孟慶雯，王曉茜，朱厚玲，張園園△

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南 ?？?570100； 2. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科，海南 ?？?570100）

低氧或缺氧在許多生物學(xué)或病理學(xué)過程中有至關(guān)重要的作用，特別是與缺氧與心肌缺血疾病相關(guān)，初期會引起細(xì)胞保護(hù)性反應(yīng)，但最終會導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重影響其心臟功能［1］。細(xì)胞暴露于低氧濃度下會引發(fā)低氧反應(yīng)，其生長和生存能力降低，主要由低氧誘導(dǎo)因子1 （HIF-1）協(xié)調(diào)［2］。低氧誘 導(dǎo)因子由3 種α 亞基（HIF-1α，HIF-2α，HIF-3α）和1 個β 亞基［（HIF-1β，又稱芳基碳?xì)浠衔锖宿D(zhuǎn)運蛋白（ARNT）］構(gòu)成的異質(zhì)二聚體［3］。缺氧條件下，HIF-1α 與靶基因結(jié)構(gòu)上的低氧反應(yīng)元件（HRE 5′-RCGTG-3′）結(jié)合，被活化的HIF-1α 在靶基因轉(zhuǎn)錄起始部位形成一個轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［4］。近年來，有研究表明，HIF-1α 在低氧條件下有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能［5］。如何減少心肌細(xì)胞凋亡已成為保護(hù)心肌細(xì)胞的一大研究熱點，盡管已被證實HIF-1α 在低氧條件下心肌細(xì)胞中表達(dá)被上調(diào)［5-6］，但尚未報道HIF-1α 與PAR1 在低氧條件下心肌細(xì)胞中的相互作用。

蛋白酶激活受體（PARs）是單個7 跨膜G 蛋白偶聯(lián)受體的一個亞家族，包括PAR1，PAR2，PAR3，PAR4［7］。其中PAR1 已被報道在多種細(xì)胞中有改變細(xì)胞形態(tài)和抑制細(xì)胞凋亡的作用，如胃癌細(xì)胞［8］、乳腺癌細(xì)胞［9］、結(jié)腸癌細(xì)胞［10］、食道癌細(xì)胞［11］、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞［12］、肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞［13］等。有文獻(xiàn)報道，PAR1 和HIF-1α 的表達(dá)強(qiáng)度在化學(xué)治療（簡稱化療）前后的乳腺癌組織中呈正相關(guān)［14］。本研究中探討了低氧條件下HIF-1α 和PAR1 在H9c2 細(xì)胞中的表達(dá)，HIF-1α 和PAR1 的潛在關(guān)系，以及在低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用和機(jī)制，為心肌缺血的預(yù)防及治療提供了可能的靶點?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細(xì)胞

儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱；低溫冰箱，均購自美國Thermo Fisher 公司；垂直電泳系統(tǒng)，蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，ChemiDocTMXRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)，均購自美國BIO-RAD 公司；普通PCR 儀96 well，熒光實時定量PCR 儀，均購自美國Applied Biosystems 公司；倒置熒光顯微鏡，普通光學(xué)顯微鏡，均購自日本Olympus；M200 PRO 型酶標(biāo)儀購自奧地利Tecan Infinite 公司。

試劑：DMEM 培養(yǎng)基（批號為12800017），胎牛血清（批號為16000-044），均購自美國Gibco 公司；引物由上海生物工程有限責(zé)任公司合成；質(zhì)粒小抽試劑盒（批號為D0003），BCA 試劑盒（批號為P0011），均購自Beyotime 公司；LipofectamineTM3000（美國Invitrogen 公司，批 號 為L3000-015）；Trizol 試 劑，RIPA 裂 解 液，IP Buffer 裂解液，均購自Themo Fisher Scientific 公司；SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號為RR420A）；四氮唑（MTT，Solarbao，批號為M8180）；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（上海Roche 公司，批號為11684817910）；兔抗HIF-1α 抗體（批號為36169），兔抗Bcl-2 抗體（批號為3498），兔抗Bax 抗體（批號為5023），兔抗β-actin 抗體（批號為8457），均購自美國Cell Signaling Technology 公司；兔抗PAR1 抗體（美國Abcam 公司，批號為ab32611）。

細(xì)胞：大鼠心肌細(xì)胞系H9c2（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)H9c2 細(xì)胞，置37 ℃、95%O2、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 全換液1 次，保證細(xì)胞正常生長所需營養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至90%，使用0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代。選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗，將細(xì)胞分為常氧組和低氧組。常氧組將細(xì)胞置37 ℃、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，低氧組將細(xì)胞置37 ℃、1%O2、94%N2、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

選擇PSUPER 作為載體，對公司合成的引物進(jìn)行1 000 r/min、4 ℃離心5 ～10 min，按管壁上標(biāo)注的體積加入Milli-Q 水，混勻，4 ℃保存待用，或直接進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出目的片段，制備1%瓊脂糖凝膠，將目的片段點樣并跑膠，跑膠結(jié)束后在紫外燈下進(jìn)行切膠，采用DNA 純化回收試劑盒進(jìn)行膠回收，對膠回收產(chǎn)物進(jìn)行跑膠驗證，再進(jìn)行酶切、酶聯(lián)、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提，初步得到HIF-1α siRNA 和PAR1 siRNA 質(zhì)粒，再對質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠，驗證質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前，對細(xì)胞進(jìn)行全換液，待細(xì)胞密度長至60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時取3 個滅菌的EP 管，分別加入500μL無血清的DMEM，再加入質(zhì)粒和LipofectamineTM3000，混勻，室溫靜置5 min，將含有LipofectamineTM3000 的無血清DMEM 均分于已加質(zhì)粒的EP 管中，混勻，室溫靜置20 min，將EP 管中的混合液加入H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37 ℃、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后再對細(xì)胞進(jìn)行低氧（37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2）處理。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（WB）法檢測HIF-1α 和PAR1 的蛋白表達(dá)

待各處理組細(xì)胞長至對數(shù)生長期，用IP Buffer 裂解液（含0.5%NP40 并加入蛋白酶抑制劑）在4 ℃搖床裂解細(xì)胞30 min，14 000 r/min，（4 ℃）離心15 min，取上清液，按Bradford 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，加入4sample Buffer 混合，沸水浴10 min，制備8%的SDS-PAGE 膠進(jìn)行點樣電泳（分離膠80 V、20 min，濃縮膠100 V，1 h），轉(zhuǎn)膜（100 V、150 min），用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，用1 TBST 洗3 次，每次10 min，一抗包括兔抗β-actin抗體（1 ∶2 000），兔抗HIF-1α 抗體（1 ∶2 000），兔抗PAR1 抗體（1 ∶2 000），兔抗Bcl-2 抗體（1 ∶2 000），兔抗Bax 抗體（1 ∶2 000），于4 ℃搖床孵育過夜，次日用1 TBST 洗3 次，每次10 min，室溫孵育二抗山羊抗兔IgG 抗體（1 ∶1 000）1 h，再用1 TBST 洗3 次，每次10 min，顯影曝光。用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.2.5 RNA 提取和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測HIF-1α 和PAR1 的mRNA 表達(dá)

采用TRIzol 提取細(xì)胞總RNA。用Nanodrop 2000 型超微量分光光度計測量樣品總RNA 濃度，并將每個配對的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。采用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix EX TaqTM試劑盒進(jìn)行RT-PCR。GAPDH 作為HIF-1α，PAR1，Bcl-2，Bax 的內(nèi)部參考。使用FTC-3000p 型實時PCR 系統(tǒng)完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。引物見表1。

表1 引物序列

1.2.6 RNA 印跡（NB）法檢測HIF-1α 和PAR1 的RNA 水平

制備1%的瓊脂糖凝膠，將提取的總RNA 進(jìn)行點樣并電泳（120 V、20 min），分離得到的RNA 膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行15 h 轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后，將膜放在6×SSC 中浸泡5 min，以去除膜上殘留凝膠。將凝膠置紫外燈下，觀察膠塊上有無殘留的RNA，膜置80 ℃，真空干烤1 ～2 h。烤干后的膜用塑料袋密封，4 ℃保存?zhèn)溆?，進(jìn)行探針標(biāo)記和雜交，42 ℃雜交16 h 后，洗膜，顯影。

1.2.7 TUNEL 法檢測心肌細(xì)胞凋亡

分別取出常氧組、低氧組、NC 組和PAR1 組的H9c2 心肌細(xì)胞爬片，用預(yù)冷的4%多聚甲醛（PFA）在4 ℃冰箱中固定30 min，用1×PBS（pH=7.4）洗10 min，加入含有0.2% Triton-X-100 的磷酸緩沖液（PBS），冰上孵育2 min，增加細(xì)胞通透性，再加入熒光素FITC 標(biāo)記的核苷酸和脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）混合液，37 ℃避光孵育60 min，1×PBS（pH=7.4）洗3 次，每次10 min，用抗熒光淬滅封片劑封片，待封片劑干透后將載玻片置4 ℃冰箱保存，次日在熒光顯微鏡下觀察。

細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞核百分比/細(xì)胞核總數(shù)

1.2.8 MTT 法檢測細(xì)胞活力

待H9c2 心肌細(xì)胞長至對數(shù)生長期，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集于離心管，以1 000 r/min 離心5 min，用新的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種至96 孔板，接種密度為1×105，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁培養(yǎng)6 h 后進(jìn)行后續(xù)實驗處理，每組做6 個復(fù)孔，待處理結(jié)束后，每孔加入10 μL MTT 溶液（5 mg / mL），培養(yǎng)4 h，吸走培養(yǎng)液，每孔再加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），放置搖床振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，采用酶聯(lián)免疫檢測儀上光密度（OD）于490 nm 波長處檢測每孔的吸光度，吸光度最好在0 ～0.7 范圍內(nèi)。

細(xì)胞存活率（%）=（OD試驗組/OD對照組）×100%

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。至少取3 次獨立實驗結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用LSD 法，多組間比較采用單向方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧條件下對H9c2 細(xì)胞活力及凋亡的影響

對H9c2 細(xì)胞進(jìn)行常氧和低氧時間梯度（2，6，12，24 h）處理，通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與常氧組相比，低氧各組細(xì)胞形態(tài)縮小、變形，詳見圖1 A；TUNEL 染色結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧各組H9c2 細(xì)胞凋亡隨時間梯度逐漸增加，詳見圖1 B 和圖1 C；MTT 分析結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧各組H9c2 細(xì)胞的活力更差，詳見圖1 D?？梢?，低氧降低了H9c2 細(xì)胞的活力，并誘導(dǎo)了H9c2 細(xì)胞的凋亡。

2.2 HIF-1α 和PAR1 在低氧條件下H9c2 細(xì)胞中的表達(dá)情況

qRT-PCR 結(jié)果顯示，低氧條件下H9c2 細(xì)胞中HIF-1α 和PAR1 的表達(dá)上調(diào)，隨著低氧時間梯度處理有上升趨勢，詳見圖2 A。WB 結(jié)果與qRT-PCR 檢測結(jié)果一致，詳見圖2 B 及圖2 C。可見，低氧誘導(dǎo)HIF-1α和PAR1 的表達(dá)。

2.3 敲除PAR1 對低氧條件下H9c2 細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡的影響

構(gòu)建PAR1 siRNA 質(zhì)粒，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，初步驗證質(zhì)粒構(gòu)建成功，詳見圖3 A。將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將H9c2 細(xì)胞分為4 組，分別為常氧組（A 組）、常氧+siNC 組（B 組）、低氧+siNC 組（C 組）和低氧+PAR1 siRNA 組（D 組）。WB 結(jié)果顯示，與C 組比較，D 組的PRA1 顯著降低，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，詳見圖3 B 和圖3 C。通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在H9c2 細(xì)胞中敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細(xì)胞，相比于直接低氧處理H9c2 細(xì)胞，H9c2 細(xì)胞體積明顯增大，詳見圖3 D。TUNEL 染色結(jié)果顯示，在H9c2 細(xì)胞中敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細(xì)胞比直接低氧處理H9c2 細(xì)胞可明顯緩解由低氧引起的H9c2 細(xì)胞凋亡，詳見圖3 E 和圖3 F。MTT 結(jié)果顯示，在H9c2 細(xì)胞中敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細(xì)胞，比直接低氧處理H9c2 細(xì)胞可明顯提高H9c2 細(xì)胞的活力，詳見圖3 G?？梢姡贖9c2 細(xì)胞中敲除PAR1 可改善由低氧引起的H9c2 細(xì)胞體積的縮小，增強(qiáng)H9c2 細(xì)胞活力，并抑制H9c2 細(xì)胞的凋亡。

圖1 低氧條件下H9c2 細(xì)胞活力及生存變化情況

圖2 低氧條件下H9c2 細(xì)胞中HIF-1α 和PAR1 的表達(dá)情況

2.4 敲除PAR1 對低氧條件下H9c2 細(xì)胞中HIF-1α及Bcl-2/Bax 表達(dá)的影響

低氧條件下會誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞凋亡，而Bcl-2/Bax信號通道已被報道可抑制細(xì)胞凋亡。為探討低氧條件下PAR1 表達(dá)對H9c2 細(xì)胞的作用機(jī)制，將siNC 和PAR1 siRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H9c2 細(xì)胞24 h 后，對細(xì)胞進(jìn)行低氧處理6 h。通過WB 法和qRT-PCR 法檢測Bcl-2 和Bax 的表達(dá)。WB 結(jié)果顯示，Bcl-2 在低氧時表達(dá)下降，敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細(xì)胞，相比于低氧時增加了Bcl-2 的表達(dá)。而Bax 在低氧時表達(dá)增加，敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細(xì)胞，相比于低氧時又降低了Bax 的表達(dá)，詳見圖4 A。qRT-PCR 結(jié)果與WB 結(jié)果一致，與常氧組相比，低氧組Bcl-2 表達(dá)下降，Bax 表達(dá)下降上升；與C 組相比，D 組Bcl-2 表達(dá)被上調(diào)，詳見圖4 B。Bax 表達(dá)下降被下調(diào)，詳見圖4 C。結(jié)果表明，在低氧條件下，H9c2 細(xì)胞中敲除PAR1 可通過調(diào)控Bcl-2/Bax 的表達(dá)比例來抑制細(xì)胞的凋亡。

圖3 敲除PAR1 對低氧條件下H9c2 細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡及活力的影響

2.5 抑制HIF-1α 的表達(dá)對低氧條件下引起的PAR1 上調(diào)的影響

將siNC 和HIF-1α siRNA 轉(zhuǎn)染至H9c2 細(xì)胞中24 h后再低氧處理細(xì)胞6h，通過NB 法和WB 法檢測HIF-1α和PAR1 在H9c2 心肌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果見圖5 A 和圖5 B，與C 組相比，低氧+HIF-1α siRNA 組（E 組）明顯限制了由缺氧引起的PAR1 的上調(diào)，表明低氧條件下PAR1 的表達(dá)受HIF-1α 的正調(diào)控。

圖4 敲除PAR1 對HIF-1α，Bcl-2 /Bax 表達(dá)的影響

圖5 敲除HIF-1α 限制缺氧引起的PAR1 的上調(diào)

3 討論

缺氧常被用來解釋心臟功能的改變，特別是在心肌缺血的患者中，缺氧是一種常見現(xiàn)象［15］。多數(shù)研究表明，缺氧導(dǎo)致心肌缺血的致病機(jī)制非常復(fù)雜，如在輕度或中度缺氧時，大腦的能量供應(yīng)幾乎未受到損害，嚴(yán)重缺氧時會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞凋亡或死亡［16］。細(xì)胞凋亡主要是由于外源性死亡受體途徑或線粒體途徑介導(dǎo)發(fā)生［17］。因此，深入了解細(xì)胞凋亡在缺氧條件下的調(diào)控機(jī)制，可為心肌缺血的治療提供更具體的方法。

HIF-1α 是缺氧條件下參與血管生成、糖酵解代謝和細(xì)胞增殖/存活過程中調(diào)控多個基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵蛋白［18］，是一種氧依賴性被細(xì)胞內(nèi)泛素蛋白酶降解的蛋白質(zhì)［19］。其只在缺氧條件下穩(wěn)定表達(dá)，HIF-1α 積累和HIF-1β形成二聚體，二聚體激活啟動子區(qū)中含有缺氧反應(yīng)元件（HREs）的下游基因［20］。HIF-1α 在常氧時不表達(dá)，在低氧條件下高表達(dá)，且HIF-1α 表達(dá)的上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［21-22］。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α 在低氧條件下H9c2 細(xì)胞中高表達(dá)，且可誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞的凋亡，與文獻(xiàn)［23］報道一致。進(jìn)一步在低氧條件下H9c2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA，WB 和NB 檢測結(jié)果顯示，HIF-1α可正調(diào)控PAR1 的表達(dá)，表明PAR1 可能是HIF-1α 的下游。

PAR1 是一種G 蛋白偶聯(lián)的跨膜受體，為高親和力凝血酶受體［7，24］，幾乎在所有類型的血管壁細(xì)胞中表達(dá)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血小板和巨噬細(xì)胞，并參與了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［25］。本研究中通過WB 和RT -PCR 法檢測了PAR1 在低氧條件下H9c2 細(xì)胞中的蛋白和mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，PAR1 在低氧條件下高表達(dá)。同時，當(dāng)在H9c2 細(xì)胞中敲除PAR1后再低氧處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)敲除PAR1 可促進(jìn)H9c2 細(xì)胞活力和抑制細(xì)胞凋亡，并上調(diào)Bcl -2 的表達(dá)和下調(diào)Bax 的表達(dá)。Bcl -2 基因家族是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存或死亡來維持組織的發(fā)育及穩(wěn)態(tài)的，是一種新的原癌基因，即細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子［26］，其他主要通過抑制各種凋亡小體來延長細(xì)胞的存活［27］。Bax 是一種加速細(xì)胞死亡的同源蛋白，與Bcl -2 活性相反［28］。但Bcl -2 與Bax 可相互作用，在體內(nèi)形成異二聚體，Bax過表達(dá)會抑制Bcl -2 的活性，引起細(xì)胞凋亡，兩者表達(dá)的比例發(fā)生變化會直接影響細(xì)胞的生存與凋亡［29］，故Bcl -2 / Bax 信號通路是調(diào)節(jié)抗氧途徑細(xì)胞凋亡的變阻器［30］。本研究結(jié)果顯示，H9c2 細(xì)胞中敲除PAR1可影響B(tài)cl -2 與Bax 表達(dá)的比例，進(jìn)而誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，低氧條件下，HIF-1α 通過正調(diào)控PAR1的表達(dá)，進(jìn)而改變Bcl-2/Bax 的表達(dá)比例，誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為低氧條件下細(xì)胞凋亡引起的心肌缺血提供了可能的治療靶點。