王 松，王 婷，蔣 剛△

（1. 電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610054； 2. 四川省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610041）

Keap1- Nrf2- ARE 是細(xì)胞存活的重要防御機(jī)制之一，其主要功能是通過誘導(dǎo)多種基因的轉(zhuǎn)錄來激活細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)，從而抵抗細(xì)胞內(nèi)外的各種損傷，如氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和外來異物的損害［1］。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的激活不僅能提高正常細(xì)胞的生存能力，還有助于腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的抵抗。腫瘤細(xì)胞中Nrf2 的累積可幫助其抵抗化學(xué)治療（簡(jiǎn)稱化療）和放射治療（簡(jiǎn)稱放療）所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致癌癥治療效率下降，甚至導(dǎo)致治療失?。?］。據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞通過異常激活Nrf2 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)放療抵抗［3-5］。目前尚無關(guān)于Nrf2 抑制劑在臨床使用或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的相關(guān)報(bào)道，不過已發(fā)現(xiàn)一些中藥成分可通過調(diào)控Nrf2 達(dá)到放療增敏的效果。本研究中討論了腫瘤細(xì)胞放療抵抗發(fā)生機(jī)制及Nrf2 與放療增敏的關(guān)系，同時(shí)總結(jié)了中藥有效成分通過調(diào)控Nrf2 通路達(dá)到放療增敏效果的最新研究。

1 腫瘤細(xì)胞放療抵抗的發(fā)生機(jī)制

放療抵抗機(jī)制的形成通常由多個(gè)因素綜合導(dǎo)致。腫瘤干細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）清除劑的上調(diào)使得細(xì)胞內(nèi)ROS 濃度降低，導(dǎo)致細(xì)胞的DNA 損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，降低放射敏感性［6］。在放療抵抗的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量出現(xiàn)抗氧化酶過度表達(dá)的現(xiàn)象，阻斷這些抗氧化防御機(jī)制可有效增強(qiáng)放射敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［7］。因此，細(xì)胞中用于維持其氧化還原平衡的天然抗氧化系統(tǒng)與放療抵抗密切相關(guān)。

2 Nrf2 在腫瘤放療增敏中的作用

2.1 Nrf2 信號(hào)通路概述

Nrf2 屬CNC（Cap“n”Collar）家族的核轉(zhuǎn)錄因子，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和電離損傷中起重要作用［8］。一個(gè)完整的Nrf2 通路由Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）、Nrf2 及ARE 3 個(gè)部分構(gòu)成。

Nrf2 由7 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成（詳見圖1），依次命名為Neh1 至Neh7。Nrf2 通過ARE 可調(diào)控200 多種基因的表達(dá)，其中大部分基因都用于編碼解毒、抗氧化等［9］。Keap1 屬BTB-Kelch 蛋白家族，包括5 個(gè)主要功能域，詳見圖2。Keap1 是Nrf2 主要的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子，在穩(wěn)態(tài)條件下，Nrf2 與細(xì)胞質(zhì)中的Keap1 偶聯(lián)以進(jìn)行泛素化，隨后通過蛋白酶體降解，以此維持在較低水平。當(dāng)受到異生物質(zhì)或氧化應(yīng)激物刺激時(shí)，這種偶聯(lián)作用消失，Nrf2 在幾種蛋白激酶磷酸化作用下，發(fā)生核轉(zhuǎn)移，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，隨后與Maf 蛋白結(jié)合，再與ARE 結(jié)合，激活其下游靶基因中Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)［10-11］。詳見圖3。

圖1 Nrf2 功能結(jié)構(gòu)域示意圖

圖2 Keap1 功能結(jié)構(gòu)域示意圖

圖3 Nrf2 信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制圖

2.2 腫瘤細(xì)胞中Nrf2 與放療增敏的關(guān)系

腫瘤細(xì)胞中Nrf2 的異常激活導(dǎo)致其下游抗氧化酶表達(dá)增加，使其抵抗氧化應(yīng)激的能力相較于正常細(xì)胞大幅增加，ROS 的清除能力增強(qiáng)；同時(shí)，Nrf2 還可使DNA的損傷修復(fù)能力增強(qiáng)。這2 種都是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生放療抗性的主要機(jī)制，故調(diào)控腫瘤細(xì)胞中異常激活的Nrf2 及其下游基因的表達(dá)可達(dá)到放療增敏的效果。

參與腫瘤細(xì)胞中Nrf2 活化的途徑至少有4 種：1）體細(xì)胞內(nèi)Nrf2，Keap1，Cul3 基因的突變，在腫瘤細(xì)胞中引起異常的Nrf2 活化；2）Keap1 基因的表觀沉默導(dǎo)致Keap1 的下調(diào)和Nrf2 上調(diào)；3）與Keap1 相互作用蛋白的積累，如p62/Sqstm1 和p21 可阻斷Nrf2 和Keap1 的結(jié)合，從而導(dǎo)致Nrf2 積累；4）通過富馬酸鹽等代謝物對(duì)半胱氨酸的修飾，影響Keap1 活性并導(dǎo)致Nrf2 積累［12］。Nrf2 異常激活后，再通過ARE 上調(diào)相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)，從而腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS 的清除增加，減輕放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。且抑制腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的Nrf2 及其所介導(dǎo)的抗氧化防御系統(tǒng)，可達(dá)到放療增敏的效果，使腫瘤細(xì)胞經(jīng)放療后凋亡增加［13］。

Nrf2 與8-氧鳥嘌呤DNA 糖基化酶（OGG1）基因和53PB1 近端啟動(dòng)子中的ARE 結(jié)合，從而增加DNA 修復(fù)蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞中DNA 的損傷修復(fù)增強(qiáng)［14］。在MCF-7和A549 腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)，抑制Nrf2 會(huì)導(dǎo)致DNA 的修復(fù)能力明顯降低，且其修復(fù)能力并不依賴于ROS［15］。

表1 可通過調(diào)節(jié)Nrf2 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)放療增敏的中藥有效成分

3 中藥經(jīng)Nrf2 調(diào)控在腫瘤放療增敏中的作用

在腫瘤治療中，中藥與化療、放療或靶向治療相結(jié)合可提高療效，減少相關(guān)不良反應(yīng)及并發(fā)癥的發(fā)生，改善患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存時(shí)間［16］?？赏ㄟ^調(diào)控Nrf2通路實(shí)現(xiàn)放療增敏的幾種中藥有效成分及其作用機(jī)制分別見表1 和圖4。

圖4 中藥有效成分調(diào)控Nrf2 實(shí)現(xiàn)放療增敏作用機(jī)制簡(jiǎn)圖

鴉膽子苦醇：鴉膽子苦醇是鴉膽子中的苦木內(nèi)酯類化合物，藥理活性廣泛，包括抗腫瘤、抗瘧疾、抗炎、抗病毒和殺蟲活性［23］。SUN 等［17］的研究結(jié)果表明，鴉膽子苦醇在增加A549 細(xì)胞放療敏感的試驗(yàn)中，用80 nmol 鴉膽子苦醇處理4 h+6 Gy 照射聯(lián)合處理組，細(xì)胞中ROS水平比對(duì)照組增加1.8 倍，DNA 損傷加重，Nrf2 的蛋白表達(dá)水平比照射組顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞增殖速率明顯減緩（P＜0.01）?？梢姡f膽子苦醇可使暴露于輻射后A549 細(xì)胞中Nrf2 的積累減少，從而使細(xì)胞中ROS 水平升高，DNA 損傷增強(qiáng)，達(dá)到放療增敏的效果。

異甘草素（ISL）：是甘草的提取物，其在體內(nèi)外均可顯著上調(diào)Nrf2 及其下游基因的表達(dá)，且隨著ISL 使用劑量的增多，Nrf2 蛋白表達(dá)增多［24-25］，表明ISL 對(duì)Nrf2具有誘導(dǎo)作用。但SUN 等［18］發(fā)現(xiàn)，ISL 可通過干擾氧化還原狀態(tài)，從而提高HepG2 細(xì)胞的放射敏感性；其中涉及Nrf2 的下調(diào)，使HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 增加，引起其氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷增加，從而導(dǎo)致放射增敏。LIU等［9］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過10 μg/mL ISL 處理6 h 后的HepG2 細(xì)胞選擇性地增強(qiáng)了Keap1 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使Keap1 有效誘導(dǎo)Nrf2 的泛素化降解，抑制Nrf2 向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致Nrf2 下游基因表達(dá)降低，Nrf2 依賴性抗氧化系統(tǒng)被抑制，細(xì)胞內(nèi)ROS 增加；且經(jīng)過10 μg/mL ISL 6 h+4 Gy照射聯(lián)合處理可顯著增加HepG2 細(xì)胞凋亡及其克隆形成率（P＜0.05）。可見，ISL 通過增加Keap1 表達(dá)抑制Nrf2 抗氧化途徑，最終通過對(duì)氧化還原狀態(tài)的干擾誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而使HepG2 細(xì)胞在體內(nèi)外的放射敏感性均增強(qiáng)，表明ISL 具有放療增敏效果。

高山金蓮花素（AIF）：也稱為貓尾草異黃酮，是一種從毛果魚藤中提取的黃酮類化合物，具有多種藥理作用，包括抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗菌等［26］。貓尾草主要分布于我國的廣西、貴州、云南。ZHANG 等［20］研究了AIF 在食管鱗狀細(xì)胞癌放療中的作用，發(fā)現(xiàn)5 μm AIF 24 h+6 Gy照射聯(lián)合處理后可顯著抑制食管鱗狀癌細(xì)胞中Nrf2 及其下游基因HO-1 和NQO-1 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS增多，使DNA 損傷加重，細(xì)胞凋亡增加（P＜0.01）；在敲除Nrf2 基因后發(fā)現(xiàn)，用AIF+照射處理后并未顯著增加癌細(xì)胞中的ROS，與Nrf2 未敲除細(xì)胞中ROS 的水平相似，且敲除Nrf2 后的AIF 失去了放療增敏作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AIF 20 mg/kg+2 Gy 照射聯(lián)合處理后，體內(nèi)形成的腫瘤質(zhì)量顯著小于對(duì)照組（P＜0.01）?？梢?，AIF 通過抑制Nrf2 及其下游基因NQO-1 和HO-1的表達(dá)，從而增加輻射誘導(dǎo)的ESCC 細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生，達(dá)到放療增敏的效果。

染料木黃酮：是一種具有多種生物活性的天然異黃酮，主要存在于豆科植物中，藥理作用主要有抗炎、抗血管生成和抗癌活性［27］。LIU 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮可選擇性地對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）A549 細(xì)胞顯示放射增敏作用，但其對(duì)正常肺成纖維細(xì)胞MRC-5 無作用。研究發(fā)現(xiàn)，10μm 染料木黃酮經(jīng)48h+ 4 Gy 照射后降低了A549 細(xì)胞Keap1 啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，導(dǎo)致其mRNA 表達(dá)增加，有效抑制Nrf2 向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制Nrf2 依賴性抗氧化酶的表達(dá)，使得細(xì)胞內(nèi)ROS 上調(diào)，對(duì)細(xì)胞的損傷加重，細(xì)胞中NQO1 蛋白的表達(dá)被顯著抑制（P＜0.01）。兩者聯(lián)合處理后，A549 細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)、生長(zhǎng)速度均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。可見，染料黃木酮可通過抑制Keap1 啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，進(jìn)一步抑制Nrf2 及其下游基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致其對(duì)NSCLC 的A549 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)放療增敏作用。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）：是綠茶中的主要多酚物質(zhì)，屬黃烷醇類，具有強(qiáng)抗氧化性和抗癌性，在癌癥的預(yù)防、發(fā)生和發(fā)展過程都有治療作用［28］。ENKHBAT 等［22］報(bào)道指出，EGCG 通過Nrf2 信號(hào)通路使結(jié)直腸癌細(xì)胞達(dá)到放療增敏的效果。12.5μmol EGCG經(jīng)24 h+2 Gy 照射聯(lián)合治療后，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 的克隆形成率顯著降低（P＜0.05），聯(lián)合處理后細(xì)胞自噬及凋亡相關(guān)的mRNA 和蛋白（LC-3 及caspase-9 mRNA）表達(dá)水平增加，由于Nrf2-Keap1-P62 通路所促進(jìn)的細(xì)胞自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的一個(gè)基本降解機(jī)制。細(xì)胞自噬中的線粒體自噬在腫瘤微環(huán)境中，通過清除腫瘤細(xì)胞中功能失調(diào)的線粒體可發(fā)揮抗腫瘤作用?？梢?，EGCG 和放射聯(lián)合治療可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞中的線粒體自噬，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。

其他潛在增敏藥物：克羅苷元是從牛角瓜中提取出來的，可抑制Nrf2 及其驅(qū)動(dòng)的抗氧化劑分子NQO-1的表達(dá)，使A549 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)放療增敏［29］。栗子葉提取物或可通過抑制Nrf2 增加乳腺癌CSCs 對(duì)抗癌藥紫杉醇的敏感性，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可顯著降低MCF-7 來源的CSC中Nrf2 的核轉(zhuǎn)移和抗氧化酶蛋白的表達(dá)［30］。常春藤皂苷元是從常春藤葉中提取的三萜類化合物，可抑制Nrf2-ARE 途徑，并激活頭頸癌細(xì)胞中的P53，從而增強(qiáng)ROS 產(chǎn)生，并促進(jìn)谷胱甘肽耗竭，誘導(dǎo)耐藥頭頸癌細(xì)胞的凋亡［31］。鈴蘭毒苷是類洋地黃化合物，最新研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)Nrf2/ARE 有抑制作用，且其抑制機(jī)理不是通過轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的，而是通過蛋白水解調(diào)節(jié)的［32］。漢黃芩素來自于藥用植物黃芩，黃芩廣泛用于治療各種疾病，包括炎癥、過敏反應(yīng)、腫瘤、腹瀉等，能減少Nrf2 的核轉(zhuǎn)移，提高細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞［33］，其主要通過減少Nrf2 mRNA 轉(zhuǎn)錄下調(diào)Nrf2 表達(dá)［34］。

4 小結(jié)

中藥是腫瘤輔助治療的重要組成部分，已進(jìn)行的基礎(chǔ)和臨床研究表明，中藥在抑制腫瘤進(jìn)展，提高放療、化療、靶向治療的敏感性方面具有優(yōu)勢(shì)。Nrf2 在腫瘤的預(yù)防及進(jìn)展中的雙重作用決定了其特殊性，中藥成分可通過誘導(dǎo)Nrf2 及其靶向基因的表達(dá)在協(xié)調(diào)機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激所帶來的損傷，但在腫瘤細(xì)胞中由于Nrf2 的過表達(dá)，抵抗氧化應(yīng)激的增強(qiáng)導(dǎo)致放療抵抗。中藥成分亦可通過調(diào)控Nrf2 實(shí)現(xiàn)放療增敏，且同一中藥有效成分對(duì)Nrf2 通路的調(diào)控在不同實(shí)驗(yàn)中也存在差異。異甘草素、高山金蓮花素、染料木黃酮通過抑制Nrf2 表達(dá)可實(shí)現(xiàn)放療增敏作用，但也可作為Nrf2 激活劑，有助于細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激。因此，目前仍需進(jìn)一步研究同一中藥成分在不同細(xì)胞中對(duì)Nrf2 的調(diào)控存在差異的原因，以及由于Nrf2 雙重作用的存在，中藥成分通過Nrf2 達(dá)到放療增敏時(shí)對(duì)機(jī)體整體的綜合作用。