梁麗霞 ，陳世準(zhǔn) ，程慧 ，張燕霞 ，劉健 ，陳平

(廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.感染性疾病科；3.CT室，肇慶 526060；4.廣東省肇慶市封開(kāi)縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，肇慶526500)

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）是一種新型β屬冠狀病毒，屬正冠狀病毒亞科，成為繼α-冠狀病毒 HCoV-229E 和 HCoV-NL63, β-冠狀病毒的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、 SARS-CoV 和 MERSCoV 后， 能感染人類(lèi)的冠狀病毒學(xué)科中的第七個(gè)成員[1,2]。 根據(jù)病毒分類(lèi)學(xué)， 國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)ICTV 正式確認(rèn)該病毒是SARS 冠狀病毒屬SARSCoV 的姐妹，并將其命名為 SARS-CoV-2[3]。 2020年2 月11 日， 世界衛(wèi)生組織正式將SARS-CoV-2引起的肺炎疾病命名為COVID-19[4]。

2019 年12 月湖北省武漢市爆發(fā)COVID-19,疫情迅速蔓延至中國(guó)31 個(gè)省份。 2020 年1 月20日我國(guó)將其納入法定乙類(lèi)傳染病， 并采取甲類(lèi)傳染病的預(yù)防、控制措施。2020 年1 月31 日，世界衛(wèi)生組織宣布新型冠狀病毒肺炎疫情構(gòu)成 “國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”[5]。 截至 3 月 5 日 24 時(shí)，據(jù)31 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)報(bào)告，現(xiàn)有確診病例23784 例（其中重癥病例5737例），累計(jì)治愈出院病例53726 例，累計(jì)死亡病例3042 例，累計(jì)報(bào)告確診病例 80552 例[6]。 作為廣東省肇慶地區(qū)COVID-19 患者定點(diǎn)收治醫(yī)院， 我們收集這些COVID-19 病例資料進(jìn)行臨床特征分析，旨在為臨床診斷提供有利可靠的參考數(shù)據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集 2020 年 1 月 22 日-3 月 6 日 19 例肇慶市第一人民醫(yī)院信息系統(tǒng)新型冠狀病毒確診病例和1 例封開(kāi)縣人民醫(yī)院新型冠狀病毒感染患者的基本信息來(lái)進(jìn)行臨床特征性分析。 所有確診病例均符合國(guó)家衛(wèi)生健康委 《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第四版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 樣本的采集 采集患者上呼吸道 （鼻咽拭子、口咽拭子等）和下呼吸道（深部痰、痰液）及肛拭子標(biāo)本，采集后的標(biāo)本保存在病毒采樣液中，4℃保存及時(shí)送檢。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)格按照《國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南（第二版）的通知》及《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第二版）》相關(guān)文件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和生物安全防護(hù)。

⑴RNA 提?。?采用中元生物奧盛半自動(dòng)核酸提取儀及其試劑（磁珠法）提取RNA，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

⑵核酸擴(kuò)增：使用ABI7500PCR 儀，根據(jù)達(dá)安基因SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)三通道試劑盒 （熒光PCR 法） 說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)程序， 利用一步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR） 技術(shù)， 選取 SARS-CoV-2病毒的ORF1ab 和N 基因作為擴(kuò)增靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針（N 基因探針采用FAM 標(biāo)記，ORF1ab 探針采用Yellow 標(biāo)記）用于SARS-CoV-2檢測(cè)。 試劑盒同時(shí)包括了內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)系統(tǒng)（內(nèi)標(biāo)基因探針采用Cy5 標(biāo)記），用于對(duì)標(biāo)本采集、核酸提取過(guò)程及PCR 擴(kuò)增過(guò)程的監(jiān)控。

⑶質(zhì)量控制：同一實(shí)驗(yàn)同時(shí)滿(mǎn)足：陰性質(zhì)控品：FAM 和VIC 檢測(cè)通道無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，Cy5 通道有明顯擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性質(zhì)控品：FAM 和VIC 檢測(cè)通道有明顯擴(kuò)增曲線，核酸檢測(cè)循環(huán)閾值（Ct 值）≤32，Cy5 通道有或無(wú)擴(kuò)增曲線。

⑷結(jié)果判定：陰性結(jié)果：FAM（N 基因）和VIC通道 （ORF1ab 基因） 無(wú)典型S 型擴(kuò)增曲線或Ct>40，且Cy5 通道有明顯擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性結(jié)果：N 基因和 ORF1ab 基因 Ct 值≤40， 且有典型的 S 型擴(kuò)增曲線； 如果 N 基因或 ORF1ab 基因單一通道 Ct值≤40，復(fù)檢后結(jié)果一致可判為陽(yáng)性。

⑸新增陽(yáng)性標(biāo)本需上送肇慶市疾控中心復(fù)檢確診。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 Excel2010 建立數(shù)據(jù)庫(kù)， 將輕型和普通型劃分為一組即普通組，重型和死亡病例劃為一組即重癥組， 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

2.1.1 性別、年齡及地區(qū)分布 19 例COVID-19 確診病例中，男 11 例，女 8 例，男女比值為 1.38：1。感染病例年齡介于3 歲到65 歲之間， 年齡組3-10歲占 10.5%（2/19），24-27 歲占 36.8%（7/19），33-37 歲占 15.8%（3/19），43 歲占 5.3%（1/19），55-56歲占 10.5%（2/19），62-65 歲占 21.1%（4/19）。 地區(qū)分布為肇慶市端州區(qū)占36.8%（7/19）， 封開(kāi)縣占26.3%（5/19），高要區(qū)占 15.8%（3/19），鼎湖區(qū)占 10.5%（2/19），四會(huì)市占 5.3%（1/19），廣寧縣占 5.3%（1/19）。

2.1.2 接觸史 6 例患者近半年在湖北居?。? 例武漢市，1 例黃岡市），4 例在外出旅游途中接觸過(guò)湖北人，其余都是確診病例的密切接觸者。 兩起家庭聚集性病例共有8 例。

2.1.3 臨床癥狀分布 19 例COVID-19 病例確診病例中， 封開(kāi)縣人民醫(yī)院1 例死亡病例患有多年糖尿病史，2 月 2 日發(fā)病，在 2 月 6 日 SARS-CoV-2 RNA 檢測(cè)陽(yáng)性確診為COVID-19，當(dāng)天未送至定點(diǎn)收治醫(yī)院前死亡。臨床分型輕型占10.5%（2/19）,普通型占 73.7%（14/19）, 重型占 10.5%（2/19），死亡病例占5.3%（1/19）。 重型及死亡患者年齡分別是62、64 和56 歲。 臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱占94.7%（18/19），體溫在 37.0℃-38.5℃之間。 乏力占 68.4%（13/19），咳嗽占 57.9%（11/19），氣促占 31.6%（6/19），流涕、鼻塞占 21.1%（4/19），咽痛占 15.8%（3/19）,咽癢占 10.5%（2/19）,腹瀉占 5.3%（1/19）。

2.1.4 病例住院情況 根據(jù)病例資料追蹤回顧， 19例COVID-19 病例確診病例從開(kāi)始有癥狀為發(fā)病日期起至確診入院，時(shí)長(zhǎng)為0-17d。 2 起家庭聚集性病例部分患者是檢測(cè)新型冠狀病毒RNA 陽(yáng)性后，入院經(jīng)胸部影像學(xué)CT 檢查等其他診治方式確診的。 住院天數(shù)8-33 天， 截至到2020 年3 月 6日，出院后復(fù)陽(yáng)率為21.1%（4/19）。 復(fù)陽(yáng)再住院天數(shù)為 13-17d（見(jiàn)表 1）。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

2.1.1 胸部影像學(xué) CT 表現(xiàn) 19 例COVID-19 病例確診病例， 除1 例患者因懷孕11 周未行胸部CT檢查外，83.3%（15/18）患者的CT 結(jié)果顯示單肺或雙肺不同程度的肺炎病灶 （圖1）， 其中2 例重型CT 表現(xiàn)為雙肺多發(fā)磨玻璃樣病變，11.1%（2/18）患者CT 顯示雙肺紋理增粗，5.6%（1/18） 患者的 CT結(jié)果無(wú)異常。

圖1 典型的新型冠狀肺炎CT表現(xiàn)

2.1.2 血液生化免疫指標(biāo)檢測(cè) 19 例COVID-19病例確診病例，A 型血型患者占 52.6%（10/19），B型血型患者占26.3%（5/19），O 型血型患者占 21.1%（4/19），重型和死亡病例的血型均為B 型。病人入院時(shí)血常規(guī)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）和淋巴細(xì)胞絕對(duì)值（LY#）大多病例正常，極少數(shù)偏低或偏高，57.9%（11/19）患者血清 C-反應(yīng)蛋白（CRP）升高，89.5%（17/19）血沉（ESR）升高，21.1%（4/19）血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）輕度升高， 42.1%（8/19）血清乳酸脫氫酶L（LDH-L）和血漿纖維蛋白原（FIB）輕度升高， 這些項(xiàng)目在普通組和重癥組中無(wú)顯著性差異（P>0.5）（表 2）。 37.5%(6/19)患者的血清羥丁酸脫氫酶（HBDH）升高，重癥組比普通組升高更明顯，兩組比較有顯著性差異（P=0.025<0.05）。 除1例合并感染乙型肝炎病毒外， 其余病例乙肝、丙肝、艾滋病毒和梅毒螺旋體抗體都是陰性。 呼吸道抗原IgM 抗體檢測(cè)中，10.5%(2/19) 合并嗜肺軍團(tuán)菌感染，5.3%(1/19) 合并肺炎衣原體，5.3%(1/19)合并肺炎支原體。

表1 肇慶地區(qū)19例COVID-19確診病例發(fā)病住院情況

2.1.3 RNA 核酸檢測(cè) SARS-CoV-2 RNA 陽(yáng)性結(jié)果擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2。早期發(fā)病鼻咽拭子的檢出率是100%（19/19）。 送檢的 206 例病毒 RNA 檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本類(lèi)型中,鼻咽拭子陽(yáng)性檢出率最高，占63.1%（130/206），其次是肛拭子占 24.3%（50/206），口咽拭子占 7.7%（16/206），痰占 4.9%（10/206）。比較鼻咽拭子和肛拭子比較兩組陽(yáng)性結(jié)果的Ct 值，N基因 Ct 值差別無(wú)顯著性差異 （P=0.419>0.05），而ORF1ab 基因的Ct 值差別有差異(P=0.034<0.05)。

2 討論

圖2 SARS-CoV-2核酸RT-PCR陽(yáng)性結(jié)果擴(kuò)增曲線

19 例COVID-19 確診病例， 男性感染患者比女性患者多，比值為 1.38：1。 據(jù)相關(guān)研究顯示[7]，女性高水平的免疫應(yīng)答能很快地清除病毒， 因其擁有天然免疫細(xì)胞（如樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞）數(shù)量多，炎癥免疫應(yīng)答水平比男性要高。 感染年齡介于3 歲到65 歲之間，年齡組24-27 歲最多占36.8%，其次為55-56 歲、62-65 歲，無(wú)地區(qū)特異分布， 主要感染源是直接接觸疫情發(fā)源地的感染者。 從年齡層面來(lái)看，我們發(fā)現(xiàn)感染的年齡相對(duì)集中，或許與病例數(shù)及感染接觸人群密切相關(guān)。 重型患者在56-64 歲之間， 死亡病例有嚴(yán)重的糖尿病史。 據(jù)相關(guān)報(bào)道稱(chēng)，重型患者及死亡患者大多是具有基礎(chǔ)疾病的老年人， 主要是腦血管疾病如糖尿病， 提示這些基礎(chǔ)疾病是重型及危重型患者的危險(xiǎn)因素。 將封開(kāi)縣人民醫(yī)院的1 例死亡病例與我院治療康復(fù)的2 例重型患者作對(duì)比， 提示早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的關(guān)鍵性，這樣能有效避免部分普通型患者向重型[8]，甚至危重型至死亡而造成不可逆轉(zhuǎn)的變化。

表2 19例COVID-19確診病例普通組和重癥組部分血液生化指標(biāo)比較

據(jù)SARS-CoV-2 的相關(guān)報(bào)道,多數(shù)感染患者表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、乏力、呼吸困難等。 19 例COVID-19 確診病例臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱94.7%，乏力68.4%，干咳57.9%，氣促31.6%，流涕、鼻塞21.1%，咽痛15.8%，咽癢0.5%，腹瀉5.3%，這與安徽省立醫(yī)院報(bào)道的相同。 發(fā)熱體溫在37.0℃-38.5℃之間，與流感表現(xiàn)高熱而不同，該病毒與SARS 不同的是在潛伏期已經(jīng)開(kāi)始具有傳染性[9]。 SARS-CoV-2 在沒(méi)有特效藥的情況下， 病毒在患者體內(nèi)仍可存活很長(zhǎng)時(shí)間，住院天數(shù)比較長(zhǎng)，甚至出院患者病毒核酸復(fù)陽(yáng)率高達(dá)21.1%，提示出院患者應(yīng)繼續(xù)隔離留觀直至真正轉(zhuǎn)陰為止。

本研究83.3%患者的CT 結(jié)果顯示單肺或雙肺不同程度的肺炎病灶，重型和死亡病例CT 表現(xiàn)為雙肺多發(fā)磨玻璃樣病變，提示了胸部影像CT 是一項(xiàng)很好的篩查手段。 熒光RT-PCR 檢測(cè)雖然是確診的主要依據(jù)，但是因取樣、試劑等緣故，SARSCoV-2RNA 檢出受限，在這樣的情況下，胸部影像學(xué)CT 表現(xiàn)是判斷病情嚴(yán)重程度可依賴(lài)的檢測(cè)手段[10]。

這些COVID-19 確診病例中，A 型血型感染患者（52.6%）比其他血型多，A 型血型患者對(duì)SARSCoV-2 感染更為易感， 這與江西地區(qū)研究的結(jié)果相同[11]。 此外，我們還發(fā)現(xiàn)重型和死亡病例血型均為B 型血型， 提示臨床應(yīng)注重血型是B 型的老年患者疾病轉(zhuǎn)歸問(wèn)題。 由于本研究病例不多，有待更多的相關(guān)數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。病人入院時(shí)血常規(guī)，WBC 和淋巴細(xì)胞絕對(duì)值大多病例正常， 極少數(shù)偏低或偏高，57.9%患者血清CRP 升高，89.5%血沉升高，21.1 %ALT 輕度升高， 42.1%血清乳酸脫氫酶 L（LDH-L）和血漿纖維蛋白原（FIB）輕度升高，這些項(xiàng)目在普通組和重癥組中差別無(wú)顯著性差異（P>0.05）。 患者的血清羥丁酸脫氫酶（HBDH）重癥組比普通組升高比較明顯， 兩組比較差別有顯著性差異（P<0.05）。 從數(shù)據(jù)來(lái)看，3 例重癥組患者在 CRP、ESR、FIB、LDH-L、HBDH 這 些 項(xiàng) 目 100%升 高 ，LDH-L 和HBDH 是心肌酶譜酶，由于受生物毒素或壞死， 心肌炎中LDH-L 和HBDH 升高明顯，兩者呈正相關(guān)[12]， 提示COVID-19 重型患者SARSCoV-2 感染致使心肌損傷或心肌炎發(fā)生。

免疫8 項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果， 除1 例乙型肝炎病毒大三陽(yáng)結(jié)果外，其余病毒都是陰性。 受本研究的病例數(shù)限制， 需更多的數(shù)據(jù)來(lái)探討如果有其他病毒感染的情況下，是否不易感染SARS-CoV-2。 呼吸道抗原IgM 抗體檢測(cè)，9.5%患者合并嗜肺軍團(tuán)菌感染，4.8%合并肺炎衣原體或肺炎支原體，由此看出除感染SARS-CoV-2 外， 少數(shù)病例還是會(huì)合并其它呼吸道病原感染。

隨著治療進(jìn)展，因藥物抑制病毒復(fù)制等緣故，檢測(cè)SARS-CoV-2 RNA 隨之出現(xiàn)一過(guò)性陰性的結(jié)果，但病毒還是在反復(fù)送檢標(biāo)本中出現(xiàn)陽(yáng)性。 經(jīng)過(guò)藥物治療一段時(shí)間內(nèi)，結(jié)果會(huì)轉(zhuǎn)變陰性，但肛拭子的RNA 檢測(cè)仍是陽(yáng)性，甚至在康復(fù)出院后出現(xiàn)復(fù)陽(yáng)現(xiàn)象。 送檢的206 例病毒RNA 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性標(biāo)本類(lèi)型中，鼻咽拭子陽(yáng)性檢出率最高，占63.1%，其次是肛拭子24.3%，口咽拭子7.7%，痰4.9%，這與本院早期以鼻咽拭子取樣為主有關(guān)，與福建陳煒等[16]報(bào)道的4 例SARS-CoV-2 感染病例不一樣， 這或許是跟病例數(shù)以及各標(biāo)本類(lèi)型取樣是否含有病毒細(xì)胞有很大的關(guān)系。 深部痰和痰液標(biāo)本相對(duì)于黏稠，標(biāo)本需經(jīng)4%氫氧化鈉溶液液化處理，后經(jīng)生理鹽水洗滌，處理過(guò)程不當(dāng)會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。 另外，臨床患者癥狀多以干咳、無(wú)痰為主[17]，痰標(biāo)本的采集具有一定的難度與感染風(fēng)險(xiǎn)。 比較鼻咽拭子和肛拭子兩組陽(yáng)性結(jié)果的Ct 值，N 基因 Ct 值無(wú)差異（P>0.05），而 ORF1ab 基因的 Ct 值有差異(P<0.05)。 目前這方面相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)道不多， 日后將繼續(xù)深入研究， 為SARS-CoV-2 RNA檢測(cè)提供更為可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。