

2.2.1 三種方法提取的清香木葉精油對(duì)DPPH·清除率

如圖1所示，3種方法提取的清香木葉精油對(duì)DPPH·有一定的清除能力，且清除率隨著精油質(zhì)量濃度的增加而增大。在質(zhì)量濃度為0.01 g/mL時(shí)，MWD精油清除 DPPH·的能力要強(qiáng)于UWD和SDE精油，清除率為19.80%，在精油質(zhì)量濃度為0.02～0.06 g/mL時(shí)，DPPH·的清除率能力為PG>UWD精油>MWD精油>SDE精油，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.06 g/mL時(shí)，UWD精油和MWD精油清除率分別達(dá)到了95.00%和90.63%，清除能力與PG相近。由表3可知，PG對(duì)DPPH·的清除能力的IC50為0.002 g/mL，而3種方法提取的清香木葉精油對(duì)DPPH·的清除能力的IC50在0.023～0.027 g/mL，與強(qiáng)抗氧化劑PG相比效果相對(duì)較差，但是也表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性。

圖1 不同濃度的3種清香木葉精油對(duì)DPPH·的清除能力

2.2.2 三種方法提取的清香木葉精油對(duì)ABTS+·清除率

如圖2所示，3種方法提取的清香木葉精油對(duì)ABTS+·具有較好的清除能力，且均隨著濃度的增加而增大，當(dāng)精油質(zhì)量濃度為 0.01～0.06 g/mL時(shí)，3種精油清除ABTS+·的能力為PG>SDE精油>MWD 精油>UWD 精油。但精油質(zhì)量濃度為0.06 g/mL時(shí)，MWD 精油和SDE 精油對(duì)ABTS+·的清除能力大于90%，其中SDE精油清除能力可達(dá)95.20%，與PG的清除能力接近。由表3可知，PG對(duì)ABTS+·的清除能力的IC50為0.001 g/mL，而3種方法提取的清香木葉精油對(duì)ABTS+自由基的清除能力的IC50在0.010～0.017 g/mL。

表3 三種方法提取清香木葉精油的IC50

圖2 不同濃度的清香木葉精油對(duì)ABTS+·的清除能力

2.3 三種方法提取明清香木葉精油的抑菌活性比較

2.3.1 三種不同方法提取的清香木葉精油的抑菌活性結(jié)果

根據(jù)抗菌素抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[25-26]，極敏：抑菌圈直徑>20 mm；高敏：抑菌圈直徑15～20 mm；中敏：抑菌圈直徑10～15 mm；低敏：抑菌圈直徑7～9 mm；不敏感：抑菌圈直徑<7 mm。由表4可知，當(dāng)精油質(zhì)量濃度為0.64 g/mL 時(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)3種精油為高敏，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對(duì)3種精油為中敏，當(dāng)精油質(zhì)量濃度為0.32 g/mL 時(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)3種精油為中敏，而金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為低敏。雖然3種精油的抑菌活性均比慶大霉素低，但作為天然植物精油已經(jīng)具有較好的抑菌活性，可應(yīng)用于食品和醫(yī)療美容等行業(yè)。

表4 三種方法提取的清香木葉精油的抑菌活性

注:濾紙片直徑(6 mm) 包含在測(cè)量結(jié)果中，“-”表示無抑菌圈

2.3.2 三種不同方法提取的清香木葉精油的MIC和MBC

如表5所示，比較精油對(duì)3種菌的MIC和MBC，3種精油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用均高于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，其中UWD精油對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC和MBC分別達(dá)到了0.005 g/mL和0.01 g/mL，而對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC為0.04 g/mL，抑菌效果差別較大。比較3種精油的抑菌(MIC)和殺菌(MBC)活性，對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌：UWD精油>MWD精油>SDE精油；對(duì)大腸桿菌的MBC，UWD精油>MWD精油>SDE精油；對(duì)大腸桿菌的MIC，UWD精油>MWD精油和SDE精油，而MWD精油與SDE精油的MIC相當(dāng)。富含蒎烯[27-29]、檸檬烯[30]的精油對(duì)大腸桿菌等細(xì)菌有一定的抑菌活性，UWD精油中含有較高含量的蒎烯和檸檬烯，因此具有較好的抑菌活性。

表5 三種方法提取的清香木葉精油的MIC和MBC 單位：g/mL

3 結(jié)論

(1) MWD法提取的清香木葉精油的提取率最高為2.03%，其次是UMD法提取1.78%，最后是SDE法提取0.93%。3種方法提取的精油，萜烯類化合物含量最高，其中UWD法、MWD法和SDE法提取的精油蒎烯的含量分別為44.68%、62.67%、36.85%，UWD法和SDE法提取的精油中含有較多的檸檬烯，而在MWD法提取的精油中沒有檸檬烯。

(2) 3種方法提取的清香木葉精油都具有良好的抗氧化活性，當(dāng)精油質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)，超聲-輔助共水法(UWD)精油對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到了92.40%，同時(shí)蒸餾萃取(SDE)精油對(duì)ABTS+自由基的清除率達(dá)到了89.46%。

(3) 3種方法提取的清香木葉精油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有不同的抑菌效果，當(dāng)精油質(zhì)量濃度為0.64 g/mL 時(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)3種精油為高敏，3種精油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用均高于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。

從抗氧化和抑菌活性來看，清香木葉精油作為綠色天然的抗氧化劑和抑菌劑在食品、化妝品行業(yè)具有一定的開發(fā)潛力。