阿依江·哈拜克，王曉梅，閆 冬，李 敏，帕麗達(dá)·阿不力孜

新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)[1]。對(duì)于AD的發(fā)病機(jī)制目前有諸如氧化應(yīng)激假說(shuō)[2]、線粒體損傷學(xué)說(shuō)[3]、Aβ毒性學(xué)說(shuō)等等[4]，并且發(fā)現(xiàn)Aβ沉積，神經(jīng)炎癥的發(fā)生，氧化應(yīng)激都會(huì)引起線粒體損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[5,6]，因此，線粒體損傷通路與多種學(xué)說(shuō)交叉，研究意義至關(guān)重要。

阿里紅(FomesoffcininalisAmes，F(xiàn)OAPs)為多孔菌科藥用層孔菌的干燥子實(shí)體。阿里紅多糖作為阿里紅主要有效成分之一具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效[7,8]。課題組前期將阿里紅多糖經(jīng)DEAE纖維素-52，Sepharose CL-6B和葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析分離純化得到兩種多糖組分FOAPs-a與FOAPs-b[9]。本課題組一直著力于阿里紅多糖對(duì)AD線粒體靶向性治療的研究，發(fā)現(xiàn)在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中，阿里紅多糖給藥組相對(duì)于模型組具有顯著改善線粒體損傷的作用，包括ATP含量和線粒體膜電位MMP上升，ROS含量下降，線粒體內(nèi)細(xì)胞色素含量C回升等，表明，阿里紅多糖對(duì)AD模型中，線粒體損傷通路和氧化應(yīng)激損傷均具有一定程度的改善作用，本實(shí)驗(yàn)擬從Aβ25-35與PC12細(xì)胞的線粒體熒光共定位角度出發(fā)[10-12]，探討阿里紅多糖組分FOAPS-a和FOAPs-b可通過(guò)參與Nrf2氧化還原信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)PC12細(xì)胞線粒體損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；阿里紅多糖組分(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天藥生藥教研室提取自用)；Aβ25-35蛋白(Genscript，南京)；FBS胎牛血清(Hyclone公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，公司)；雙抗(Hyclone 公司)；鹽酸多奈哌齊(Sigma公司)，F(xiàn)AM-Aβ25～35熒光(Genscript，南京)；Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；COXIV(Proteintech,武漢)；ROS檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)；兔多抗Bcl-2抗體(Genetex公司)、兔多抗Bax抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、兔多抗Nrf2(Absin，Abs130481)、兔多抗P-ASK1(Absin，Abs131102)、兔多抗ASK1(美國(guó)Cell signaling，批號(hào)8662)、兔單克隆抗GAPDH抗體(美國(guó)Abcam公司，Ab8245)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；SWCJ2F超凈臺(tái)(AIRTECH公司)；IX71～12FL/PH 倒置熒光研究級(jí)三目顯微鏡(日本Olympus公司)；721BR13868凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(FACSAriall，北京Scotsman公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物處理

1.3.1.1 Aβ25-35寡聚體的制備及實(shí)驗(yàn)條件的選擇

稱(chēng)取藥物Aβ25-351 mg，用471.6 μL溶劑水溶解成濃度為2 mM的母液待用，母液于-20 ℃保存;分裝Aβ25-35母液，在使用前取適量于37 ℃震蕩孵育8天，使多肽聚集。

1.3.1.2 FOAPs-a及FOAPs-b溶液的制備與實(shí)驗(yàn)條件的選擇

采用水提醇沉法提取阿里紅粗多糖，經(jīng)DEAE纖維素-52，Sepharose CL-6B和葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析對(duì)粗多糖進(jìn)行純化得到均一多糖組分FOAPs-a，F(xiàn)OAPs-b[9]，平均分子量分別為199和87 kDa。用DMEM培養(yǎng)基充分溶解，PC12細(xì)胞干預(yù)時(shí)用不含血清的培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.3.2 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)和分組

按照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的給藥及損傷的濃度和時(shí)間，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞以1× 104個(gè)/孔接種至96孔板，在培養(yǎng)箱孵育24 h，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到75%左右時(shí),分為空白組(只加培養(yǎng)液)、模型組(加入40 μmol/L Aβ25-35)、陽(yáng)性藥物組(50 μmo/L鹽酸多奈哌齊)、高、中、低濃度的 FOAPs-a及FOAPs-b干預(yù)組(各50、100、200 μg/mL)等。

1.3.3 細(xì)胞爬片免疫熒光單標(biāo)實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 細(xì)胞處理

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-12細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到105個(gè)/mL，接入六孔板，每孔2 mL細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)空白孔，37 ℃培養(yǎng)24 h，棄上清，分正常組(加不含血清的培養(yǎng)基)；模型組(40 μmol/L FAM-Aβ25-35)；給藥組(加入DMEM配置的200 μg/mL FOAPs-a/b應(yīng)用液處理2 h，再加FAM-40 μmol/L Aβ25-35共同孵育培養(yǎng)48 h。

1.3.3.2 免疫熒光

將細(xì)胞玻片用PBS浸洗3 min×3次；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗；0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min；PBS浸洗，吸水紙吸干，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸干，不洗，滴加足量一抗(稀釋比1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST 浸洗吸干，滴轉(zhuǎn)移暗處，加熒光二抗(稀釋比1∶100)，37 ℃孵育1 h，PBST浸洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min進(jìn)行染核，PBST 浸洗5 min×4次，吸水紙吸干，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡采集圖像。

1.3.3 活性氧自由基ROS檢測(cè)

收集細(xì)胞，按照DCFH-DA細(xì)胞ROS檢測(cè)試劑盒操作：按照1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，體積；棄PBS加入稀釋好的DCFH 1 mL；37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，每隔3 min混勻一次；用無(wú)血清培養(yǎng)基體積洗滌細(xì)胞3次。1 500 rpm，5 min離心，棄上清，加PBS重懸；流式細(xì)胞儀機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 Western blotting檢測(cè)Bcl-2、Bax、Nrf2、APK1及P-APK1的蛋白表達(dá)量

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞以(2×105個(gè)/孔)接種到6孔板中，分組方法同上。24 h后用預(yù)冷的PBS洗三遍，收集細(xì)胞離心，并加入適當(dāng)?shù)腞IPA裂解液吹打混勻，在冰上靜止30 min左右，裂解完全后，4 ℃、12 000 rpm離心12 min，取上清即為提總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，經(jīng)過(guò)煮蛋白、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗：兔多抗Bcl-2抗體(1∶1 000)，兔多抗Bax抗體(1∶1 000)，兔多抗Nrf2(1∶1 000)，兔多抗P-ASK1(1∶ 1 000)，兔多抗ASK1(1∶1 000)，兔單克隆抗GAPDH抗體(1∶1 000)過(guò)夜、用1×TBST洗膜三次后，室溫孵育AP標(biāo)記二抗(1∶1 000)1 h、顯色液顯色，條帶出現(xiàn)后定影終止，對(duì)目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶進(jìn)行總灰質(zhì)分析。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 熒光探針追蹤A β25-35在線粒體中的表達(dá)結(jié)果

如圖圖1A和1B：與空白組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱，且出現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光,綠色和紅色熒光疊加出現(xiàn)黃色熒光，表明Aβ25-35與線粒體共定位；觀察單個(gè)PC12細(xì)胞周邊熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明線粒體的完整性受到影響，細(xì)胞核形態(tài)畸形；與模型組相比，在200 μg/mL FOAPs-a 和FOAPs-b預(yù)處理PC12細(xì)胞后，細(xì)胞核形態(tài)趨于正常，Aβ25-35的綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度與綠色熒光強(qiáng)度的比值IOD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1C)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下的熒光共定位結(jié)果

2.2 活性氧自由基ROS含量檢測(cè)結(jié)果

活性氧自由基ROS檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組細(xì)胞中ROS沉積量明顯增加；與模型組比較，各濃度的FOAPs-a及FOAPs-b均能顯著降低ROS的含量，且具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組顯示鹽酸多奈哌齊(DHCL)具有良好的抗Aβ25-35誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用；FOAPs-a和FOAPs-b在濃度50、100和200 μg/mL時(shí)，均具有良好的抗氧化應(yīng)激的作用，但仍未恢復(fù)到陽(yáng)性對(duì)照鹽酸多奈哌齊(DHCL)的影響水平(P<0.05,圖2)。

圖2 檢測(cè)阿里紅多糖組分對(duì)PC12細(xì)胞ROS的影響

2.3 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

如圖3 Western blotting結(jié)果顯示：與空白組比較，Aβ25-35誘導(dǎo)的模型組細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著性下降，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)量則明顯增加，即Bcl-2/Bax的相對(duì)表達(dá)率下降(如圖4所示)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，不同濃度的FOAPs-a及FOAPs-b均能顯著增加Bcl-2的表達(dá)量，同時(shí)顯著降低Bax蛋白的表達(dá)水平，并具有濃度依賴性，結(jié)果表明，F(xiàn)OAPs-a及FOAPs-b可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡因子對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，且FOAPs-a比FOAPs-b的調(diào)控能力更好。

圖3 不同處理組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況

圖4 不同處理組Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量(Bcl-2/Bax)統(tǒng)計(jì)柱狀圖

2.3.2 Nrf2、ASK1和P-ASK1的表達(dá)

為了觀察阿里紅多糖組分保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗Aβ25-35引起的氧化應(yīng)激和線粒體損傷的作用機(jī)制可能是ASK1凋亡途徑激活Nrf2信號(hào)通路。以50、100、200 μg/mL阿里紅多糖組分FOAPs-a和FOAPs-b對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理2 h后，再加入40 μmol/L Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2和ASK1的蛋白表達(dá)水平及ASK1蛋白的去磷酸化程度，結(jié)果顯示(圖5)：與空白組比較，40 μmol/L Aβ25-35處理組中細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1(APK1)蛋白表達(dá)量增加，APK1的磷酸化水平升高，Nrf2被激活；與模型組比較，50、100、200 μg/mL的FOAPs-a及100、200 μg/mL FOAPs-b干預(yù)后，ASK1蛋白含量顯著下降，ASK1的磷酸化水平也下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)，50 μg/mL FOAPs-b干預(yù)后，蛋白表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與此同時(shí)，Nrf2的蛋白表達(dá)量顯著增加，且呈現(xiàn)濃度依賴性，表明阿里紅多糖組分FOAPs-a和FOAPs-b可以通過(guò)ASK1凋亡途徑激活Nrf2信號(hào)通路拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激和線粒體損傷，且高劑量FOAPs-a和FOAPs-b干預(yù)可以發(fā)揮更強(qiáng)的抗氧化和抗細(xì)胞凋亡作用。

圖5 不同處理組Nrf2、ASK1和P-ASK1蛋白表達(dá)情況

圖6 不同處理組Nrf2、ASK1和P-ASK1蛋白平均光密度值比值(與GAPDH)統(tǒng)計(jì)柱狀圖

3 討論

在生理情況下，線粒體在人體功能正常狀態(tài)下，其功能主要是維持ROS的生成和去除處于一個(gè)平衡狀態(tài)。在病理情況下，ROS不能夠及時(shí)被清除，可能導(dǎo)致ROS沉積，這可能與線粒體受損有關(guān)[13]。反過(guò)來(lái)ROS濃度過(guò)高，一方面影響了線粒體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，促使體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的大量產(chǎn)生，進(jìn)而造成神經(jīng)元損傷，甚至導(dǎo)致患者死亡；另一方面，ROS聚集還會(huì)造成Aβ的超量。有學(xué)者研究證實(shí)Aβ的沉積會(huì)直接導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷，而受損的線粒體中產(chǎn)生大量氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使淀粉樣前體蛋白APP更易分解為不溶性的Aβ。課題組前期研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿里紅提取物對(duì)Aβ25-35致癡呆動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶障礙有一定的改善作用[14]，阿里紅多糖組分對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)有影響[15]。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比空白組，用40 μmol/L Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中ROS大量聚集，數(shù)量顯著性增多，Aβ25-35打破了ROS的動(dòng)態(tài)平衡，產(chǎn)生了氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD，MDA，LDH的異常，進(jìn)而出現(xiàn)一系列AD的癥狀，說(shuō)明Aβ25-35造成PC12細(xì)胞的線粒體損傷；然后在這個(gè)AD模型中用不同濃度的阿里紅多糖組分FOAPs-a和FOAPs-b給藥后，組內(nèi)ROS聚集情況得到了顯著的改善，且能顯著增加Bcl-2的表達(dá)量，同時(shí)顯著降低Bax蛋白的表達(dá)水平，各組內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性，組間比較后發(fā)現(xiàn)FOAPs-a對(duì)線粒體功能的改善作用要優(yōu)于FOAPs-b的效果。同時(shí)，熒光探針共定位實(shí)驗(yàn)和WB檢測(cè)凋亡蛋白結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：Aβ25-35的確可以進(jìn)入到PC12細(xì)胞的線粒體當(dāng)中，誘導(dǎo)其線粒體的形態(tài)和數(shù)量發(fā)現(xiàn)不同程度的改變，并加速細(xì)胞凋亡，而FOAPs-a和FOAPs-b給藥組則可以改善線粒體的損傷程度和抑制細(xì)胞的凋亡。

文獻(xiàn)報(bào)道，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激是AD的重要病理特征，過(guò)度氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致氧化還原通路Nrf2的激活。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Nrf2(nuclear related factor 2)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著很重要的作用[16]。在生理?xiàng)l件下，Nrf2處于惰性狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體在病理?xiàng)l件下，Nrf2被激活與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responseelement，ARE)結(jié)合，從而啟動(dòng)一系列的抗氧化物質(zhì)的合成來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激[17]；另外，Nrf2誘導(dǎo)產(chǎn)生的血紅素加氧酶(HO-1)具有神經(jīng)保護(hù)作用，HO-1催化血紅素生成的產(chǎn)物亦是體內(nèi)強(qiáng)有力的ROS清除劑，對(duì)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用[18]，過(guò)表達(dá)Nrf2的神經(jīng)元能夠減輕Aβ毒性損傷，上調(diào)Nrf2目標(biāo)基因的表達(dá)從而減少氧化應(yīng)激的發(fā)生[19]。細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1(ASK1)是高度保守的MAP3Ks 家族成員之一，ASK1被激活后能夠?qū)KK3/MKK6-p38和MKK4/MKK7-JNK兩大激酶通路激活，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[20]。研究發(fā)現(xiàn)很多調(diào)控因子與ASK1直接結(jié)合調(diào)控其活性，ASK1去磷酸化則活化,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生[21]。本實(shí)驗(yàn)中WB結(jié)果顯示：與模型組比較FOAPs-a及FOAPs-b均能減少APK1的磷酸化和上調(diào)Nrf2的蛋白表達(dá)，說(shuō)明兩種阿里紅多糖組分FOAPs-a和FOAPs-b均能夠激活Nrf2蛋白的表達(dá)，參與氧化還原信號(hào)通路，對(duì)抗AD中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在一定程度上改善線粒體損傷進(jìn)而緩解氧化應(yīng)激損傷，揭示阿里紅多糖線粒體保護(hù)作用的分子機(jī)制。

綜上所述，阿里紅多糖組分可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的線粒體損傷和細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，對(duì)AD模型的線粒體損傷通路和氧化應(yīng)激損傷均具有一定程度的改善作用，推測(cè)阿里紅多糖可能參與氧化應(yīng)激損傷通路，發(fā)揮對(duì)線粒體的保護(hù)作用，但其詳細(xì)的機(jī)制仍需深入研究。