黃曉燕 應雨晨

心肌細胞膜表面鈉、鉀、鈣等離子通道異常，離子通道間平衡失調(diào)、心肌電信號傳導紊亂，從而導致心律失常的發(fā)生。Kv2.1是電壓門控性鉀離子通道（voltage-gated potassium channels，Kv）的成員之一，由6個跨膜區(qū)和1個孔區(qū)組成四聚體結(jié)構(gòu)，主要介導動作電位復極化過程。Kv2.1通道廣泛表達于神經(jīng)元和心肌細胞[1-2]，是延遲整流鉀電流的主要分子基礎，抑制該電流可使復極延遲，并使動作電位時程延長。本研究旨在觀察轉(zhuǎn)錄因子Sp1對H9C2心肌細胞Kv2.1鉀通道的影響，進一步明確心律失常發(fā)生的離子機制以及Sp1的調(diào)控作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1材料和試劑DMEM購自美國Thermo scientific公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑（lipofectaminTM2000）購自美國Invitrogen公司，兔抗Kv2.1多克隆抗體購自美國Abbkine公司，膜片鉗系統(tǒng)及分析軟件為美國Axon公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 pEGFP-N2-Sp1質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)NCBI Gene數(shù)據(jù)庫獲得并合成Sp1原始序列，兩端添加有酶切位點XhoI（CTCGAG）-KpnI（GGTACC），以亞克隆方式將目的片段與pEGFP-N2載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，擴增、抽提質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證成功構(gòu)建pEGFP-N2-Sp1質(zhì)粒。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染H9C2細胞常規(guī)用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)LipofectaminTM2000說明書提供的實驗步驟，將2.5μg pEGFP-N2-Sp1質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染H9C2細胞。同時共轉(zhuǎn)染0.8μg綠色熒光蛋白pRK5-GFP以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 Western blot法檢測Kv2.1鉀通道蛋白 空質(zhì)粒和pEGFP-N2-Sp1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染H9C2心肌細胞，設立pEGFP-N2-Sp1組和對照組。收集各組細胞，加入預冷RIPA細胞裂解液。取細胞裂解上清液20μL，點樣于8%SDS-PAGE，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。兔抗Kv2.1多克隆抗體1∶500稀釋，4℃孵育過夜。二抗采用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體，1∶1 000稀釋，室溫孵育2 h，最后在化學發(fā)光系統(tǒng)中觀察拍照。

1.2.4 全細胞膜片鉗記錄法檢測Kv2.1鉀通道電流室溫（24～26℃）下采用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察Sp1對Kv2.1電流的影響。電極外液配方：60 mM NaCl，80 mM葡萄糖酸鈉，0.1 mM CaCl2，1 mM MgCl2，5 mM KCl，10 mM HEPES和10 mM葡萄糖（用NaOH將pH調(diào)至7.4）。電極內(nèi)液：0.5 mM MgCl2，30 mM KCl，110 mM葡萄糖酸鉀，10 mM EGTA，5 mM HEPES，5 mM Na2ATP和1 mM GTP-tris（用KOH將pH調(diào)至7.2）。灌注電極內(nèi)液后電極入水電阻為3～5 mΩ；刺激程序由Clampex 9.2軟件和Axon 700B放大器共同完成，信號經(jīng)過Axon 700B放大器和A/D轉(zhuǎn)換后儲存于計算機中。記錄激活電流刺激方案如下：細胞鉗制在-60 mV，測試電壓從-70 mV，以10 mV的階躍，刺激到+50 mV，持續(xù)300 ms；然后去極化到-40 mV，持續(xù)100 ms。記錄穩(wěn)態(tài)失活電流刺激方案如下：細胞鉗制在-50 mV，測試電壓以20 mV階躍從-60 mV刺激到40 mV，持續(xù)時間10 s；然后測試電壓鉗制在50 mV時記錄電流。每組采集6個細胞的穩(wěn)態(tài)失活電流數(shù)據(jù)，經(jīng)最大電流標準化，用Boltzmann方程擬合，得到半失活最大電壓V1/2和斜率因子k值。

1.3統(tǒng)計學處理 采用pCLAMP Ver.9.2軟件（Axon Instruments，California，USA）編輯刺激程序、記錄電流并分析測量原始數(shù)據(jù)。Excel和Origin7.5軟件對原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、擬合、作圖。計量資料以表示，比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Sp1對Kv2.1鉀通道蛋白表達的影響 見圖1。

注：與對照組比較，*P＜0.05

由圖1可見，空質(zhì)粒和pEGFP-N2-Sp1分別轉(zhuǎn)染H9C2心肌細胞后，pEGFP-N2-Sp1組Kv2.1通道蛋白灰度值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 Sp1對Kv2.1通道電流密度的影響 見圖2。

由圖2可見，與對照組相比，pEGFP-N2-Sp1組Kv2.1通道電流明顯增強，具有電壓依賴性。+50 mV處，對照組電流密度為（36.88±7.25）pA/pF，pEGFPN2-Sp1組為（66.05±5.42）pA/pF，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Sp1干預后電流密度增加了79.09%。

2.3 Sp1對Kv2.1通道電流激活特性的影響 見圖3。

從圖2的Kv2.1通道電流曲線圖，通過單指數(shù)方程得到激活時間常數(shù)。由圖3可見，對照組的激活時間常數(shù)在+10 mV處為（18.86±1.68）ms，而在+40 mV處變?yōu)椋?.67±0.77）ms，表明隨著細胞膜去極化程度的增加，Kv2.1通道的激活加快，Kv2.1通道激活時間常數(shù)具有電壓依賴性。Sp1干預后，通道+40 mV處pEGFP-N2-Sp1組的激活時間常數(shù)由（7.67±0.77）ms變?yōu)椋?.58±0.28）ms。

注：與對照組比較，*P＜0.05

圖3 Sp1對Kv2.1通道電流激活特性的影響

2.4 Sp1對Kv2.1通道電流失活特性的影響 見圖4。

由圖4可見，Sp1干預前后半失活最大電壓V1/2分別為（-7.96±1.07）mV和（-8.43±1.98）mV（n=6，P＞0.05），斜率因子k值分別為（9.59±1.74）mV和（11.56±1.84）mV（n=6，P＞0.05）。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子Sp1屬于Sp/KLF樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在體內(nèi)廣泛表達，具有誘導細胞增殖和分化等功能，是目前研究極為廣泛和系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子之一[3-4]。Sp1利用羧基末端3個C2H2類型的鋅指結(jié)構(gòu)作為DNA結(jié)合區(qū)域，與靶基因富含GC的區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)控其下游靶基因的表達。Sp1是腫瘤細胞的生存、增殖和侵襲過程中非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)Sp1也參與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，參與調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡、心肌纖維化、炎癥、氧化應激和血管內(nèi)皮細胞損傷、血管鈣化等多種病理生理過程[7-9]。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-374通過激活PI3K/Akt通路抑制Sp1進而抑制心肌細胞凋亡，從而對心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）發(fā)揮保護作用。Guo等[11]通過建立H9C2心肌細胞急性缺氧損傷模型，發(fā)現(xiàn)microRNA-101通過調(diào)節(jié)Sp1/survivin途徑減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷。但是，有關(guān)Sp1在心律失常中的作用，尤其是Sp1調(diào)控心肌細胞Kv2.1鉀通道的研究報道目前較少。

圖4 Sp1對Kv2.1通道電流失活特性的影響（A、B：Sp1干預前后記錄到的穩(wěn)態(tài)失活電流曲線圖；C：穩(wěn)態(tài)失活電流經(jīng)最大電流標準化，用Boltzmann方程擬合，得到穩(wěn)態(tài)失活擬合圖）

有研究顯示[12]，三氧化二砷具有心臟毒性反應，通過抑制人類ether-a-go-go相關(guān)基因（human ether-a-go-go-related gene，hERG），鉀通道轉(zhuǎn)運至細胞膜，導致獲得性長QT綜合征的發(fā)生，而苦參堿和氧化苦參堿能夠通過上調(diào)Sp1的表達，增強hERG通道活化和表達，縮短了豚鼠心室肌細胞三氧化二砷延長的動作電位持續(xù)時間。本研究發(fā)現(xiàn)Sp1能促進Kv2.1通道蛋白和電流表達增強，+50 mV處Kv2.1通道電流密度較干預前增加了79.09%?？梢奡p1能夠正向調(diào)控Kv2.1通道蛋白表達和Kv2.1通道電流。

Kv2.1通道的重要特性之一就是電壓敏感性，可被膜電位去極化而激活。既往研究表明非選擇性β受體阻滯劑卡維地洛呈濃度依賴性抑制Kv2.1通道，延緩該通道的激活，加快滅活過程，并且Kv2.1通道外前庭的Y380和K356位點的突變能明顯消除這種抑制作用[13]。本研究表明隨著細胞膜去極化程度的增加，Kv2.1通道的激活加快，Kv2.1通道激活時間常數(shù)具有電壓依賴性，并且Sp1減少了Kv2.1通道的激活時間常數(shù)，加快了該通道的激活過程。Kv2.1通道是失活相對較慢的一種鉀離子通道。本研究發(fā)現(xiàn)當測試電壓＞-60 mV，Kv2.1通道逐漸失活，當電壓＞+20 mV時，該通道基本失活。Sp1干預后半失活最大電壓和斜率因子無差異，表明Sp1未能影響Kv2.1通道的穩(wěn)態(tài)失活性質(zhì)。

已知心肌細胞膜表面鈉、鉀、鈣等離子通道電流的異常改變是導致各種心律失常發(fā)生的最重要因素。Sp1作為基本轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)控離子通道變化，影響動作電位的發(fā)生，從而發(fā)揮抗心律失常作用。本研究通過對Sp1調(diào)控Kv2.1鉀通道的探討，為今后進一步研究心律失常發(fā)生的離子機制以及Sp1的調(diào)控作用，提供了有用的前期實驗依據(jù)。