劉文穎，周明，馮曉文，凌空，谷瑞增

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

食源性低聚肽具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、輔助調(diào)節(jié)血糖、血脂、血壓等多種生理功能。有研究證明人體內(nèi)存在小肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及相關(guān)的載體蛋白，這打破了蛋白只有被消化成為氨基酸才能被吸收利用的舊觀點(diǎn)，與蛋白質(zhì)和氨基酸相比，低聚肽具有更高的吸收效率，部分小肽可以進(jìn)入細(xì)胞或血液發(fā)揮其生理活性[1-2]。乳清蛋白是干酪生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品，含有多種活性成分，具有營養(yǎng)價(jià)值高、低脂肪、低膽固醇等特點(diǎn)。乳清蛋白經(jīng)生物酶解后得到乳清低聚肽，能夠改善其乳化性、起泡性等性能，降低或消除致敏性，更易于被人體吸收和利用[3-4]。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)，是人體血壓調(diào)節(jié)的一種關(guān)鍵限速酶。ACE抑制肽是具有ACE抑制活性的肽類物質(zhì)，一方面能夠阻止ACE催化舒緩激肽的水解，使其具有正常的收縮血管能力，另一方面還能阻止ACE催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為具有收縮血管能力的血管緊張素Ⅱ，降血壓作用顯著[5-6]。此外，與降壓藥物不同，ACE抑制肽具有安全性高、毒副作用小、可長期食用等優(yōu)點(diǎn)，因此食源性ACE抑制肽成為近年來的研究焦點(diǎn)。

目前國內(nèi)外關(guān)于乳清低聚肽的ACE抑制作用的研究相對較少，另外，乳清低聚肽作為食品原料，加工條件是否影響其穩(wěn)定性目前尚不明確。本研究以乳清蛋白粉為原料，通過酶法制備乳清低聚肽，評價(jià)乳清低聚肽的ACE抑制作用和體外穩(wěn)定性，為乳清蛋白粉的高值利用以及乳清低聚肽作為降血壓保健食品的應(yīng)用提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清蛋白粉，北京中食海氏生物技術(shù)有限公司；TSKgel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)，東曹(上海)生物科技有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶，美國Amresco公司；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子質(zhì)量189 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子質(zhì)量451 u)、桿菌酶(分子質(zhì)量1 450 u)、細(xì)胞色素C(分子質(zhì)量12 500 u)、ACE(50 mU)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu，HHL)，美國Sigma-Aldrich公司；甲醇，美國Fisher Scientific公司；三氟乙酸，阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司；卡托普利(25 mg/片)，北京曙光藥業(yè)公司。

HH-501型超級恒溫水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京陸?？萍加邢薰?；835-50型氨基酸分析儀，日本HITACHI公司；SZC-C脂肪測定儀，上海纖檢儀器有限公司；L5/11/P33馬弗爐，德國納博熱公司；AB104-N電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清低聚肽的制備工藝

稱取100 g乳清蛋白粉溶解于1 000 mL去離子水中，90 ℃水浴10 min后冷卻至55 ℃，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至8.5，以3 000 U/g蛋白質(zhì)的酶量加入堿性蛋白酶，酶解反應(yīng)3 h，酶解過程中加入NaOH溶液保證pH值穩(wěn)定。然后用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7，溫度為50 ℃，按照2 000 U/g蛋白質(zhì)的酶量加入中性蛋白酶，酶解反應(yīng)2 h。酶解結(jié)束后，沸水浴滅酶15 min。冷卻至室溫后，用離心機(jī)10 000×g離心20 min，取上清液用截留分子質(zhì)量為1 000 u的超濾膜超濾，進(jìn)行冷凍干燥，即得到乳清低聚肽粉。

1.2.2 基礎(chǔ)理化成分測定

總蛋白質(zhì)：GB 5009.5—2016；酸溶蛋白：GB/T22729—2008；水分：GB 5009.3—2016；灰分：GB 5009.4—2016；脂肪：GB 5009.6—2016[7-11]。

1.2.3 氨基酸組成測定

參照GB 5009.124—2016規(guī)定的方法對乳清低聚肽的氨基酸組成進(jìn)行分析[12]。

1.2.4 分子質(zhì)量分布測定

通過反相高效液相色譜法(RP-HPLC)進(jìn)行分子質(zhì)量分布分析。色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相為V(乙腈)∶V(水)=45∶55(含0.1%三氟乙酸)；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；檢測波長220 nm；柱溫30 ℃。用流動相將樣品質(zhì)量濃度配制為1.0 mg/mL，經(jīng)孔徑0.2 μm聚四氟乙烯濾膜過濾后，進(jìn)行凝膠過濾，用GPC軟件處理色譜數(shù)據(jù)。同時(shí)制作相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線：以細(xì)胞色素C(分子質(zhì)量12 500 u)、桿菌酶(分子質(zhì)量1 450 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子質(zhì)量451 u)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子質(zhì)量189 u)為標(biāo)準(zhǔn)品溶液[13]。

1.2.5 ACE抑制活性測定

利用RP-HPLC測定乳清低聚肽的ACE抑制率[14-15]。配制0.05 mol/L的硼酸緩沖液(含0.3 mol/L NaCl，pH 8.3)，利用緩沖液配制7.6 mmol/L的HHL溶液和50 mU/mL的ACE溶液。將樣品溶液20 μL與ACE溶液30 μL混合，37 ℃預(yù)熱5 min。加入HHL溶液50 μL，37 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，立即加入1 mol/L的HCl溶液100 μL終止反應(yīng)，加入硼酸緩沖液至體積為400 μL，上機(jī)進(jìn)行RP-HPLC檢測。色譜條件：流動相A，V(水)∶V(甲醇)=70∶30(含0.1%三氟乙酸和0.05%乙酸)；流動相B，V(水)∶V(甲醇)=20∶80(含0.1%三氟乙酸和0.05%乙酸)；梯度洗脫條件：0～2.50 min，0%～0%流動相B；2.51～4.50 min，100%～100%流動相B；4.51～15 min，0%～0%流動相B；進(jìn)樣體積100 μL；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長227 nm。ACE抑制率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：M為空白對照組中馬尿酸的峰面積(mAU·s)；N為添加樣品組中馬尿酸的峰面積(mAU·s)。

1.2.6 酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

用去離子水配制2 mg/mL的乳清低聚肽溶液，置于離心管中，分別用1 mol/L HCl和 1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為2、4、6、8、10，37 ℃水浴鍋中放置2 h，冷卻至室溫后分別測定其ACE抑制活性和分子質(zhì)量分布[16-17]。

1.2.7 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

用去離子水配制2 mg/mL的乳清低聚肽溶液，置于離心管中，放入水浴鍋中，分別于30、40、60、80、100 ℃下水浴中保溫2 h，冷卻至室溫，分別測定其ACE抑制活性和分子質(zhì)量分布[16-17]。

1.2.8 體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 胃蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)

用去離子水配制2 mg/mL的乳清低聚肽溶液，置于離心管中，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為2，在37 ℃水浴條件下預(yù)熱5 min，加入3%(E/S)胃蛋白酶，混勻后在37 ℃水浴條件下消化3 h，立即沸水浴滅酶10 min，冷卻后分別測定其ACE抑制活性和分子質(zhì)量分布[16-17]。

1.2.8.2 胰蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)

用去離子水配制2 mg/mL的乳清低聚肽溶液，置于離心管中，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8，在37 ℃水浴條件下預(yù)熱5 min，加入3%(E/S)胰蛋白酶，混勻后在37 ℃水浴條件下消化3 h，立即沸水浴滅酶10 min，冷卻后分別測定其ACE抑制活性和分子質(zhì)量分布[16-17]。

1.2.8.3 胃蛋白酶消化后再胰蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)

按照1.2.8.1的方法進(jìn)行胃蛋白酶消化后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8，在37 ℃水浴條件下預(yù)熱5 min，加入3%(E/S)胰蛋白酶，混勻后在37 ℃水浴條件下消化3 h，立即沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫后分別測定其ACE抑制活性和分子質(zhì)量分布[16-17]。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)的所有定量數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

乳清低聚肽的總蛋白質(zhì)含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為(71.83±0.37)%，其中酸溶蛋白含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為(61.71±2.42)%，占總蛋白含量的85.9%。研究表明，可溶于酸性溶液的主要是小分子肽類物質(zhì)及氨基酸，分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)遇酸會產(chǎn)生沉淀[18]，這說明乳清低聚肽的主要成分是小分子肽類物質(zhì)和氨基酸。其余成分中，水分含量(4.86±0.23)%，灰分含量(5.23±0.10)%，脂肪含量(0.21±0.05)%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))(表1)。

表1 乳清低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

2.2 乳清低聚肽的氨基酸組成

乳清低聚肽的氨基酸組成較為完善，谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和脯氨酸含量比較豐富。此外，必需氨基酸含量也很豐富，高達(dá)46.47%(表2)。豐富的氨基酸組成能夠?qū)θ梭w起到重要的調(diào)節(jié)生理機(jī)能的作用，例如谷氨酸是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，能夠維持中樞神經(jīng)細(xì)胞信號傳導(dǎo)，參與腦內(nèi)蛋白質(zhì)和糖的代謝[19]；亮氨酸是一種支鏈氨基酸，與異亮氨酸和纈氨酸一起能夠修復(fù)肌肉、控制血糖，并給身體組織提供能量[20]。肽的生理功能與氨基酸的種類和數(shù)量有一定關(guān)系，梁婷婷等[21]對植物蛋白、紅肉蛋白和白肉蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸組成和ACE抑制活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，疏水性氨基酸含量越高，ACE抑制活性越高。本研究中乳清蛋白低聚肽中疏水性氨基酸含量較多，因此具有潛在的ACE抑制活性。

表2 乳清低聚肽的氨基酸組成

2.3 乳清低聚肽的ACE抑制作用

乳清低聚肽的ACE抑制活性如圖1-A所示，從圖1-A中可見，其ACE抑制率呈一定的量效關(guān)系，質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到了90%，半抑制濃度(IC50)值約為1.0 mg/mL，表明乳清低聚肽具有較強(qiáng)的ACE抑制活性。陽性對照降壓藥卡托普利的ACE抑制率IC50值為0.07 mg/mL，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到了90%(圖1-B)。HANAFI等[22]通過不同蛋白酶水解得到綠豆水解物，ACE抑制率IC50值為0.13～3.16 mg/mL，BOUGATEF等[23]考察了沙丁魚蛋白水解物的ACE抑制作用，其IC50值為1.2 mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)乳清低聚肽的ACE抑制能力相接近。與卡托普利相比，乳清低聚肽ACE抑制活性較弱，但是長期服用降壓藥物卡托普利有一定的毒副作用，而乳清低聚肽來源于天然食物，安全性高，可長期食用。研究表明，肽的ACE抑制作用與其肽鏈長度有關(guān)，具有ACE抑制作用的肽段往往分子質(zhì)量較低[24-25]。乳清低聚肽中85%以上的肽段在1 000 u以下，以二肽、三肽為主，能夠保持較好的ACE抑制作用。

A-乳清低聚肽的ACE抑制能力：B-卡托普利的ACE抑制能力

2.4 乳清低聚肽的酸堿穩(wěn)定性

低聚肽的穩(wěn)定性是決定其能否投入生產(chǎn)應(yīng)用以及有效作用的重要影響因素。乳清低聚肽經(jīng)過不同的酸堿處理后，ACE抑制活性如圖2所示。在pH 2～10，質(zhì)量濃度1 mg/mL的乳清低聚肽ACE抑制率在48.26%～50.91%小范圍波動。堿性條件下，肽可能發(fā)生消旋作用，引起肽鏈的構(gòu)象發(fā)生變化[26]，從而使得活性稍有下降，但活性變化并不顯著(P>0. 05)，說明乳清低聚肽的ACE抑制活性在酸性和堿性條件下都能保持良好的穩(wěn)定性。分子質(zhì)量分布結(jié)果如圖3和表3所示。在pH 2～10，乳清低聚肽的分子排阻色譜圖變化不大，分子質(zhì)量在1 000 u以下的總含量在93.57%～94.78%波動，各分子質(zhì)量區(qū)間的比例變化不超過2%。由此看出，乳清低聚肽具有較強(qiáng)的酸堿穩(wěn)定性，小肽尤其是ACE抑制肽受酸堿的影響很小，這也進(jìn)一步解釋了乳清低聚肽經(jīng)酸堿處理后ACE抑制活性得以保持穩(wěn)定的原因。周劍敏等[27]對高粱堿溶蛋白ACE抑制肽在pH 2～10的酸堿穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果也表明高粱堿溶蛋白ACE抑制肽在酸性和堿性條件下都能夠保持良好的穩(wěn)定性。

圖2 不同pH值下乳清低聚肽的ACE抑制率

圖3 不同pH值下乳清低聚肽的分子排阻色譜圖

表3 不同pH值下乳清低聚肽的分子質(zhì)量分布

2.5 乳清低聚肽的熱穩(wěn)定性

乳清低聚肽經(jīng)過不同的溫度處理后，ACE抑制活性如圖4所示。溫度30～100 ℃時(shí)，質(zhì)量濃度1 mg/mL的乳清低聚肽的ACE抑制率在48.67%～51.29%波動，說明乳清低聚肽的ACE抑制活性受溫度影響不顯著(P>0. 05)，ACE抑制肽在一定溫度范圍內(nèi)具有良好的熱穩(wěn)定性。分子質(zhì)量分布結(jié)果如圖5和表4所示。在30～80 ℃，乳清低聚肽的分子排阻色譜圖變化不大，分子質(zhì)量在1 000 u以下的總含量在93.75%～94.51%波動，各分子質(zhì)量區(qū)間的比例變化不超過4%。在100 ℃處理后，150～1 000 u的組分所占比例略有降低，小于150 u的組分所占比例略有升高，說明高溫處理會使得部分肽段發(fā)生降解，但比例變化與其他溫度處理下相比不超過4%。這表明，在加工過程中，溫度的變化對乳清低聚肽的影響很小。鄭婷婷等[28]考察了草魚魚鰾膠原肽的熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明魚鰾膠原肽具有很好的耐熱性，在溫度較高的條件下，仍然能保持較高的生物活性，與本研究結(jié)果一致。熱處理是食品加工過程中常用的手段之一，在高溫處理后，乳清低聚肽仍然具有很高的ACE抑制活性，這說明乳清低聚肽可作為一種具有商業(yè)潛力的產(chǎn)品。

圖4 不同溫度條件下乳清低聚肽的ACE抑制率

圖5 不同溫度條件下乳清低聚肽的分子排阻色譜圖

表4 不同溫度下乳清低聚肽分子質(zhì)量分布

2.6 乳清低聚肽的體外消化穩(wěn)定性

乳清低聚肽經(jīng)過不同的消化酶處理后，ACE抑制活性如圖6所示。相對于未消化的乳清低聚肽而言，分別經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后，質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)，乳清低聚肽的抑制率基本無變化。先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后，乳清低聚肽的抑制率稍有下降，與未消化組相比，變化不超過4%。這說明乳清低聚肽的ACE抑制活性受消化酶影響不顯著(P>0.05)，ACE抑制肽具有良好的體外消化穩(wěn)定性。經(jīng)過不同的消化模式，乳清低聚肽的分子質(zhì)量分布結(jié)果如圖7和表5所示。與未消化組相比，經(jīng)過不同蛋白酶處理后，乳清低聚肽中分子質(zhì)量在150～1 000 u的組分所占比例略有降低，小于150 u的總含量略有升高，但升高不到2%。這表明分子質(zhì)量相對較大的肽段經(jīng)過消化后分解成小分子質(zhì)量的肽段或氨基酸，但總體來說乳清低聚肽具有較好的耐消化性，胃腸道蛋白酶對其影響很小。羅鵬等[29]和RUIZ等[30]分別研究了葵花籽ACE抑制肽和曼徹格奶酪ACE抑制肽在模擬胃液和腸液中的穩(wěn)定性，與本研究一致，經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶消化作用后，2種ACE抑制肽仍然能保持一定的消化穩(wěn)定性。

圖6 不同消化方式下乳清低聚肽的ACE抑制率

圖7 不同消化方式下乳清低聚肽的分子排阻色譜圖

表5 不同消化方式下乳清低聚肽分子質(zhì)量分布

3 結(jié)論

本研究以乳清蛋白粉為原料，通過酶解法制得乳清低聚肽，對其基礎(chǔ)理化成分、氨基酸組成、ACE抑制活性和體外穩(wěn)定性進(jìn)行了探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳清低聚肽的總蛋白質(zhì)含量為(71.83±0.37)%，酸溶蛋白含量高達(dá)(61.71±2.42)%，水分含量為(4.86±0.23)%，灰分含量為(5.23±0.10)%，脂肪含量為(0.21±0.05)%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。含有豐富的谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸等，必需氨基酸含量為46.47%。

乳清低聚肽具有良好的酸堿穩(wěn)定性，經(jīng)過不同的pH處理后，ACE抑制率在48.26%～50.91%波動，分子質(zhì)量在1 000 u以下的總含量在93.57%～94.78%波動，具有良好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過不同溫度處理后，ACE抑制率在48.67%～51.29%波動，分子質(zhì)量在1 000 u以下的總含量在93.75%～94.51%波動。對于不同消化方式也具有一定的穩(wěn)定性，ACE抑制率在47.63%～50.93%波動，分子質(zhì)量在150～1 000 u的組分所占比例略有降低，小于150 u的總含量略有升高，但升高不到2%。這表明加工過程中的溫度和pH的變化對乳清低聚肽自身的組分以及ACE抑制活性的影響很小。乳清低聚肽也基本上不受腸胃環(huán)境的影響，能發(fā)揮應(yīng)有的生理功能。本研究證實(shí)了乳清低聚肽的ACE抑制作用和體外穩(wěn)定性，為其在天然功能性保健食品中的應(yīng)用提供了思路和理論支持。后續(xù)將對乳清低聚肽進(jìn)行分離純化，深入研究乳清低聚肽中ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系。