李萬奎，石春健

(1.河南圣德醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 信陽 464000；2.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)部，河南 信陽 464000)

腦卒中具有較高的致殘率、死亡率及復(fù)發(fā)率，已成為我國居民第一位的死亡原因[1]，其中缺血性腦血管疾病占腦卒中的60%～70%，嚴(yán)重危害人民身體健康。隨著目前診療技術(shù)的提高，通過靜脈或動(dòng)脈溶栓及機(jī)械開通，已成為挽救缺血腦組織的重要措施之一，可在很大程度上促進(jìn)缺血性腦血管疾病神經(jīng)功能的恢復(fù)[2]，但缺血再灌注損傷卻是其不可避免的并發(fā)癥。研究表明，缺血再灌注可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致其形態(tài)和功能發(fā)生變化[3]，而內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷是心腦血管疾病的早期病理變化基礎(chǔ)[4]。細(xì)胞受損后引發(fā)的氧化應(yīng)激亦起重要作用，可觸發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡和神經(jīng)功能障礙[5]。

阿托伐他汀鈣是臨床治療及預(yù)防缺血性腦血管疾病的一線藥物，不僅能降低血脂，穩(wěn)定斑塊，而且能改善血管內(nèi)皮功能和抗氧化應(yīng)激[6]。本研究通過缺血再灌注制作人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)損傷模型，采用四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazoliun，MTT)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活力測定反應(yīng)細(xì)胞的增殖活力及損傷程度，檢測上清液丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)來分析各組HUVEC氧化應(yīng)激狀態(tài)，探討阿托伐他汀鈣對缺血再灌注誘導(dǎo)HUVEC損傷和氧化應(yīng)激的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1.1藥物 阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司，胰蛋白酶購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，LDH、MDA、T-AOC、SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3實(shí)驗(yàn)對象 健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠12只，雌雄不限，體質(zhì)量為250～300 g，許可證號(hào)為SCXK(豫)2017-0001，由信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究方案由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，所有試驗(yàn)均遵照GB 14925-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理原則。臍帶數(shù)根，來自河南圣德醫(yī)院婦產(chǎn)科，所有臍帶均經(jīng)過孕婦及家屬知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HUVEC的培養(yǎng)、鑒定及傳代 依據(jù)文獻(xiàn)方法[7]及本人前期研究，無菌條件下將健康產(chǎn)婦臍帶的靜脈內(nèi)血液沖洗干凈，注入提前預(yù)熱37 ℃，2.5 g·L-1的胰蛋白酶，置于37 ℃環(huán)境孵育10 min，收集消化液與沖洗液，終止消化后離心，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種于100 mL培養(yǎng)瓶，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)成功的HUVEC經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)鑒定證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。將HUVEC進(jìn)行傳代，采用生長良好的3～4代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)研究。

1.2.2含藥血清制備 健康成年SD大鼠12只，以隨機(jī)數(shù)表法分為阿托伐他汀鈣高劑量組、阿托伐他汀鈣低劑量組、缺氧模型組及空白對照組，每組3只。模擬人類用藥方法及參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，阿托伐他汀鈣高劑量組大鼠3只均以0.1 g·L-1阿托伐他汀鈣溶液2 mL灌胃，阿托伐他汀鈣低劑量組大鼠3只均以0.05 g·L-1阿托伐他汀鈣溶液2 mL灌胃，缺氧模型組及空白對照組各3只以蒸餾水2 mL灌胃。所有大鼠均灌胃3 d，于最后一次給藥后2 h無菌條件下取腹主動(dòng)脈血，將同一組血液混合，離心分離血清，經(jīng)56 ℃滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3模擬缺血再灌注模型的制作 按照文獻(xiàn)[9]的方法改進(jìn)，制作模擬缺血再灌注模型，將培養(yǎng)液換成無糖DMEM培養(yǎng)基，置于缺氧環(huán)境(體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和體積分?jǐn)?shù)為95%的N2，37 ℃)30 min后，再換成普通培養(yǎng)基，恢復(fù)常氧環(huán)境(體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和空氣，37 ℃)培養(yǎng)4 h。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組及處理 取生長良好的傳代培養(yǎng)的HUVEC，將細(xì)胞分為4組，分別為空白對照組、缺氧模型組、阿托伐他汀鈣高劑量組、阿托伐他汀鈣低劑量組。每組重復(fù)10個(gè)復(fù)孔。分別給予阿托伐他汀鈣高低劑量組口服相應(yīng)劑量藥物大鼠血清的DMEM培養(yǎng)液，給予空白對照組和缺氧模型組未給藥物大鼠血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，除空白對照組外(給予DMEM培養(yǎng)液常氧培養(yǎng))，再給予各組無糖DMEM培養(yǎng)基缺氧培養(yǎng)30 min，換普通DMEM培養(yǎng)液再常氧培養(yǎng)4 h，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1MTT法測定細(xì)胞增殖活力 處理完各組HUVEC后，加入MTT(5 g·L-1)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，低速震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm測量各孔吸光值，結(jié)果以光密度(optical density，OD)值表示。

1.3.2LDH外漏的測定 處理完各組HUVEC后，取出培養(yǎng)的細(xì)胞，吸取各組培養(yǎng)液，按LDH測定試劑盒說明書方法測定LDH的活性。

1.3.3氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 處理完各組HUVEC后，取出培養(yǎng)的細(xì)胞，吸取各組培養(yǎng)液，分別按MDA、SOD及T-AOC測定試劑盒說明書方法測定MDA水平、SOD的活性及T-AOC水平。

2 結(jié)果

2.1 對增殖活力及LDH外漏的影響缺氧模型組OD值低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LDH外漏高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。阿托伐他汀鈣高、低劑量組OD值高于缺氧模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，LDH外漏低于缺氧模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 阿托伐他汀鈣對缺血再灌注誘導(dǎo)損傷的HUVEC增殖活力及LDH外漏的影響

2.2 對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響缺氧模型組MDA水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SOD活性低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T-AOC低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。阿托伐他汀鈣高、低劑量組MDA水平低于缺氧模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；SOD活性高于缺氧模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；T-AOC高于缺氧模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 阿托伐他汀鈣對缺血再灌注誘導(dǎo)損傷的HUVEC氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

3 討論

腦缺血再灌注后會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，并可產(chǎn)生過多的氧自由基，進(jìn)一步加重腦缺血病理改變。宋寧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注大鼠腦組織MDA水平升高，SOD活力降低，提示腦缺血再灌注可激活體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成腦組織損傷。阿托伐他汀鈣可較好地保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞及抗氧化，有效地阻斷氧化應(yīng)激級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少分子和細(xì)胞的損傷[11]。阿托伐他汀鈣對缺血性卒中具有調(diào)脂以外的抗氧化應(yīng)激作用，對改善急性缺血性卒中患者的預(yù)后具有重要作用[12]。

研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞是缺血再灌注損傷中重要的靶細(xì)胞，是損傷的始發(fā)因素[13]。缺血再灌注后，氧自由基通過損傷內(nèi)皮細(xì)胞膜，引起脂質(zhì)過氧化和級(jí)聯(lián)反應(yīng)，蛋白質(zhì)和核酸變性，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能和酶的功能改變，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷[14]。MTT法是檢測細(xì)胞損傷程度的常用方法，作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，其OD值可反映細(xì)胞的增殖活力[15]。LDH是機(jī)體能量代謝中重要的酶，在細(xì)胞膜完整性破壞、通透性增加時(shí)，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性，可反映細(xì)胞膜損傷程度[16]。MDA是氧自由基攻擊細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸的最終產(chǎn)物，其水平可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[17]。T-AOC是機(jī)體內(nèi)總抗氧化體系的總稱，可分為酶促防御系統(tǒng)及非酶促防御系統(tǒng)[18]。SOD是酶促防御系統(tǒng)中最重要的一種，是生物體內(nèi)專一清除超氧陰離子的特異性抗氧化酶[19]。因此，T-AOC及SOD活力的高低可反映機(jī)體抗氧化能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧模型組HUVEC的OD值降低，LDH外漏升高，MDA水平升高，SOD活性降低，T-AOC降低，說明缺血再灌注損傷抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活力，增加了血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度，激活了體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。王紅芹等[20]研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)HUVEC缺氧復(fù)氧后，細(xì)胞活性下降，細(xì)胞內(nèi)MDA、活性氧增多，LDH漏出率增高，與本研究一致。而阿托伐他汀鈣高、低劑量組HUVEC的OD值升高，LDH外漏不同程度降低，MDA水平不同程度降低，SOD活性及T-AOC不同程度升高，上述作用隨藥物劑量增加呈增強(qiáng)趨勢。這說明阿托伐他汀鈣可改善缺血再灌注損傷細(xì)胞的增殖活力，減輕細(xì)胞的損傷程度，降低氧自由基的損傷，提高抗氧化能力，從而有效地保護(hù)缺血再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。