王彥云，孫云，張志蕾，程威，蔣濤(南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院&南京市婦幼保健院新生兒篩查中心，南京 210004)

甲基丙二酸血癥(methylmalonic aciduria)是我國最常見的有機酸尿癥，發(fā)病年齡各異，臨床表現(xiàn)復雜多樣，且缺乏特異性，易漏診或誤診，死亡率和致殘率很高，故而早診斷、早治療顯得尤為重要，目前已被列入歐美國家的首要篩查病種。二階篩查(second-tier test)理論的提出將新生兒遺傳代謝病篩查的模式從“初次篩查+召回復查”進化為“初次篩查-二階篩查”。2014年，由來自美國和12個歐洲國家的25位專家共同制定了甲基丙二酸血癥診療指南[1]，明確指出串聯(lián)質譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)檢測丙?；鈮A(propionylcarnitine，C3)等相關指標均缺乏疾病特異性，推薦對于MS/MS初次篩查陽性的樣本采用高效液相色譜質譜-串聯(lián)質譜聯(lián)合檢測(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術進行二階篩查。2016年底，我中心正式將LC-MS/MS技術應用于二階篩查，可以一次實驗同時定量檢測干血斑中甲基丙二酸(methylmalonic acid，MMA)和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的濃度，雖然LC-MS/MS檢測有規(guī)范化的流程可參考[2-3]，但是其檢測結果的cut-off值尚未規(guī)范統(tǒng)一，目前許多實驗室、科研機構使用的cut-off值為梅奧診所提供[3]。然而，不同實驗室的實際外部條件存在一定的差異，且不同種族、不同地域人群的各種代謝物水平之間亦存在差異。因此，每個實驗室在新技術推廣前，應根據(jù)其各自的檢測條件建立相應的cut-off值。本研究通過前期的數(shù)據(jù)積累，采用ROC曲線確定了本實驗室使用LC-MS/MS技術檢測干血斑中MMA和Hcy的cut-off值，以期為各家篩查實驗室提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標本 收集2016年1月至2018年8月在我院進行MS/MS篩查的丙酰基肉堿(propionylcarnitine，C3)、乙?；鈮A(acetylcarnitine，C2)和游離肉堿(free carnitine，C0)3個指標中有1個及以上指標偏高的新生兒初篩干血斑樣本1 015例。另收集同期確診為甲基丙二酸合并同型半胱氨酸血癥的新生兒初篩干血斑樣本16例。本研究通過南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(寧婦倫字[2016]107號)，所有研究對象均知情同意。

1.2主要儀器與試劑 MS/MS檢測系統(tǒng)(美國沃特世公司),Agilent 7890A-5975C GC/MS聯(lián)用儀(美國安捷倫公司),20ADXR高效液相色譜儀(日本島津公司),phenomenex Kinetex 2.6μ XB-C18 100A色譜柱(美國菲羅門公司),ADVIA 2400全自動生化分析儀(德國西門子公司),P800全自動生化分析儀及Hcy測定試劑盒(美國Roche公司)。MS/MS檢測試劑盒(美國珀金埃爾默公司)，有機酸(氣質法)測定試劑盒(浙江博圣公司)，甲醇、甲酸(美國西格瑪公司)。

1.3MS/MS檢測干血斑中C3及其比值的濃度 根據(jù)參考文獻[4],采用非衍生化MS/MS技術,按照MS/MS檢測系統(tǒng)及MS/MS檢測試劑盒說明書操作檢測干血斑中C3并計算C3/C2、C3/C0比值。C3參考范圍：<3.5 μmol/L；C3/C2參考范圍：<0.2；C3/C0參考范圍：<0.18。

1.4氣相色譜-質譜(GC-MS)檢測 根據(jù)參考文獻[4],采用非衍生化GC-MS技術,按照Agilent 7890A-5975C GC/MS聯(lián)用儀及有機酸(氣質法)檢測試劑盒說明書操作檢測甲基丙二酸血癥患兒隨機尿濾紙片樣本中的MMA,MMA參考范圍：0～3.5 μmol/L。

1.5循環(huán)酶法檢測血清Hcy濃度 按照P800全自動生化分析儀及Hcy測定試劑盒(循環(huán)酶法)說明書操作檢測甲基丙二酸血癥患兒血清Hcy濃度。Hcy參考范圍：3～50 μmol/L，超出范圍樣品稀釋后復測。

1.6LC-MS/MS檢測干血斑樣本中MMA、Hcy濃度 根據(jù)參考文獻[4],采用LC-MS/MS技術,按照MS/MS檢測系統(tǒng)及本實驗室自制試劑檢測干血斑樣本中MMA、Hcy濃度。根據(jù)梅奧診所提供的LC-MS/MS技術檢測干血斑中MMA和Hcy的cut-off值(分別以5.0 μmol/L和15 μmol/L)進行結果判讀。

1.7MMA生化診斷標準[1,5]尿液MMA顯著升高，血液C3升高或C3/C0、C3/C2升高，Hcy升高的患者，診斷為甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥；尿液MMA顯著升高，血液C3升高或C3/C0、C3/C2升高，Hcy正常的患者，診斷為單純型甲基丙二酸血癥。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行。用頻數(shù)分布直方圖觀察MMA和Hcy在干血斑中的分布特征。正態(tài)分布計量資料采用t檢驗，偏態(tài)分布采用Mann-WhitneyU檢驗。偏態(tài)分布的計量資料用百分位數(shù)法確定MMA和Hcy在正常新生兒干血斑樣本中的第0.5～99.5百分位界值。結合正常新生兒和甲基丙二酸血癥患兒的檢測數(shù)據(jù)，應用ROC曲線分析確定MMA和Hcy在干血斑中的cut-off值。

2 結果

2.1初篩干血斑樣本中MMA和Hcy的濃度 1 015例陰性樣本中MMA和Hcy呈偏態(tài)分布，其中MMA濃度分布區(qū)間為0～5.9 μmol/L，其99.5百分位界值為3.796 μmol/L；Hcy濃度分布區(qū)間為0.3～28.3 μmol/L，其99.5百分位點對應的數(shù)值為9.498 μmol/L。

2.2確診甲基丙二酸血癥患兒初篩干血斑中LC-MS/MS檢測結果 本實驗室確診16例甲基丙二酸血癥患兒，其初篩干血斑樣本中LC-MS/MS的檢測結果見表1。

表116例確診甲基丙二酸血癥患兒初篩干血斑中LC-MS/MS檢測結果

2.3干血斑標本中MMA、Hcy濃度結果 采用Mann-WhitneyU檢驗比較正常新生兒和甲基丙二酸血癥患兒兩組參數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，甲基丙二酸血癥患兒的MMA和Hcy濃度明顯高于陰性樣本，差異具有統(tǒng)計學意義(UMMA=8.5，UHcy=23.5，P均<0.05)。

2.4ROC曲線分析MMA及Hcy結果 針對1 015例陰性樣本及16例陽性樣本，以16例陽性標本作為實驗組，1 015例陰性樣本作為對照組，用ROC曲線分析其篩查甲基丙二酸血癥的臨床效能，結果發(fā)現(xiàn)MMA篩查甲基丙二酸血癥的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.999，當cut-off值為3.145 μmol/L時，其敏感性為100%，特異性為99.5%。此外，以1 015例非甲基丙二酸血癥患兒作為對照組，16例甲基丙二酸血癥患兒作為實驗組，ROC曲線分析Hcy篩查甲基丙二酸血癥的臨床效能，結果表明，其AUCROC為0.999，當cut-off值為7.295 μmol/L時，其敏感性為100%，特異性為99.3%。

2.5與梅奧診所的cut-off值對比結果 本研究中南京地區(qū)人群的MMA和Hcy cut-off值明顯低于梅奧診所提供的cut-off值。結果見表2。

表2本實驗室MMA和Hcy檢測cut-off值與梅奧診所對比結果(μmol/L)

3 討論

我國新生兒遺傳代謝病篩查開始于上世紀八十年代，由于MS/MS技術的應用極大地拓寬了篩查病種，提高了篩查效率。串聯(lián)質譜已經發(fā)展成為遺傳代謝病篩查中最理想的分析技術。甲基丙二酸血癥作為我國最常見有機酸尿癥[7]，是首要篩查的遺傳代謝病之一，其在南京地區(qū)的發(fā)病率約為1∶11 000，全國的發(fā)病率暫無確切的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

長期以來，甲基丙二酸血癥的早期發(fā)現(xiàn)主要依賴基于MS/MS技術的新生兒篩查，篩查指標為C3、C2、C0水平及其比值。采用的是基于MS/MS技術的“初次篩查+召回復查”模式。二階篩查技術是在初次篩查技術上發(fā)展起來的準確性更高的一種篩查技術，是在原血片基礎上檢測目標疾病的生化診斷指標而不是篩查指標，以提高目標疾病檢出率，降低假陽性率和避免漏篩。2004年，針對新生兒遺傳代謝病篩查首次提出了“二階篩查”的概念[8]。2007年，意大利學者開始嘗試應用LC-MS/MS技術定量分析干血濾紙片中甲基丙二酸血癥等遺傳代謝病的特異性診斷指標以進行二階篩查[9]，包括MMA、甲基枸櫞酸、3-羥基丙酸、異戊酸、乙基丙二酸等。該研究結果表明，對甲基丙二酸血癥MS/MS初次篩查陽性樣本進行原血片二階篩查，使陽性預測值從5.2%提高至20%。2010年，美國梅奧診所Turgeon等[3]對LC-MS/MS技術進一步優(yōu)化，使每個樣本檢測時間僅需要3 min，并通過200份陽性樣本的研究，初步制定了LC-MS/MS技術檢測干血濾紙片中MMA、Hcy等相關特異性指標的cut-off值。以上研究均表明，基于LC-MS/MS的二階篩查技術具有更高的臨床應用價值。然而，且前國內開展二階篩查的研究報道較少。

新技術可以引進，但是cut-off值不能照搬。不同地域、不同人群的指標濃度可能存在差異，因此實驗室在開展新項目時必須制定本實驗室的參考范圍或cut-off值。傳統(tǒng)新生兒篩查檢測項目，如促甲狀腺素、苯丙氨酸、17α羥孕酮等，多選取數(shù)據(jù)分布的第0.5和99.5百分位界值作為上、下參考限的取值[10-11]。ROC曲線法是能夠全面并準確評價診斷試驗的有效工具，且能確定檢測的最佳閾值。但是截止到目前，國內對于二階篩查的報道非常少，更無二階篩查指標cut-off值建立的研究和文獻。本研究發(fā)現(xiàn)，MMA和Hcy兩指標的99.5百分位界值與ROC曲線分析得到的cut-off值不一致，且99.5百分位界值均大于ROC曲線制定的cut-off值，鑒于甲基丙二酸血癥一旦漏篩后果嚴重，篩查要求盡量避免漏篩，我們認為以ROC曲線制定的cut-off值作為召回患兒的標準更為可靠。但是，當新生兒該指標超過cut-off值時，不能立即診斷為異常，仍然需要考慮召回復查并進一步加以明確。

此外，與美國梅奧診斷提出MMA的cut-off值為5.0 μmol/L相比，南京地區(qū)人群MMA的cut-off值(MMA：3.145 μmol/L)遠遠低于國外的人群，進行數(shù)據(jù)比較后的結果進一步說明二階篩查新技術引進后不能盲目的直接借調參考值或cut-off值，新技術引進后必須盡快確定適應于當?shù)厝巳汉驮搶嶒炇业腸ut-off值。

必須指出，足夠的陽性樣本量是如實反應試驗準確性、排除機會干擾的保證，因此ROC曲線在實際應用中要求有一定數(shù)量的陽性樣本，最好陽性樣本量能大于30例。本中心開展LC-MS/MS檢測時間尚短，積累的陽性樣本量有限，隨著后續(xù)更多陽性樣本的積累和納入，該cut-off值可以繼續(xù)利用ROC曲線進一步調整。此外，本研究目的僅僅是在于給其他篩查中心制定該實驗室的cut-off值提供一種可靠的方法，而不是推廣本研究中的參考范圍。