楊申明+楊紅衛(wèi)+王振吉++范樹國+謝正萍

摘要：為了優(yōu)化微波輔助提取常春油麻藤花總黃酮的提取工藝，并測定其總黃酮的抗氧化性。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定總黃酮含量，通過正交試驗L9（34）優(yōu)化其總黃酮的提取工藝參數(shù)，并就總黃酮對1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O-2[KG-2]· [KG-3]）的清除能力進行初步研究。結(jié)果表明：總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)75%，料液比1 g ∶[KG-3]30 mL，微波時間3.5 min，微波功率200 W，在此條件下，總黃酮的平均提取率為19.77%；微波輔助提取的常春油麻藤花總黃酮具有較強的抗氧化性，對DPPH·、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除作用明顯，且其質(zhì)量濃度與抗氧化活性呈一定的量效關(guān)系。

關(guān)鍵詞：常春油麻藤花；微波輔助提?。豢傸S酮；抗氧化性

中圖分類號： R151.3文獻標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0366-04

常春油麻藤（Mucuna sempervirens Hemsl）為蝶形花科（Papilionaceae）常春油麻藤屬植物，別稱牛馬藤、油麻藤子、綿麻藤[1]，在我國主要分布在四川、貴州和云南等地[2]，它是一種藥食同源植物，其藤莖、花和種子具有活血、通經(jīng)活絡(luò)之功效，常用于風(fēng)濕疼痛、四肢麻木、血虛貧血、月經(jīng)不調(diào)等病癥，具有很好的療效[1]。常春油麻藤產(chǎn)花量很多，云南楚雄每年2—5月采花炒食、做湯制作蔬菜食用，風(fēng)味獨特，是當(dāng)?shù)睾苁軞g迎的一道特色野菜。因此，常春油麻藤花在醫(yī)藥和食品工業(yè)領(lǐng)域中具有廣泛的利用價值。

目前，國內(nèi)外對常春油麻藤花的研究主要集中在揮發(fā)性成分[3]、黃酮類結(jié)構(gòu)鑒定、抗氧化活性成分[4]及抗氧化活性成分提取分離[5]等方面，其他有關(guān)常春油麻藤花的研究鮮見報道。近年來，黃酮類化合物越來越多的生物活性被不斷發(fā)現(xiàn)，其應(yīng)用范圍正逐步擴大，但對常春油麻藤花中總黃酮含量測定及提取工藝的研究未見報道。本研究采用微波輔助提取常春油麻藤花中總黃酮，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定總黃酮含量，通過正交試驗L9（34）優(yōu)化提取工藝。同時，以維生素C為對照，并就所提取的總黃酮對DPPH·、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用進行研究，旨在為常春油麻藤花的綜合利用提供依據(jù)和參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

常春油麻藤花采自云南省楚雄市，經(jīng)鑒定為蝶形花科常春油麻藤屬植物；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）由上海藍季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，維生素C由昆山譜森實驗室用品科技有限公司生產(chǎn)，其他所用化學(xué)試劑均為分析純，由天津市風(fēng)船化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

主要儀器：UV-2100型紫外分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；G80F23CN3P-Q5（QO）型微波爐，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；SE40ZF型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；HH-S2型恒溫水浴鍋，金壇市大地自動儀器廠；SHZ-ⅢA型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；202-00型干燥箱，上海市崇明實驗儀器廠。

1.2試驗方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用蕓香苷作標(biāo)準(zhǔn)品，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH[JP3]顯色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在502 nm[6]波長處測吸光度，以質(zhì)量濃度（C）對吸光度（D）進行線性回歸，得回歸方程 D=7.996 4C+0.002 9，r2=0.999 5。結(jié)果表明蕓香苷質(zhì)量濃度在0～0.040 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2常春油麻藤花總黃酮提取方法

工藝流程：新鮮常春油麻藤花→洗凈風(fēng)干后置于50 ℃干燥箱烘干→粉碎過40目→用石油醚去除色素和油脂→烘干→得去除色素和油脂的常春油麻藤花干粉（備用）→稱量→微波提取→抽濾→定容→測定總黃酮含量。

操作方法：準(zhǔn)確稱取1.0 g去除色素和油脂的常春油麻藤花干粉，加入乙醇溶液，置于微波中提取，提取完畢后抽濾，濾液定容至50 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法顯色，在502 nm波長處測樣品溶液吸光度，總黃酮提取率按式（1）計算。

[JZ（]提取率=C×N×V/m×100%。[JZ）][JY]（1）

式中：C表示根據(jù)回歸方程計算出的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；N表示稀釋倍數(shù)；V表示提取液體積，mL；m表示常春油麻藤花干粉質(zhì)量，g。

1.2.3單因素試驗設(shè)計

采用微波輔助進行提取，分別考察以下單因素的影響：（1）乙醇體積分數(shù)采用55%、65%、75%、85%、95%的條件下進行比較，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波時間3.0 min，微波功率200 W；（2）料液比采用1 g ∶[KG-3]20 mL、1 g ∶[KG-3]30 mL、1 g ∶[KG-3]40 mL、1 g ∶[KG-3]50 mL、1 g ∶[KG-3]60 mL 的條件下進行比較，乙醇體積分數(shù)75%，微波時間3.0 min，微波功率200 W；（3）微波時間采用2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min的條件下進行比較，乙醇體積分數(shù)75%，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波功率200 W；（4）微波功率采用100、200、300、400、500 W的條件下進行比較，乙醇體積分數(shù)75%，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波時間3.0 min，從而確定各因素的影響作用。

1.2.4正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇乙醇體積分數(shù)、料液比、微波時間、微波功率進行4因素3水平作 L9（34） 正交試驗優(yōu)化提取條件，因素水平設(shè)計，見表1。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

在料液比 1 g ∶[KG-3]40 mL、微波時間3.0 min、微波功率200 W的條件下，探究不同乙醇體積分數(shù)55%、65%、75%、85%、95%對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分數(shù)從55%增大至75%時，總黃酮提取率由12.06%增加至19.21%；當(dāng)乙醇體積分數(shù)從75%增大至95%時，總黃酮提取率由19.21%減小至9.59%。因此，最佳乙醇體積分數(shù)在75%附近，選乙醇體積分數(shù)65%～85%優(yōu)化試驗。

2.1.2料液比對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)75%、微波時間3.0 min、微波功率200 W的條件下，探究不同料液比1 g ∶[KG-3]20 mL、1 g ∶[KG-3]30 mL、1 g ∶[KG-3]40 mL、1 g ∶[KG-3]50 mL、1 g ∶[KG-3]60 mL 對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響。由圖2可知，當(dāng)料液比從1 g ∶[KG-3]20 mL增大至1 g ∶[KG-3]40 mL時，總黃酮提取率由13.47%增加至19.24%；[JP3]當(dāng)料液比從1 g ∶[KG-3]40 mL增大至1 g ∶[KG-3]60 mL時，總黃酮提取率由19.24%減小至1729%。因此，最佳料液比在1 g ∶[KG-3]40 mL附近，選料液比1 g ∶[KG-3]30 mL～1 g ∶[KG-3]50 mL優(yōu)化試驗。

[CM（26]2.1.3微波時間對總黃酮提取率的影響

75%、料液比1 g ∶[KG-3]40 mL、微波功率200 W的條件下，探究不同微波時間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響。由圖3可知，當(dāng)微波時間從2.0 min延長至3.0 min時，總黃酮提取率由13.66%增加至19.24%；當(dāng)微波時間從3.0 min延長至4.0 min時，總黃酮提取率由1924%減小至13.36%。因此，最佳微波時間在3.0 min附近，選微波時間2.5～3.5 min優(yōu)化試驗。

2.1.4微波功率對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)75%、料液比1 g ∶[KG-3]40 mL、微波時間3.0 min的條件下，探究不同微波功率100、200、300、400、500 W對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響。由圖4可知，當(dāng)微波功率從100 W增大至200 W時，總黃酮提取率由17.50%增加至19.20%；當(dāng)微波功率從200 W增大至500 W時，總黃酮提取率由19.20%減小至12.66%。因此，最佳微波功率在200 W附近，選微波功率100～300 W進行優(yōu)化試驗。

2.2正交試驗結(jié)果

由表2可知，對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響因素由大[CM（25]到小為乙醇體積分數(shù)>料液比>微波時間>微波功率。由[CM）]

極差分析得出最佳工藝條件為A2B1C3D2，即乙醇體積分數(shù)75%，料液比1 g ∶[KG-3]30 mL，微波時間3.5 min，微波功率200 W。在最佳工藝條件對常春油麻藤花總黃酮進行提取，重復(fù)5次，得到總黃酮平均提取率為19.77%（大于正交試驗結(jié)果中的最高提取率19.62%），相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD值為1.32%，表明該方法重現(xiàn)性良好，可用于常春油麻藤花中總黃酮的提取。

2.3常春油麻藤花總黃酮抗氧化性分析

2.3.1清除DPPH·的能力評價

DPPH·是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波長517 nm處有強吸收峰，當(dāng)有自由基清除劑存在時其溶液顏色變淺，且溶液褪色程度與清除劑的清除能力及數(shù)量呈正相關(guān)。因此，可根據(jù)褪色程度來間接評價其抗氧化劑的抗氧化性[12]。由圖5-A 可知，常春油麻藤花總黃酮質(zhì)量濃度在0.003 9～0.062 8 mg/mL 范圍內(nèi)，隨質(zhì)量濃度增大，清除DPPH·能力增強，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.062 8 mg/mL，清除率最大為82.83%。與同質(zhì)量濃度維生素C相比，總黃酮清除DPPH·能力稍弱于維生素C（96.33%），但常春油麻藤花總黃酮依然表現(xiàn)出較強的清除DPPH·的能力。

2.3.2清除·OH的能力評價

羥基自由基是活性氧中對生物體危害最大、毒性最強的一種自由基，能與細胞中的分子發(fā)生反應(yīng)，對機體造成損傷，清除羥自由基的能力是評價抗氧化物的重要指標(biāo)[13-14]。由圖5-B可知，常春油麻藤花總黃酮質(zhì)量濃度在0.003 9～0.062 8 mg/mL范圍內(nèi)，隨質(zhì)量濃度增大，清除羥基自由基能力增強，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為 0.062 8 mg/mL，清除率最大為85.36%。與同質(zhì)量濃度維生素C相比，總黃酮清除羥基自由基的能力稍弱于維生素C（9414%），但常春油麻藤花總黃酮也表現(xiàn)出較強的清除羥基自由基的能力。

2.3.3清除O-2[KG-2]· [KG-3]的能力評價

超氧陰離子自由基可通過鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化產(chǎn)生，并生成一種帶有顏色的中間產(chǎn)物，該有色中間產(chǎn)物在325 nm波長處有特征吸收峰。當(dāng)加入O-2[KG-2]· [KG-3]清除劑時，O-2[KG-2]· [KG-3]的生成受到抑制，鄰苯三酚自氧化過程受阻，溶液在325 nm處吸收減弱。所以，可通過測定325 nm處吸光度推斷清除劑對O-2[KG-2]· [KG-3]的清除率[15-16]。由圖5-C可知，常春油麻藤花總黃酮質(zhì)量濃度在0.0039～0.062 8 mg/mL 范圍內(nèi)，隨質(zhì)量濃度增大，清除超氧陰離子自由基能力增強，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.0628 mg/mL，清除率最大，為70.95%。與同質(zhì)量濃度維生素C相比，總黃酮清除超氧陰離子自由基的效果與維生素C（72.51%）很接近，表明常春油麻藤花總黃酮具有很強的清除羥基自由基的能力。

3結(jié)論與討論

微波輔助提取常春油麻藤花總黃酮中，影響總黃酮提取效果的因素從強到弱依次為乙醇體積分數(shù)>料液比>微波時間>微波功率。經(jīng)過優(yōu)化后的提取工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)75%，料液比1 g ∶[KG-3]30 mL，微波時間3.5 min，微波功率200 W。在該條件下進行驗證性試驗，重復(fù)5次，得到常春油麻藤花總黃酮平均提取率為19.77%，相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD值為1.32%。該提取方法快速省時、操作簡單、重復(fù)性好，可用于常春油麻藤花中總黃酮的提取和含量測定。

該研究從DPPH·、·OH和O-2[KG-2]· [KG-3]自由基的清除能力3個方面來評價常春油麻藤花中總黃酮抗氧化性?？寡趸栽囼灲Y(jié)果表明，在常春油麻藤花總黃酮質(zhì)量濃度0.003 9～0.062 8 mg/mL范圍內(nèi)，隨質(zhì)量濃度的增大，清除DPPH·、·OH和O-2[KG-2]· [KG-3]自由基的能力增強。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為 0.062 8 mg/mL 時，對DPPH·、·OH和O-2[KG-2]· [KG-3]自由基的清除率最大分別為82.83%、85.36%和70.95%，表明常春油麻藤花總黃酮具有較強的抗氧化能力。因此，常春油麻藤花可作為一種良好的抗氧化物質(zhì)資源進行開發(fā)利用。

本研究結(jié)果表明，常春油麻藤花中富含黃酮類物質(zhì)，該黃酮類物質(zhì)具有較強的抗氧化性，是一種具有較大開發(fā)價值的藥食同源植物，相關(guān)研究結(jié)果對常春油麻藤花中黃酮類物質(zhì)的提取及抗氧化活性成分的研究具有重要意義。但常春油麻藤花中黃酮類物質(zhì)發(fā)生抗氧化作用的機理目前還不清楚，有待進一步深入研究。

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