鄭展雄 張祥宇 江力勤 張冉

雷諾嗪（raolazine，Ran）為晚鈉電流特異性阻滯劑，急性心肌缺血缺氧時可減少心肌細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度，減緩心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減輕心肌細(xì)胞損傷，為新型抗心絞痛藥物。大量研究表明，Ran具有濃度依賴性多種離子通道電流阻滯效應(yīng)，可抗快速性室性心律失常，但對影響心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)及小分子物質(zhì)細(xì)胞間交換的縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）鮮有報道。本實驗通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支制作大鼠急性心肌梗死模型，尾靜脈注射Ran，觀察Ran對急性心肌梗死早期心室肌Cx43的影響，并探討可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物50只清潔級健康雄性SD大鼠，體重250～350 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供[許可證號SCXK（蘇）2001-0003]，實驗動物相關(guān)操作符合浙江省實驗動物管理辦法要求。大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組，每組10只：假手術(shù)組，不結(jié)扎冠狀動脈左前降支，注射0.9%氯化鈉溶液2.5 mL/kg；對照組，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，注射0.9%氯化鈉溶液2.5 mL/kg；Ran低濃度組、中濃度組及高濃度組，均結(jié)扎冠狀動脈左前降支，分別注射Ran 0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、5 mg/kg。

1.2試劑及儀器 雷諾嗪（美國Sigma公司，批號：093M4708V），Cx43一抗（美國Santa公司，批號：D0313），p-Cx43一抗（美國Santa公司，批號：12811），戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號：20141010），0.9%氯化鈉溶液（杭州民生制藥，批號：C1409252），肝素鈉注射液（上海信宜制藥，批號：110903），熒光抗體二抗試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司，批號：H120141008），Western blot免疫印記套裝（上海哈靈生物科技有限公司，批號：017140yjj），膜蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0033）。精密手術(shù)器械一套（上海醫(yī)療器械廠），大鼠手術(shù)臺，6/0縫線，小型動物呼吸機（成都泰盟軟件有限公司，型號：HX-101E），BL-420/820生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司），臺式小型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：5417R），組織高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：XHF-D），蛋白電泳/轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-RaD公司，型號：Mini-PROTEAN Tetra Cell），全波長讀數(shù)儀/酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司，型號：Multiskan GO），正置熒光生物顯微系統(tǒng)（德國Zeiss公司，型號：Axio Imager2），電子分析天平（瑞士Mettler-Tloledo公司，型號：MS403s/MS204s），脫色搖床（江蘇金壇儀器廠，型號：TY-80B），-86℃超低溫冰箱（中國海爾集團，批號：DW-86L388），-25℃醫(yī)用冰箱（中國海爾集團，批號：DW-25W388）。

1.3方法

1.3.1 造模（1）麻醉：大鼠稱重，3%戊巴比妥鈉2.5 mL/kg腹腔注射，待大鼠腱反射消失后仰臥位固定，全身肝素化。（2）氣管插管連接呼吸機：備毛，分離氣管，從甲狀軟骨下氣管軟骨環(huán)切開氣管，用自制內(nèi)徑2 mm、長5 cm的氣管導(dǎo)管從環(huán)狀軟骨下2～3個軟骨環(huán)下插入，深度1 cm。連接小動物呼吸機，潮氣量6 mL/kg，頻率80次/min，吸呼比1∶2。（3）結(jié)扎冠狀動脈左前降支：常規(guī)消毒，每組分別尾靜脈單次注射0.9%氯化鈉溶液2.5 mL/kg、Ran 0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、5 mg/kg，10 min后，連接大鼠肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，沿左鎖骨中線縱行切開皮膚，在第4～5肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓，擠出心臟。選擇在左心耳和肺動脈圓錐之間，距離冠狀動脈起始處2～3 mm，以6/0無損傷逢合針結(jié)扎冠狀動脈左前降支；將心臟回納入胸腔，閉合胸腔，觀察心電圖1～5 min，ST段明顯抬高，為造模成功[1-2]。

1.3.2 多導(dǎo)生物機能系統(tǒng)記錄大鼠心電圖 自制電極插入大鼠四肢皮下，連接肢體導(dǎo)聯(lián)電極，記錄2 h內(nèi)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，參數(shù)設(shè)置：紙速250 mm/s，增益10 Hz，電壓0.05 V。用Lambeth規(guī)則分析心電圖，采用steaer SE評分系統(tǒng)對2 h內(nèi)快速性室性心律失常發(fā)生情況進行評分，測量各組2 h內(nèi)Ⅱ?qū)?lián)心率、Tp-e間期、Q-Tc間期、Tp-e/Q-Tc比值。

1.3.3 免疫熒光染色和激光共聚焦掃描成像2 h后，處死大鼠，取心臟標(biāo)本，每組隨機取4個標(biāo)本，取結(jié)扎處近端心室肌組織石蠟包埋，切片，厚度2μm，75℃烤箱放置1 h，二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗?？乖迯?fù)液95～97℃水浴加熱20 min。自然冷卻后0.03%過氧化氫室溫孵育30 min。蒸餾水沖洗1次，PBS沖洗5 min×3次。3%大牛血清封閉液（PBS稀釋），室溫20 min。滴加一抗（1∶200）。4℃過夜，37℃復(fù)溫30 min，PBS沖洗5 min×3次。滴加熒光素標(biāo)記的二抗（1∶200），37℃孵育1 h。PBS沖洗5 min×3次?？光缒z封片，光鏡下觀察Cx43分布情況，紅色熒光顆粒為Cx43表達陽性染色。每個標(biāo)本連續(xù)取4張切片，每張切片隨機選取6個視野，采用免疫熒光半定量法檢測Cx43總表達量，觀察Cx43細(xì)胞表面分布情況。采用Image J圖像分析軟件測定光密度值。

1.3.4 Western-Blot法檢測心肌組織磷酸化Cx43（p-Cx43）含量 每組取6個標(biāo)本，取冠狀動脈左前降支結(jié)扎處近端心室肌組織心臟剪碎片；20 mg/200μL裂解液勻漿20 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，BCA蛋白定量，100℃沸水煮沸5 min，冰上驟冷，3 000 r/min離心1 min。上樣，電泳，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜70 min。5%BSA室溫封閉2 h，TBST洗膜5 min×3次。加入封閉液稀釋的p-Cx43（1∶200），GAPDH（1∶2 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗（1∶2 000）和HRP標(biāo)記的羊抗大鼠二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。TBST洗膜15 min×5次?；瘜W(xué)發(fā)光檢測試劑反應(yīng)2 min。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠快速性室性心律失常評分結(jié)果比較見表1。

表1各組大鼠快速性室性心律失常評分結(jié)果比較

由表1可見，對照組大鼠較假手術(shù)組心律失常評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低濃度組、中濃度組、高濃度組大鼠較對照組心律失常評分降低，中濃度組、高濃度組大鼠較低濃度組心律失常評分降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2各組大鼠心率、Tp-e間期及Tp-e/Q-Tc間期比較 見表2。

由表2可見，假手術(shù)組大鼠心率較對照組加快，Tp-e/Q-Tc降低，Tp-e間期、Q-Tc間期縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。對照組大鼠Tp-e/Q-Tc較假手術(shù)組、低濃度組、中濃度組、高濃度組升高（均P＜0.05），后3組之間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組大鼠Q-Tc間期較低濃度組、中濃度組、高濃度組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），但后3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。2.3各組大鼠心肌組織p-Cx43/GAPDH、Cx43熒光半定量值及鈣離子濃度比較 見表3、圖1。

圖1 p-Cx43電泳條帶圖

由表3、圖1可見，對照組大鼠心肌組織p-Cx43/GAPDH、Cx43表達量與假手術(shù)組、低濃度組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但較中濃度組、高濃度組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；對照組大鼠心肌組織鈣離子濃度較假手術(shù)組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與低濃度組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中濃度組較低濃度組降低，高濃度組較中濃度組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4各組大鼠心肌組織染色結(jié)果 見插頁圖2。

圖2各組大鼠心肌組織染色圖（A：假手術(shù)組，B：對照組，C：低度濃度組，D：中度濃度組，E：高度濃度組；HE染色，×40）

由圖2可見，假手術(shù)組心室肌細(xì)胞排列整齊、無變性、無間質(zhì)無水腫。對照組心室肌細(xì)胞空泡樣變性、細(xì)胞核消失，細(xì)胞間排列紊亂、間質(zhì)水腫、細(xì)胞間連接模糊不清或消失，部分細(xì)胞破裂。低濃度組心室肌細(xì)胞空泡樣變性較對照組無明顯改變、細(xì)胞核較對照組無明顯改變；細(xì)胞間排列紊亂較對照組無明顯改變，細(xì)胞間質(zhì)水腫、連接模糊不清或消失較對照組無明顯改變，細(xì)胞破裂化較對照組無明顯改變。中濃度組心室肌細(xì)胞腫脹，無空泡樣變性，心室肌細(xì)胞核完整，心肌細(xì)胞排列稍紊亂、細(xì)胞間質(zhì)水腫較輕、心室肌細(xì)胞連接可見，心肌細(xì)胞無破裂。高濃度組心室肌細(xì)胞腫脹較對照組明顯改變、細(xì)胞核完整，心肌細(xì)胞排列規(guī)則、間質(zhì)輕度水腫。

表2各組大鼠心率、Tp-e/Q-Tc、Tp-e間期及Q-Tc間期比較

表3各組大鼠心肌組織p-Cx43/GAPDH、Cx43熒光半定量值及鈣離子濃度比較

2.5各組大鼠梗死區(qū)心室肌Cx43細(xì)胞表面分布見插頁圖3。

圖3各組大鼠梗死區(qū)心室肌Cx43表面分布（A：假手術(shù)組，B：對照組，C：低度濃度組，D：中度濃度組，E：高度濃度組；免疫熒光染色，×200）

由圖3可見，假手術(shù)組心室肌Cx43分布在細(xì)胞端-端連接處，排列規(guī)則。對照組心室肌Cx43表達量較假手術(shù)組明顯減少，細(xì)胞表面分布不均勻，較假手術(shù)組心室肌細(xì)胞側(cè)面分布明顯增多。低濃度組心室肌Cx43表達量較對照組未見差異，較假手術(shù)組明顯減少，分散在細(xì)胞兩側(cè)，心室肌細(xì)胞端-端連接處分布較少。中濃度組心室肌Cx43表達量較假手術(shù)組減少，細(xì)胞表面分布不均勻，表達量較對照組明顯上升。高濃度組心室肌Cx43表達量較假手術(shù)組減少，分布主要集中在細(xì)胞端-端，排列不規(guī)則，Cx43表達量較對照組、低濃度組明顯上升。

3 討論

NaV1.5是細(xì)胞表面主要的電-門控性鈉離子通道蛋白，在閏盤處選擇性存在，細(xì)胞缺血缺氧時，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，氧化損傷加重，NaV1.5損傷加重。晚鈉電流（late sodium current，INaL）主要存在于心室肌中層細(xì)胞，由Nav1.5通道蛋白介導(dǎo)，正常心室肌INaL只占鈉電流（INa）的0.1%～1%。病理條件下INaL增加，舒張期Na+-Ca2+交換增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放，M細(xì)胞動作電位時程延長，產(chǎn)生遲后除極，導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常。Ran為INaL阻滯劑，在減輕心肌缺氧損傷的同時，可抗心律失常。

Pezhouman等[3]用特異性INaL通道阻滯劑阻滯心室肌INaL15min后室性心律失常的發(fā)生顯著減少，阻滯劑消耗后快速性室性心律失常發(fā)生率增加。Samue等[4]在索他洛爾誘導(dǎo)的兔尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速模型中證實Ran對INaL阻滯效應(yīng)具有濃度依賴性，低劑量時對兔離體心肌電生理影響不明顯，高劑量明顯延長心室肌動作電位時程，降低早后除極和尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速的發(fā)生率。本實驗顯示，低劑量Ran對急性心肌梗死大鼠的快速性室性心律失常評分無顯著影響，中、高劑量Ran可明顯降低快速性室性心律失常評分，提示Ran的抗心律失常作用可能與Ran的有效血藥濃度相關(guān)。各組大鼠心率無顯著差異，與大量實驗報道的Ran對心率影響不顯著相符。Ran干預(yù)后Q-Tc間期無明顯變化，提示Ran不顯著延長Q-Tc間期，但本實驗觀察到Tp-e間期、Tp-e/Q-Tc比值不同濃度Ran組較對照組降低，且效應(yīng)與Ran濃度呈正相關(guān)。

Ran可特異性抑制病理條件下M細(xì)胞的INaL，抑制心肌細(xì)胞的Na+-Ca2+交換，減緩心肌細(xì)胞缺氧時細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載。本實驗顯示梗死區(qū)心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，高、中濃度組心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，可能與Ran有效抑制INaL，降低心肌組織鈣離子濃度相關(guān)[5]。

大鼠心室肌主要表達Cx43，半衰期為1～1.5 h，主要分布于心室肌細(xì)胞之間的閏盤處，呈條帶狀規(guī)則排列，在心肌細(xì)胞膜側(cè)面分布極少。病理條件下Cx43發(fā)生異質(zhì)性，表現(xiàn)為Cx43表達降低、去磷酸化、細(xì)胞表面排列非均勻化、側(cè)面化。Cx43表達降低合并細(xì)胞表面分部非均勻化，可導(dǎo)致心肌組織間電傳導(dǎo)的各向異性，降低心肌細(xì)胞間電傳導(dǎo)速度，Cx43去磷酸化后活性降低，細(xì)胞間電傳導(dǎo)速度降低。Sato等[6]研究證實Cx43重構(gòu)可通過導(dǎo)致心肌動作電位時程的變化、各向異性傳導(dǎo)、傳導(dǎo)的減慢等，增加心律失常易感性。我們在前期實驗中證實，胺碘酮聯(lián)合Ran對急性心肌梗死大鼠心室肌細(xì)胞起到一定的電穩(wěn)定作用[7]。Indra等[8]通過轉(zhuǎn)染Cx43E42K基因到健康小鼠胚胎，制作小鼠無功能性表達Cx43猝死模型，觀察到胚胎期Cx43+/E42K小鼠心室肌電生理易被干擾，未觀察到胚胎的結(jié)構(gòu)缺陷，但胚胎易死亡。Cx43和NaV1.5均為細(xì)胞膜表面的重要蛋白。Agullo-Pascual等[9]的研究提示鈉離子通道蛋白在細(xì)胞膜表面的分布依賴Cx43，Cx43和Nav1.5在細(xì)胞表面通過橋粒連接相互作用。Wang等[10]采用具有穩(wěn)定微管蛋白作用的紫杉醇干預(yù)心肌缺血再灌注的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)紫杉醇可以顯著增加Cx43的表達，減少側(cè)面化，減少動作電位時程，減少缺血性室性心律失常的發(fā)生。Zhang等[11]敲除心房肌細(xì)胞（HL-1細(xì)胞）表面橋?；蚝驝x43/Nav1.5表達量降低，鈉離子電流減少，HL-1細(xì)胞的傳導(dǎo)電壓降低，致命性心律失常發(fā)生率降低。Waring等[12]敲除Cx43基因?qū)е骡c離子電流的減少與Nav1.5的減少呈正相關(guān)，重新導(dǎo)入羧基端基因或敲除301位到361位之間的氨基酸序列后鈉離子電流恢復(fù)。證實Cx43與鈉離子電流密切相關(guān)。Luqia等[13]用Kir2.1、NaV1.5和Cx43基因編碼的病毒轉(zhuǎn)染心臟纖維母細(xì)胞后心臟纖維母細(xì)胞具有產(chǎn)生和傳播動作電位的能力。

本實驗顯示，與假手術(shù)組相比，對照組Cx43、p-Cx43表達量明顯下降，Ran干預(yù)后表達量較對照組上升，表明Ran對Cx43、p-Cx43具有保護作用，可延緩Cx43、p-Cx43的降解；Ran對Cx43細(xì)胞表面分布側(cè)面化具有延緩作用，這種作用與Ran濃度呈正相關(guān)。Ran減緩Cx43的降解，降低Cx43側(cè)面化程度，降低Cx43磷酸化，可能與Ran阻滯INaL，降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，穩(wěn)定Nav1.5蛋白，穩(wěn)定Cx43和NaV1.5連接相關(guān)。具體機制還有待進一步實驗探究。