程清，徐艷，鄧心悅，陳國飛(蘇州市中西醫(yī)結合醫(yī)院檢驗科，蘇州215000)

慢性阻塞性肺病(COPD)是慢性氣道炎癥導致的慢性氣道阻塞性肺疾病的統(tǒng)稱，可并發(fā)肺動脈高壓，嚴重者可導致肺源性心臟病。研究表明，多數(shù)肺心病患者是由COPD導致的[1]。COPD發(fā)病機制復雜，炎性介質、炎性細胞、固有免疫等因素與疾病的發(fā)展關系密切[2]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)作為應激蛋白激酶，是細胞中重要的信號傳遞者，參與了應激和炎癥反應的調控[3]。核苷酸結合寡聚化結構域2(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing family receptors 1,NOD2)在機體固有免疫中發(fā)揮重要作用，有學者指出，NOD2可激活核因子κB(NF-κB)，進而啟動炎性反應進程[4]。Rho激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK)與血管重構、血管內皮增生關系密切，其參與了肺動脈高壓、肺心病等過程[5]。因此，通過對COPD患者外周血單個核細胞p38MAPK、NOD2及ROCK1表達水平的檢測，可了解相關COPD發(fā)展機制，阻斷或抑制有關炎性因子和炎癥細胞活化的關鍵靶點，進而阻斷COPD的進展，可能為COPD的治療提供新思路。本研究對COPD患者外周血單個核細胞p38MAPK、NOD2及ROCK1的表達水平進行了分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2017年10月至2019年10月收治的急性發(fā)作期COPD患者(AECOPD)60例作為AECOPD組，男35例，女25例，年齡(68.7±3.9)歲；60例COPD穩(wěn)定期患者作為COPD組，男37例，女23例，年齡(67.5±4.3)歲；納入標準：(1)均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版》的診斷標準[6]，并經臨床及影像學檢查確診；(2)能夠配合完成肺功能檢查；(3)均自愿參與本研究并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并支氣管擴張、肺纖維化、支氣管哮喘等肺部疾病者；(2)肝、腎、心等臟器功能障礙者；(3)近期接受糖皮質激素等藥物治療者；(4)合并血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤患者。根據(jù)肺功能分級將COPD穩(wěn)定期患者分為低危組(肺功能分級為Ⅰ～Ⅱ級，n=36)和高危組(肺功能分級為Ⅲ～Ⅳ級，n=24)，低危組中男22例，女14例，年齡(67.4±4.4)歲；高危組中男15例，女9例，年齡(67.7±4.1)歲；另選擇體檢健康者60例作為健康人對照組，男34例，女26例，年齡(68.1±4.5)歲，均肺功能正常，無呼吸系統(tǒng)疾病。各組研究對象性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.333，P=0.954；F=1.334，P=0.185)，具有可比性。

1.2主要儀器及試劑 Min-Proten Tetra System電泳儀、熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，MasterScreen肺功能儀(德國耶格公司)，Benchmark酶聯(lián)儀(德國Benchmark公司)，CytoFLEX流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-18、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、C反應蛋白(CRP)試劑盒(美國D&G公司)，RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，p38MAR、NOD2、GAPD引物序列(上海生工公司)，人淋巴細胞分離液(美國Sigma公司)，磷酸緩沖液(美國Gibco公司)。

1.3肺動脈平均壓及肺功能測定 所有研究對象均于呼吸內科行肺動脈平均壓和肺功能測定，肺功能測定采用MasterScreen肺功能儀測定第1秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1 占預計值百分比(FEV1%)及用力肺活量(FVC)指標。

1.4血清炎癥因子測定 所有研究對象均清晨抽取空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min分離血清，置于-80 ℃保存，并于當日完成各項檢測。采用ELISA法測定IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α、CRP的表達水平。采用Benchmark酶聯(lián)儀于450 nm波長下測定吸光度(A)值，以上均嚴格依照儀器及試劑盒說明書操作。

1.5外周血單個核細胞(PBMC)分離 另取各研究對象的空腹靜脈血5 mL，EDTA-K2抗凝，加入5 mL PBS稀釋，室溫下將4 mL淋巴細胞分離液和10 mL稀釋后的空腹靜脈血加入至15 mL離心管中，2 000 r/min離心20 min。小心吸取第2層單個核細胞，并轉移至10 mL離心管中，PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，棄上清。PBS重復洗滌1次，取沉淀的單個核細胞，經0.4%臺盼藍染色，收集外周單個核細胞(活細胞>90%)用于后續(xù)實驗。

1.6熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測p38MAPK、NOD2mRNA的表達 采用Trizol試劑提取上述各組單個核細胞的總RNA，取吸光度(A260/280 nm)比值在1.8～2.0的樣本，置于-80 ℃保存。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書操作將RNA逆轉錄為cDNA，置于-20 ℃保存。參照文獻[7-8]，根據(jù)GenBank中p38MAPK、NOD2基因的序列號(NM-001315、NM-022162)，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并送上海生工公司合成。其中p38MAPK上游引物序列：5′-AAGTTCCTGTCCACATT

GCC-3′，下游引物序列5′-TGGATTCAGTGTCAAGCT

GC-3′；NOD2上游引物序列5′-CACCCTGACCGTGT

CCTGT-3′，下游引物序列5′-CACCTTGCGGGCATTC

TT-3′；GAPDH上游引物序列5′-TCAACAGCGACAC

CCACTCC-3′，下游引物序列5′-TGAGGTCCACCACC

CTGTTG-3′。PCR總反應體系為25 μL，包括：10 μmol/L上、下游引物各1 μL，dNTPs 4 μL，10×PCR buffer 1 μL，模板DNA 2 μL，無菌ddH2O補足體積至25 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。采用熒光定量PCR儀配套的CFX96系統(tǒng)軟件于55～95 ℃時收集熒光，并進行熔解曲線分析。結果以2-△△Ct法計算。

1.7流式細胞術檢測單個核細胞中ROCK1的表達 取上述分離的單個核細胞，PBS洗滌2次，加入500 μL PBS重懸，加入10 μL FITC-ROCK1或同型對照，室溫溫育30 min，使用CytoFLEX流式細胞儀檢測10 000個單個核細胞，并采用配套的數(shù)據(jù)獲取和分析軟件CytExpert計算ROCK1的表達水平。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均值±標準差表示， 3組及以上數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；各指標相關性分析采用Pearson檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組肺動脈平均壓和肺功能比較結果 AECOPD組肺動脈平均壓顯著高于低危組、高危組和健康人對照組，而FEV1、FEV1%及FVC顯著低于低危組、高危組和健康人對照組(P均<0.05)。隨著COPD患者病情程度加重，低危組、高危組、AECOPD組患者肺動脈高壓逐漸升高，而FEV1、FEV1%及FVC逐漸降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1各組肺動脈平均壓和肺功能比較

2.2各組血清炎癥因子水平比較 AECOPD組血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP均顯著高于高危組、低危組和健康人對照組，且隨著COPD患者病情加重，血清中各炎癥因子的表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2各組血清炎癥因子表達水平比較

2.3各組外周血單個核細胞p38MAPK、NOD2mRNA及ROCK1的表達水平比較 RT-PCR檢測p38MAPK、NOD2mRNA及流式細胞術檢測單個核細胞中ROCK1的表達結果表明，與健康人對照組比較，低危組、高危組及AECOPD組p38MAPK、NOD2mRNA及ROCK1的表達水平均顯著升高(P均<0.05)。見表3。

表3各組外周血單個核細胞p38MAPK、NOD2 mRNA及ROCK1的表達比較

2.4急性發(fā)作期COPD患者p38MAPK、NOD2mRNA及ROCK1表達與各指標的相關性分析 Peasson相關性分析結果顯示，急性期COPD患者p38MAPK、NOD2mRNA及ROCK1的表達水平與FEV1、FEV1%、FVC呈負相關，而與肺動脈平均壓、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP呈正相關(P<0.05)。見表4。

3 討論

本研究結果顯示，COPD患者自低危組、高危組至AECOPD組病情逐漸加重，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP水平均明顯升高，提示患者機體處于慢性炎癥進展狀態(tài)，并隨著病情加重，患者肺功能平均壓逐漸升高，肺功能明顯降低。IL-1β可激活巨噬細胞等炎癥細胞促進炎癥介質釋放，造成肺部粒細胞、巨噬細胞炎癥浸潤。CRP作為經典炎癥標志物，可反應COPD患者機體炎癥反應、組織損傷程度，在COPD炎性反應擴大過程中發(fā)揮重要作用。IL-6、IL-8均可加重氣道炎癥反應。IL-17可調節(jié)肺巨噬細胞、氣道中性粒細胞激活和趨化，在COPD發(fā)病與發(fā)展過程中具有重要作用[9]。以上研究表明，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP均可作為COPD疾病相關的炎癥指示因子。

表4p38MAPK、NOD2 mRNA及ROCK1表達與各指標的相關性分析

本研究還發(fā)現(xiàn)，在COPD患者中p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1的表達水平均顯著升高，且在AECOPD患者中的表達水平更高。提示p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1表達與COPD疾病進展存在密切關系。有學者指出，p38MAPK在COPD患者尤其是急性期患者的肺泡巨噬細胞中的表達水平明顯升高，p38MAPK反映了COPD肺部慢性炎癥發(fā)展水平，并可作為COPD治療的潛在新靶點[10]。另有研究證實，p38MAPK抑制劑可減少IL-8、TNF-α等炎癥介質的釋放[11]。因此，p38MAPK為炎癥因子釋放和炎性細胞活化的重要靶點，在COPD發(fā)展的炎癥機制中具有重要作用。有學者還發(fā)現(xiàn)，COPD患者受感染、吸煙等刺激可導致NOD2的表達水平升高，引發(fā)炎性反應，從而導致病情加重[12]。NOD2可通過NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路產生IL-6、IL-1β等炎癥因子，造成COPD病情不穩(wěn)或急性發(fā)作。本研究中，急性期COPD患者p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1與肺功能指標呈負相關，與肺動脈平均壓、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP呈正相關，提示p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1參與了COPD患者急性進展過程，并影響了患者肺動脈壓和肺功能。因此，p38MAPK、NOD2、ROCK信號通路可能參與了COPD氣道重塑、慢性炎癥反應、局部缺氧損傷等多個病理、生理過程。COPD患者慢性炎癥導致間質慢性炎性細胞浸潤，進而導致p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1的表達水平升高。但本研究納入的樣本量較小，導致結果可能存在一定程度的偏差；此外，本研究并未深入探究p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1影響COPD患者炎癥進展的具體分子機制，需進一步擴大研究對象并深入分析。綜上所述，p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1參與了COPD患者炎癥進展，并與患者肺功能高壓、肺功能等病情嚴重程度存在密切關系。