何羽童，黃晨軍，王穎，高春芳(上海東方肝膽外科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海200438)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病率和致死率至今仍居高不下[1]。微血管侵犯(microvascular invasion，MVI)是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)及不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，Beppu等[2]報(bào)道HCC患者肝切除術(shù)后有無MVI對(duì)于預(yù)測(cè)2年內(nèi)早期復(fù)發(fā)或早期死亡具有重要的意義。因此，術(shù)前對(duì)MVI作出準(zhǔn)確預(yù)測(cè)可對(duì)選擇治療方案、改善術(shù)后生存產(chǎn)生重要的影響。目前臨床上診斷MVI時(shí)，將全部組織切片內(nèi)的MVI進(jìn)行計(jì)數(shù)，并根據(jù)MVI的數(shù)量和分布情況進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)，主要分為以下3類：M0：未發(fā)現(xiàn) MVI；M1(低危組)：≤5個(gè)MVI，且發(fā)生于近癌旁組織區(qū)域(≤1 cm)；M2(高危組)：>5 個(gè) MVI，或 MVI 發(fā)生于遠(yuǎn)癌旁肝組織區(qū)域(>1 cm)[3]。本研究旨在基于HBV相關(guān)性 HCC患者的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過建立Logistic回歸模型，預(yù)測(cè)HCC患者發(fā)生MVI風(fēng)險(xiǎn)，以期對(duì)臨床治療有所助益。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 回顧性分析2015年1月至12月東方肝膽外科醫(yī)院連續(xù)性行手術(shù)切除治療，乙肝表面抗原(HBsAg)陽性且病理組織學(xué)證實(shí)為HCC的患者1 628例，其中男1 412例，女216例。根據(jù)MVI病理診斷情況分為M0組(共682例，男583例，女99例)、M1組(共455例，男398例，女57例)和M2組(共491例，男431例，女60例)。3組研究對(duì)象年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者血清HBsAg持續(xù)陽性6個(gè)月以上或血清HBV DNA >104IU/mL；(2)所有患者均接受根治性肝癌切除術(shù)，即腫瘤切緣顯微鏡下無腫瘤細(xì)胞殘留；(3)術(shù)前接受完整的實(shí)驗(yàn)室檢查，且臨床和病理資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)排除丙型肝炎等其他肝炎病毒感染；(2)排除術(shù)前接受其他抗腫瘤治療，且發(fā)生大血管侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(3)排除既往其他腫瘤史。本研究經(jīng)上海東方肝膽外科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：EHBHKY2018-1-009)，各研究對(duì)象知情同意。

1.2標(biāo)本采集 所有的肝切除標(biāo)本切成連續(xù)的 2～3 mm厚的薄片,10%甲醛固定，以便進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。主要檢測(cè)項(xiàng)目包括：腫瘤最大徑、腫瘤數(shù)目、MVI、包膜形成與組織學(xué)分級(jí)。

1.3試劑、儀器 XE2100全自動(dòng)血液分析儀及血小板 (platelet,PLT)配套試劑、CA7000全自動(dòng)血凝分析儀及其凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)配套試劑(日本希森美康株式會(huì)社)，C702全自動(dòng)生化分析儀及其血清總膽紅素(total bilirubin,T-Bil)、清蛋白(albumin,Alb)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)配套試劑,Cobas e601全自動(dòng)免疫分析儀及其甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)、HBsAg、乙肝e抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)配套試劑(德國羅氏公司)，甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)分離試劑(北京熱景生物技術(shù)公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀及其乙肝病毒載量(HBV DNA)配套試劑(上?？迫A生物技術(shù)公司)。

1.4方法 PLT采用電阻抗法檢測(cè)，參考范圍為(125～350)×109/L；PT采用凝固法檢測(cè)，參考范圍為10～13 s；T-Bil采用重氮法檢測(cè)，參考范圍為≤23 μmol/L；Alb采用比色法檢測(cè),參考范圍為40～55 g/L；ALT采用IFCC推薦方法檢測(cè)，參考范圍為9～50 U/L；AST采用比色法檢測(cè)，參考范圍為15～40 U/L；甲胎蛋白采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，參考范圍為<20 ng/mL；HBsAg采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，參考范圍為<1 COI；乙肝e抗原采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，參考范圍為<1 COI；AFP-L3采用手工親和吸附分離法和電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，參考范圍為<10%；HBV DNA采用磁珠/PCR-熒光探針法檢測(cè)，參考范圍為<50 IU/mL。以上均嚴(yán)格按照儀器及試劑說明書操作及結(jié)果判讀。

2 結(jié)果

2.1各組患者的臨床病理資料及臨床指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 M0組、M1組、M2組間年齡、性別、PT、T-Bil、HBV DNA差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而PLT、Alb、ALT、AST、AFP、AFP-L3、HBeAg差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步行組間兩兩比較結(jié)果表明，與M0組相比，M1組的AFP、AFP-L3、HBeAg陽性率水平升高(P<0.05)；與M0組相比，M2組的PLT、ALB、ALT、AST、AFP、AFP-L3、HBeAg陽性率水平升高(P<0.05)；與M1組相比，M2組的AFP、AFP-L3水平升高(P<0.05)，且M1組與M2組間PLT、ALT、AST的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組患者的臨床病理資料見表1。

表1各研究對(duì)象的臨床病理資料

2.2肝癌MVI的危險(xiǎn)因素及建立的預(yù)測(cè)模型 以M0為無MVI對(duì)照組，以M1和M2合并為MVI組，進(jìn)行單因素二元Logistic回歸分析，篩選出有意義的指標(biāo)(P<0.05)后，再進(jìn)行多因素Logistic回歸分析并建模。分析得到有臨床意義的參數(shù)包括： PLT(OR=1.003)，PT(OR=1.122)，lgAFP(OR=1.240)，AFP-L3(OR=1.020)，HBeAg (OR=1.520)。建立多因素Logistic回歸模型：Logistic(P)=-1.485+0.418×HBeAg+0.215×lgAFP+0.115×PT+0.020×AFP-L3+0.003×PLT。結(jié)果證實(shí)HBeAg、AFP、AFP-L3、PT、PLT是肝癌MVI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

表2單因素與多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.3Logistic(P)模型對(duì)HCC發(fā)生MVI預(yù)測(cè)效率分析 根據(jù)Youden指數(shù)最大原則，取1.000 1為cut-off值，該模型鑒別無MVI(M0)與有 MVI(M1+2)、M0與低危MVI(M1)、M0與高危MVI (M2)、低危MVI(M1)與 高危MVI(M2)的結(jié)果見表3、圖1。

表3Logistic(P)模型對(duì)HCC發(fā)生MVI預(yù)測(cè)效率分析結(jié)果

3 討論

目前，術(shù)后組織病理學(xué)檢查是我國MVI 確診的金標(biāo)準(zhǔn)， CT和MRI圖像分析是臨床術(shù)前預(yù)測(cè)MVI的常見方法，但由于受醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)影響、不適合大樣本處理以及沒有統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)等弊端的影響，單一影像學(xué)預(yù)測(cè)方法難以保證預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性[4]。

Wei等[5]報(bào)道HBV病毒的持續(xù)存在狀態(tài)是導(dǎo)致HCC患者發(fā)生血管浸潤的潛在因素，故而本次研究對(duì)象為HBV相關(guān)性HCC患者，以期得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，AFP與AFP-L3水平均為M0組0.05)，這與Wei等[5]報(bào)道的MVI高危組的HBeAg陽性率更高的結(jié)論相符合；本研究還發(fā)現(xiàn)，HBeAg、AFP、AFP-L3、PT、PLT是HBV相關(guān)性HCC發(fā)生MVI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與Liu等[6]與Lei等[7]的報(bào)道相符合；此外，曲超等[8]與Yu等[9]的研究也證實(shí)了MVI與HBsAg陽性、AFP、腫瘤標(biāo)志物、肝功能指標(biāo)、血小板計(jì)數(shù)、清蛋白等有關(guān)；AFP-L3被國家衛(wèi)生健康委員會(huì)推薦作為HCC診斷的特異性指標(biāo)[10]，本實(shí)驗(yàn)室通過前期研究結(jié)果也證實(shí)AFP-L3與MVI有關(guān)。

本研究所得模型Logistic(P)=-1.485+0.418×HBeAg+0.215×lgAFP+ 0.115×PT+0.020×AFP-L3+0.003×PLT對(duì)于鑒別M0與高危MVI (M2)具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，但是在鑒別是否發(fā)生MVI(M0 vs M1+2)、M0與低危MVI(M0 vs M1)以及區(qū)分MVI嚴(yán)重程度(M1 vs M2)時(shí)的預(yù)測(cè)價(jià)值較為一般。胡月雷等[11]建立的肝細(xì)胞癌MVI的危險(xiǎn)評(píng)分術(shù)前預(yù)測(cè)模型，納入病例數(shù)與臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)均較少。梁志銀等[12]建立的列線圖預(yù)測(cè)模型納入項(xiàng)目較為全面，列線圖預(yù)測(cè)值和觀察值符合度良好，但該模型預(yù)測(cè)效能偏低。而童林等[13]驗(yàn)證了Johnson等[14]建立的GALAD模型預(yù)測(cè)高危組 MVI(M2)(M0 vs M2)的AUCROC(95%CI)為0.717(0.701～0.733)，其認(rèn)為該模型對(duì)于是否發(fā)生MVI(M0 vs M1+2)、M0與低危MVI(M0 vs M1)以及區(qū)分MVI嚴(yán)重程度(M1 vs M2)時(shí)預(yù)測(cè)價(jià)值較為一般，亦與本模型結(jié)果符合。Lei等[7]分別用列線圖和nomogram建立了MVI預(yù)測(cè)模型，列線圖預(yù)測(cè)值和觀察值符合度良好，但預(yù)測(cè)效能偏低，nomogram預(yù)測(cè)效能優(yōu)于列線圖，并且除了納入臨床檢驗(yàn)指標(biāo)、Child-Pugh分級(jí)、BCLC分級(jí)等之外，還納入了患者肝切除后的總生存期和復(fù)發(fā)時(shí)間，結(jié)果較為可靠。

本研究存在以下不足之處，如有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，AFP、AFP-L3%和PIVKA-Ⅱ三聯(lián)檢測(cè)是對(duì)早期HCC的重要檢測(cè)手段[15]，在檢測(cè)HBV相關(guān)性HCC時(shí)，PIVKA-Ⅱ?qū)τ贏FP具有補(bǔ)充作用[16]。而本研究由于東方肝膽外科醫(yī)院開展PIVKA-Ⅱ檢測(cè)時(shí)間較晚，并未納入此次研究。此外，本次研究僅納入上海地區(qū)的患者，不能消除地域差異存在的影響。在未來?xiàng)l件允許的情況下，納入多中心的臨床常用檢驗(yàn)指標(biāo)及肝癌發(fā)生相關(guān)指標(biāo)，有助于提高預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性，從而為臨床提供非創(chuàng)性MVI預(yù)測(cè)，協(xié)助臨床治療決策和預(yù)后判斷。