王莉芳，馮正平，李曉春，張金山

（1. 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710062； 2. 西北瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室·藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062； 3. 空軍軍醫(yī)大學(xué)解剖與組織胚胎學(xué)教研室，陜西 西安 710062）

胃饑餓素（ghrelin）是從胃中分離發(fā)現(xiàn)的，由28 個(gè)N 端第3 位絲氨酸殘基N 辛?；揎椀陌被峤M成的多肽［1］，是內(nèi)源性生長(zhǎng)激素促分泌素受體（GHSR）［2］，具有廣泛的組織分布，通過GHSR 發(fā)揮多種生物學(xué)作用，在腎臟中也有分布。有研究表明，外源性注射胃饑餓素對(duì)急性腎損傷有預(yù)防作用［3-4］。急性腎損傷易出現(xiàn)在腎缺血再灌注，稱為腎缺血再灌注損傷（IRI）。腎臟的損傷從缺血開始，恢復(fù)灌注后組織會(huì)進(jìn)一步處理?yè)p傷，包括中性粒細(xì)胞的聚集，游離自由基的產(chǎn)生和細(xì)胞因子的激活等［5］。IRI 過程中缺氧會(huì)導(dǎo)致不正常的信號(hào)傳導(dǎo)，引起一系列病理改變，導(dǎo)致腎功能嚴(yán)重受損［6-7］。本研究中采用HK-2 細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧損傷模型，在體外模擬腎缺血再灌注損傷過程，觀察胃饑餓素對(duì)IRI 的影響及其作用機(jī)制，通過CCK-8、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）法、蛋白質(zhì)印跡（WB）法觀察在胃饑餓素作用下HK-2 細(xì)胞的活力、凋亡情況及相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況，為進(jìn)一步在預(yù)防腎損傷領(lǐng)域應(yīng)用胃饑餓素提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：3131 型三氣培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；MCO-18AIC 型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）；1300 SERIES A2 型生物安全柜（美國(guó)Thermo 公司）；Do X6 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）。

試藥：胃饑餓素（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)為G3902）；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）兔一抗（批號(hào)為4695T），細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化（p-ERK）兔一抗（批號(hào)為4370T），P38 促分列素原活化蛋白激酶（P38）兔一抗（批號(hào)為8690T），磷酸化P38 促分列素原活化蛋白激酶p-P38 兔一抗（批號(hào)為4511T），均購(gòu)自美國(guó)CST 公司；TUNEL 試劑盒（瑞士ROCH 公司，批號(hào)為11684817910）；β-actin 兔一抗（批號(hào)為ab8227），HRP標(biāo)記抗兔二抗（批號(hào)為ab6721），均購(gòu)自Abcam 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

細(xì)胞：HK-2 細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HK-2 細(xì)胞株加入DMEM/F12 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中進(jìn)行培養(yǎng)，再將其置孵育箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2），孵育箱需維持飽和濕度等適宜的培養(yǎng)條件，在無(wú)菌條件下開始進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿玻片壁后，用0.25%濃度的胰酶?jìng)鞔交?4 h 后細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞每3 ～5 d 可傳代1 次。

1.3 建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型

采用體外細(xì)胞培養(yǎng)，缺氧/復(fù)氧模型模擬缺血再灌注模型。將正常培養(yǎng)的HK-2 細(xì)胞置0.25%濃度的胰酶消化，計(jì)數(shù)后按2×104個(gè)/孔接種于96 孔板中。于第2 天將96 孔板置三氣培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2，1%O2），分別培養(yǎng)0，1，2，3，4 h，移至正常培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2）12 h。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力

將質(zhì)量濃度為0，12.5，25，50，100，200，400，800，1 600 ng / mL 的胃饑餓素加入2 ×104個(gè)/ 孔的96 孔板中，每組平行4 個(gè)。于正常培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2）孵育2 h，置三氣培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2，1%O2）培養(yǎng)4 h，于正常培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5% CO2）孵育12 h。每孔加入新鮮配制的含10 μL 的毒性檢測(cè)液CCK-8，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A）值。

1.5 試驗(yàn)分組

將正常培養(yǎng)的HK-2 細(xì)胞置0.25%濃度的胰酶消化，計(jì)數(shù)后按1 ×105個(gè)/ 孔接種于預(yù)先放置爬片的24 孔板中。第2 天將細(xì)胞分為3 組，正常組（N 組）細(xì)胞正常培養(yǎng)16 h；缺氧/復(fù)氧損傷組（H/R 組）不做處理的細(xì)胞于正常培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2）孵育2 h，將孔板置三氣培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2，1%O2）培養(yǎng)4 h，然后移至正常培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2）12 h；胃饑餓素預(yù)處理組+缺氧/復(fù)氧損傷組（ghrelin+H/R 組）將質(zhì)量濃度為400 ng/mL 的胃饑餓素加入24 孔板中，正常培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2）孵育2 h，置三氣培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2，1%O2）培養(yǎng)4 h，移至正常培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5%CO2）12 h。

1.6 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入細(xì)胞爬片，按1.5 項(xiàng)下方法培養(yǎng)。將各組爬片置4%多聚甲醛固定，以Streptavidin 工作液覆蓋孵育樣品，DAPI 復(fù)染封片。200倍顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈黃色為陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。

1.7 WB 法檢測(cè)蛋白表達(dá)

用RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，30 μg 的蛋白樣品在10%SDS-PAGE 凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；PVDF 膜用5%脫脂牛奶封閉2 h；PVDF 膜在4 ℃溫度下與一抗孵育過夜，再用1 ∶2 000 辣根過氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體室溫下孵育1 h；蛋白條帶以化學(xué)發(fā)光法顯色獲得。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用Tukey′s Multiple Comparisons Test。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立

HK-2 細(xì)胞置三氣培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2，1%O2）缺氧1，2，3 h 后，正常培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）復(fù)氧12 h均不能有效影響細(xì)胞活力，缺氧4 h 正常培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）復(fù)氧12 h，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）。表明HK-2 細(xì)胞置三氣培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2，1%O2）缺氧4 h，置正常培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）復(fù)氧12 h，能有效誘導(dǎo)其缺氧/復(fù)氧損傷模型。詳見圖1。

圖1 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立

2.2 不同質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞活力的影響

CCK -8 試驗(yàn)結(jié)果表明，采用質(zhì)量濃度為12.5，25，50 ng/mL 的胃饑餓素預(yù)處理2 h 后，對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的HK-2 細(xì)胞無(wú)明顯影響。但胃饑餓素質(zhì)量濃度為100，200，400，800 ng / mL 預(yù)處理能有效提高細(xì)胞活 力（P＜0.01），且當(dāng)質(zhì)量濃度為1 600 ng/mL 時(shí)，HK-2 細(xì)胞的活力開始降低，表明胃饑餓素質(zhì)量濃度為1 600 ng/mL 時(shí)不利于HK-2 細(xì)胞的生存。詳見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度胃饑餓素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷HK-2 細(xì)胞的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證胃饑餓素對(duì)正常HK-2 細(xì)胞的影響，將不同質(zhì)量濃度的胃饑餓素加入正常HK-2 細(xì)胞中，且置正常培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）孵育16 h。每孔加入新鮮配制的含10 μL 的毒性檢測(cè)液CCK-8，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，結(jié)果見圖3?？梢?，質(zhì)量濃度為12.5，25，50，100，200，400 ng/mL 的胃饑餓素均不影響HK-2 細(xì)胞的生長(zhǎng)，但胃饑餓素質(zhì)量濃度為800，1 600 ng/mL 時(shí)，HK-2細(xì)胞的活力顯著降低（P＜0.05）。表明胃饑餓素質(zhì)量濃度大于800 ng/mL 不利于HK-2 細(xì)胞的生存。

圖3 不同質(zhì)量濃度胃饑餓素對(duì)正常HK-2 細(xì)胞的影響

2.3 對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的HK-2 細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL 試驗(yàn)結(jié)果顯示，N 組HK-2 細(xì)胞未明顯凋亡，但H/R 組中HK-2 細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，但胃饑餓素（400 ng/mL）預(yù)處理后，HK-2 細(xì)胞凋亡明顯減少。表明胃饑餓素能有效抑制由缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞的凋亡，詳見圖4。

圖4 胃饑餓素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的HK-2 細(xì)胞凋亡的影響

2.4 對(duì)細(xì)胞中ERK 表達(dá)的影響

WB 試驗(yàn)結(jié)果表明，胃饑餓素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的HK-2 細(xì)胞中總ERK 蛋白及磷酸化p-ERK 蛋白表達(dá)無(wú)影響，β-actin 為內(nèi)參蛋白。詳見圖5。

圖5 胃饑餓素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的HK-2 細(xì)胞中ERK 表達(dá)的影響

2.5 對(duì)細(xì)胞中P38 表達(dá)的影響

WB 試驗(yàn)結(jié)果表明，胃饑餓素預(yù)處理后能顯著增加缺氧/復(fù)氧損傷的HK-2 細(xì)胞中磷酸化P38 蛋白的表達(dá)。表明胃饑餓素可能是通過激活P38 信號(hào)通路保護(hù)HK-2 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧的損傷。詳見圖6。

3 討論

腎缺血再灌注的發(fā)病機(jī)制包括氧自由基的毒性、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等，針對(duì)這些致病機(jī)制采取對(duì)應(yīng)的治療措施［8］。

圖6 胃饑餓素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的HK-2 細(xì)胞中P38 表達(dá)的影響

ANDREWS 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，胃饑餓素可通過減少線粒體中活性氧來(lái)發(fā)揮抗氧化作用［9］；胃饑餓素被證明可增加神經(jīng)元細(xì)胞中UCP2 蛋白的表達(dá)［10］；外源性注射胃饑餓素能刺激催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)醇的分泌；胃饑餓素能通過引起嚙齒動(dòng)物和人類高血糖，降低胰島素水平發(fā)揮厭食效應(yīng)；胃饑餓素在心力衰竭和心肌缺血再灌注損傷中可起保護(hù)作用，在其他疾病如膿毒癥和腸道缺血再灌注損傷中有有益作用［11］。

KEIKO 等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，胃饑餓素在小鼠中能通過抗氧化應(yīng)激機(jī)制保護(hù)其免受促血管生成素Ⅱ引起的腎臟損害。胃饑餓素通過迷走神經(jīng)對(duì)動(dòng)物腎缺血再灌注起保護(hù)作用［13］。提示胃饑餓素能在腎缺血再灌注損傷中起到一定作用，但其如何在這個(gè)過程發(fā)揮作用的機(jī)制尚不明確。

本研究中以人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2 細(xì)胞為模型，成功建立了體外缺氧/復(fù)氧損傷模型，并模擬腎缺血再灌注損傷模型。研究結(jié)果顯示，胃饑餓素能提高缺氧/復(fù)氧細(xì)胞的活力，高質(zhì)量濃度的胃饑餓素對(duì)細(xì)胞活力有一定損傷，提示在使用胃饑餓素預(yù)防腎缺血再灌注損傷時(shí)應(yīng)當(dāng)注意選擇適當(dāng)?shù)臐舛冗M(jìn)行預(yù)處理，能在缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型中起到保護(hù)作用。WB 檢測(cè)結(jié)果顯示，ERK 蛋白表達(dá)無(wú)變化，胃饑餓素預(yù)處理后，p-P38 蛋白含量有顯著提升。P38 有絲分裂素激活蛋白激酶（MAPK）是與細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通道［14］。代謝綜合征大鼠血管周圍脂肪組織來(lái)源的瘦素可通過P38 通路促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞由收縮型轉(zhuǎn)換為增殖型［15］。故推測(cè)胃饑餓素能通過激活P38 信號(hào)通路保護(hù)HK-2 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧的損傷，為進(jìn)一步探討胃饑餓素如何在腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用提供了新思路。