楊淑達(dá)，于浩飛，張?zhí)m春，李 媛，耿藝娟，張榮平，胡煒彥

昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650500

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又叫老年性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病。Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)為其特征性病理改變之一。正常人的大腦中微管相關(guān)蛋白(protein Tau)與磷酸化微管相關(guān)蛋白(P-Tau)處于相對(duì)平衡狀態(tài)，但在AD患者，Tau蛋白處于過度磷酸化狀態(tài)，參與了神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT)的形成，并且AD病人的癡呆程度與NFT的數(shù)目密切相關(guān)[1-4]。

人參皂苷是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中草藥材——人參中的一類主要的有效成分，約占4%，研究表明：人參皂苷在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能方面，具有增強(qiáng)記憶和認(rèn)知功能的作用，是研究中藥抗癡呆的熱點(diǎn)之一[5-7]。Rb1、Rg1同屬于人參皂苷的單體之一，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)Rb1和Rg1的報(bào)道較多，對(duì)人參皂苷Rb1在AD微管相關(guān)蛋白(Tau)異常磷酸化中的作用有一些報(bào)道，但多是針對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元[8-10]或神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中[11]Tau蛋白磷酸化的影響，限于細(xì)胞水平，對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的組織水平Tau磷酸化的影響卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)[12,13]，采用Aβ1-42誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元和離體腦片的方法，建立Tau蛋白過度磷酸化的模型，觀察人參皂苷Rb1對(duì)Aβ1-42所致小鼠海馬神經(jīng)元呵和腦片微管相關(guān)蛋白(Tau)異常磷酸化的抑制作用及其可能機(jī)制，旨在豐富人參皂苷Rb1抑制β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)元Tau蛋白過度磷酸化的機(jī)制研，為含人參皂苷Rb1藥物在抗癡呆治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)C57小鼠，雄性10只，雌性E18天孕鼠5只，鼠齡均為8周，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供(合格證號(hào)：SCXK(滇)-2011004)。

1.2 藥物與試劑

人參皂苷Rb1(云南植物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20171201，純度98.5%)，使用前溶于生理鹽水配成濃度分別為10、50和250 mg/mL的三種溶液。Aβ1-42(Peptide公司，純度98%)，使用前溶于生理鹽水中，配制成1mg/mL溶液待用。Tau[pS202](Thermo公司)；Tau[pS199]、Tau[pS396]、Erk1/2、p-Erk1/2和β-actin抗體(SIGMA公司)；Tau多克隆抗體(DAKO公司)；Tuj1抗體(Abcam公司)；熒光二抗(Invitrogen公司)；DAPI染色液(碧云天公司)。

2 方法

2.1 離體海馬腦片的制備

小鼠用6%水合氯醛麻醉(400 mg/kg)，斷頭，冰上迅速切開頭皮，暴露顱骨，取出全腦，置于經(jīng)95% CO2和5% CO2混合氣體飽和的人工腦脊液冰水混合物中，用振動(dòng)切片機(jī)(WPI，Sarasota，F(xiàn)L，USA)行冠狀切制海馬腦片(厚度350 μm)。海馬腦片置盛有95% CO2和5 % CO2混合氣體飽和的人工腦脊液中孵育培養(yǎng)(溫度32±0.5 ℃)。人工腦脊液成分(mmol/L)：(NaCl 126、KCl 2.5、NaH2PO41、CaCl22.5、MgSO41.5、NaHCO326和glucose 10)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥

將海馬腦片分為模型組、人參皂苷Rb1高、中、低劑量組和試劑空白組，各組腦片分別置盛有95% CO2和5% CO2混合氣體飽和的人工腦脊液中孵育培養(yǎng)(溫度32±0.5 ℃)1 h后，人參皂苷Rb1高、中、低劑量組分別加入濃度為250、50、10 mmol/L的人參皂苷Rb1，加入等體積生理鹽水做試劑空白。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，模型組和人參皂苷Rb1高、中、低劑量組分別加入Aβ1-42至其濃度達(dá)到1 mmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)6 h，取出腦片，做后續(xù)檢測(cè)。

2.3 蛋白表達(dá)量測(cè)定

2.3.1 蛋白提取

各組腦片取出后，迅速經(jīng)人工腦脊液清洗后，放入1.5 mL的離心管中，每片加入200 μL的RIPA組織裂解液(已加入蛋白酶及磷酸酶抑制劑)。冰上研磨成組織勻漿，4 ℃離心(15 000 × g，20 min)，取上清，測(cè)定總蛋白含量。取測(cè)定總蛋白濃度后的蛋白提取液樣品，加入等體積的2×上樣緩沖液(125 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)pH 6.8，質(zhì)量濃度為10 g/L甘氨酸(glycerol)，質(zhì)量溶度為10 g/L的十二烷基磺酸鈉(SDS)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.006%溴酚藍(lán)，130 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT))混勻，在95 ℃沸水中煮5 min，冰上冷卻后，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 總蛋白含量測(cè)定

蛋白含量按照BCA試劑盒操作進(jìn)行測(cè)定：1)將50體積的BCA reagent與1體積Cu reagent混合，配置成工作溶液(working reagent，WR)；2)用超純水將標(biāo)準(zhǔn)品BSA(4 000 μg/mL)稀釋至2 000、1 000、500、250、125、25 μg/mL；3)將25 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品BSA或待測(cè)樣品與同體積的WR工作溶液混合；4)37 ℃反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，混勻，加入96孔培養(yǎng)板(設(shè)3個(gè)復(fù)孔)。562 nm下測(cè)定的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算總蛋白濃度。

2.3.3 蛋白印跡反應(yīng)

配置5%濃縮膠(30% acrylamide 1 700 μL，1.0 M Tris(pH 6.8)1 250 μL，10% SDS 100 μL，10% AP 100 μL，TEMED 10 μL，dd H2O 6 800 μL)、10%～12%分離膠(30% acrylamide 3 300 μL，1.5 M Tris(pH 8.8)2 500 μL，10% SDS 100 μL，10% AP 100 μL，TEMED 4 μL，ddH2O 4 000 μL)及電泳緩沖液(Tris 15.1 g，glycine 94 g，SDS 5 g，加入800 mL去離子水溶解后定容至1 L)，按預(yù)定順序?qū)?0 μg各蛋白樣品上入泳道上樣；連接電泳裝置與電源，調(diào)節(jié)電壓進(jìn)行電泳分離；將凝膠板置于盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液(Tris 5.8 g，glycine 2.9 g，SDS 0.37 g，加入去離子水600 mL溶解，調(diào)節(jié)PH值至8.3，定容至800 mL后，加入200 mL甲醇)的容器中，安裝轉(zhuǎn)膜裝置，注滿4 ℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，調(diào)節(jié)電壓轉(zhuǎn)膜；洗膜(室溫，5 min)；室溫封閉1 h(封閉液：5%脫脂奶粉用TBST預(yù)先配制，并于搖床上震搖均勻)；孵一抗(4 ℃，大于8小時(shí))；TBST洗膜(室溫，3×5 min)；孵二抗(室溫，60 min)；TBST洗膜室溫，3×5 min)；用ECL顯影液顯影條帶，凝膠成像儀拍照。用anti-β-actin孵育同一張PVDF膜作為內(nèi)參。用 Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行光密度分析，用目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)的光密度比值代表目的蛋白的相對(duì)含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理采用one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，P<0.05視為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 A β1-42誘導(dǎo)對(duì)小鼠培養(yǎng)腦片Tau及p-Tau的影響

與空白組比較，模型組Tau蛋白表達(dá)無(wú)增加(P>0.05)，模型組p-Tau表達(dá)增加(P<0.01或P<0.05)(見圖1)。

圖1 A β1-42誘導(dǎo)對(duì)小鼠培養(yǎng)腦片Tau及p-Tau的影響

3.2 A β1-42誘導(dǎo)對(duì)小鼠培養(yǎng)腦片Erk1/2及p-Erk1/2的影響

與空白組比較，模型組Erk1/2蛋白水平無(wú)增加(P>0.05)，模型組p-Erk1/2蛋白水平明顯增加(P<0.01)(見圖2)。

圖2 A β1-42誘導(dǎo)對(duì)小鼠培養(yǎng)腦片Erk1/2及p-Erk1/2的影響

3.3 人參皂苷Rb1對(duì)小鼠培養(yǎng)腦片Tau及p-Tau的影響

小鼠腦片經(jīng)過Rb1培養(yǎng)后，與空白對(duì)照相比，Tau蛋白表達(dá)量無(wú)明顯增加；與模型組相比，人參皂苷Rg1各劑量組Ser199、Ser202、Ser396位點(diǎn)標(biāo)記 的p-Tau蛋白表達(dá)水平均有不同程度減少(P<0.05或P<0.01)，人參皂苷Rb1各劑量組之間比較，大劑量組較中、小劑量組更有效降低p-Tau的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)(見圖3)。

圖3 人參皂苷Rb1對(duì)AD模型小鼠腦片Tau及p-Tau的影響

3.4 人參皂苷Rb1對(duì)小鼠培養(yǎng)腦片Erk1/2及p-Erk1/2的影響

小鼠腦片經(jīng)過Rb1培養(yǎng)后，與空白對(duì)照相比，Erk1/2蛋白表達(dá)量無(wú)明顯增加；與模型組相比，人參皂苷Rb1各劑量組p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平均有不同程度減少(P<0.05或P<0.01)，人參皂苷Rb1各劑量組之間比較，大劑量組較中小劑量組更有效降低p-Erk1/2的蛋白水平(P<0.05或P<0.01)(見圖4)。

圖4 人參皂苷Rb1對(duì)AD模型小鼠腦片p-Erk1/2及Erk1/2的影響

3 討論

老年癡呆(AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴(yán)重害老年人健康。由于微管相關(guān)蛋白(Tau)過度磷酸化而形成的神經(jīng)纖維結(jié)節(jié)(NFT)是AD患者腦內(nèi)典型病理改變之一。正常的微管相關(guān)蛋白(Tau)能促進(jìn)微管蛋白聚合成微管并增強(qiáng)其穩(wěn)定性，在神經(jīng)系統(tǒng)形成和軸突信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用，過度磷酸化的Tau喪失了促進(jìn)微管蛋白聚合的能力，導(dǎo)致神經(jīng)元微管解體，引起軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，神經(jīng)纖維變性。當(dāng)Tau蛋白去磷酸化后，可使NFT發(fā)生松解，釋放出的Tau又重新恢復(fù)其促微管的活力[14-16]。

Aβ1-42是AD患者腦內(nèi)引起Tau蛋白磷酸化的主要物質(zhì)，抑制Aβ1-42引起Tau蛋白磷酸化對(duì)AD的預(yù)防和治療有幫助[17,18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：Aβ1-42可誘導(dǎo)小鼠腦片Tau蛋白在特異性位點(diǎn)(Ser199、Ser202、Ser396)的磷酸化水平增加(與正常組比較差異具有顯著性，P<0.01)；而給與不同劑量人參皂苷Rb1處理后，可降低這些特異性位點(diǎn)的Tau蛋白的磷酸化水平(與Aβ1-42組比較差異具有顯著性，P<0.05)。我們的部分研究結(jié)果(Tau蛋白Ser396位點(diǎn))與Zhao等[11]在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中的研究結(jié)果一致(人參皂苷Rb1可減輕β-淀粉樣蛋白25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中Tau蛋白過度磷酸化)，與他們的實(shí)驗(yàn)不同的是：本實(shí)驗(yàn)以小鼠海馬腦片為研究對(duì)象，觀察了三個(gè)Tau蛋白的特異性位點(diǎn)，從組織水平說(shuō)明了人參皂苷Rb1能有效減輕Aβ1-42引起的Tau蛋白不同位點(diǎn)的過度磷酸化，從而減輕NFT的形成；本研究還發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42引起的Tau蛋白不同特異性位點(diǎn)(Ser199、Ser202、Ser396)磷酸化水平的異常升高隨人參皂苷Rb1劑量的增加而降低，表明人參皂苷Rb1對(duì)Tau蛋白不同特異性位點(diǎn)磷酸化的抑制作用具有劑量依賴性。

Tau蛋白的磷酸化受蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的調(diào)節(jié)，許多蛋白激酶如周期蛋白依賴性激酶(CDK)、糖原合成激酶3β(GSK-3β)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)都能促使Tau蛋白磷酸化[19-23]。已有研究表明：人參皂苷Rb1可能可以通過激活PI3K、抑制GSK-3β、影響p25/cdk5等減輕Tau蛋白過度磷酸化善作用[8-10]。我們的研究發(fā)現(xiàn)：Aβ1-42可使p-Erk1/2蛋白水平明顯增加(與正常組比較差異具有顯著性，P<0.01)，總Erk1/2水平升高未見顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明Aβ1-42可能通過激活Erk1/2，誘導(dǎo)Tau 蛋白在特異性位點(diǎn)發(fā)生磷酸化；而我們用人參皂苷Rb1(50 μmol/L 和250 μmol/L)預(yù)處理后，p-Erk1/2蛋白水平的異常升高得到明顯改善(與Aβ1-42組比較差異具有顯著性，P<0.05，P<0.01)，對(duì)總Erk1/2水平的影響未見顯著性差異(P>0.05)。本研究還發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42引起的p-Erk1/2表達(dá)水平的異常升高隨人參皂苷Rb1劑量的增加而降低，表明人參皂苷Rb1對(duì)Erk磷酸化的抑制作用具有劑量依賴性。

我們的研究結(jié)果表明：Aβ1-42可通過激活Erk誘導(dǎo)Tau蛋白發(fā)生異常磷酸化，人參皂苷Rb1則能劑量依賴性的通過抑制Erk1/2的過度激活降低Tau蛋白的磷酸化水平，使其去磷酸化增多而穩(wěn)定神經(jīng)元的微管系統(tǒng)，恢復(fù)其功能，進(jìn)而有可能逆轉(zhuǎn)AD的病理改變，成為用于治療AD的藥物。本研究為人參皂苷Rb1作為AD的治療的潛在藥物研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，然而對(duì)于其具體的作用機(jī)制，尚有待于進(jìn)一步的研究證明。