鄧 靜，林秀蓮，劉瑞瑩，林麗美，廖端芳，吳 萍，夏伯候

湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點實驗室 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208

單面針為蕓香科花椒屬植物蚌殼花椒(ZanthoxylumechinocarpumHemsl)的根、根皮、莖和葉，又名山枇杷、山椒根、黃椒根等，常用于脾運不健、跌打損傷、骨折等癥[1]。兩面針為蕓香科花椒屬藤本植物兩面針(Z.nitidum(Roxb.)DC)的干燥根，別名入地金牛、雙面針等，常用于治療牙痛、神經(jīng)痛、胃痛、咽喉腫痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、毒蛇咬傷等多種病癥[2,3]。二者多分布于云南、廣東、廣西等地，生長于山地林中，且均為木質(zhì)藤本植物，外觀上莖、枝、葉雖極為相似，但皮刺生長形狀與部位卻有區(qū)別。單面針葉片背面中肋上生小而下曲的銳刺，葉片正面無銳刺；兩面針的幼枝，葉軸背面和小葉兩面中脈上都有鉤狀皮刺[4]。通常可以依靠皮刺生長部位不同而從宏觀上鑒定與區(qū)別這兩類植物。近年來隨著兩面針?biāo)幱煤徒?jīng)濟價值不斷增加，導(dǎo)致市場中常用廉價單面針制成飲片冒充兩面針，因此，有必要對兩者的化學(xué)成分的差異性做進一步研究，從初級代謝產(chǎn)物出發(fā)，探尋兩者有效成分及質(zhì)量的差異。

據(jù)文獻報道，兩面針中的主要生物活性成分包括氯化兩面針堿、氧化兩面針堿、兩面針堿、白屈菜紅堿、鵝掌楸堿、德卡林堿、氧化刺椒堿等30多種生物堿[5]。此外還有橙皮苷、香葉木苷等黃酮類化合物，以及L-芝麻脂素，L-細(xì)辛脂素等木脂素類化合物[6]。單面針中的主要生物活性成分包括白鮮堿，花椒堿，茵宇堿，合帕洛平，胡蘿卜苷，5，8-二甲氧基-3，4環(huán)氧呋喃香豆素，新橙皮苷，熊果酸等[7]。目前國內(nèi)外關(guān)于單面針與兩面針兩者差異性研究的報道較少，Yang等[8]采用HPLC-Q-TOF/MS法對兩面針和單面針中的生物堿進行分析，根據(jù)生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律，從兩面針和單面針的甲醇提取物中鑒定了32種生物堿。而目前大部分研究集中于單面針與兩面針次級代謝產(chǎn)物的差異，無其初級代謝產(chǎn)物差異的相關(guān)研究。植物在長期的進化過程中，產(chǎn)生了數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)迥異的初級代謝物，這些代謝物在植物生長形態(tài)、適應(yīng)環(huán)境以及藥物功效等方面發(fā)揮著重要的作用，因此有必要探尋兩種藥用植物間初級代謝產(chǎn)物的差異。

代謝物作為生物體表型的基礎(chǔ)，其能夠直觀有效地解釋植物生命現(xiàn)象并揭示表型內(nèi)在可能的本質(zhì)。代謝組學(xué)本質(zhì)上是指從整體上研究生物體的代謝物，是對某一生物、組織或細(xì)胞中的所有低分子量代謝產(chǎn)物進行定性與定量分析的一門科學(xué)。而植物代謝組學(xué)以指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，高通量檢測為手段，通過分析植物組織中的代謝物，從整體上定性、定量測定不同表型對代謝物的影響，從而解析代謝物的代謝合成途徑、代謝物網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機制[9]，由代謝合成途徑與代謝網(wǎng)絡(luò)的差異可進一步推導(dǎo)出植物表型差異的內(nèi)在機制。代謝組學(xué)相對于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)而言，更關(guān)注生物體的表型，是目前被認(rèn)為最接近表型的組學(xué)[10]，可通過應(yīng)用于表征代謝產(chǎn)物整體變化的靶向或者非靶向性方法，來揭示植物表型差異的原因，因此，代謝組學(xué)目前是植物表型差異潛在生物標(biāo)志物篩選中最有前景的發(fā)展方向。

綜上所述，本研究擬以單面針與兩面針為研究對象，通過溶劑提取法，建立其GC-MS代謝產(chǎn)物的分析方法，并通過相似度評價法、主成分分析(principal components analysis，PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)等化學(xué)計量學(xué)方法分析兩者初級代謝物的差異，篩選其內(nèi)在差異標(biāo)志物，并通過MetaboAnalyst、KEGG等工具及數(shù)據(jù)庫富集其代謝通路，研究其代謝機制，探尋代謝網(wǎng)絡(luò)內(nèi)在聯(lián)系與其質(zhì)量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

單面針和兩面針樣品均由株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室龔力民副教授分別鑒定為蕓香科花椒屬單面針Z.echinocarpumHemsl與蕓香科兩面針Z.nitidum(Roxb.)DC.的根。

1.2 儀器與試劑

島津GC-MS QP2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津公司)，HP-5石英毛細(xì)管柱，CP114型電子天平(奧豪斯上海有限公司)，-20 ℃冰箱(Haier)，高速離心機(德國Eppendorf)，精密移液槍(德國Eppendorf)。

吡啶(Sigma-Aldrich試劑公司)，雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，Sigma-Aldrich試劑公司)，甲氧胺鹽酸鹽(純度98%，Sigma-Aldrich試劑公司)，甲醇(國藥化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 樣品前處理方法

參照Quéro等[11]的樣品前處理方法，根據(jù)實驗具體情況做些許改變，具體方法如下：

精密稱取樣品100 mg，加入1 400 μL甲醇(-20 ℃)，渦旋1 min，在70 ℃下水浴加熱30 min，待充分冷卻后，補重，離心5 min(13 000 rpm)，取上清液400 μL，加入50 μL核糖醇-甲醇溶液(1 mg/mL)為內(nèi)標(biāo)，渦旋1 min。在N2下吹干，加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(20 mg/mL)，在水浴溫度30 ℃下肟化1 h，加入100 μL BSTFA，在水浴溫度45 ℃下反應(yīng)2 h，進行硅烷化反應(yīng)。衍生后溶液轉(zhuǎn)入進樣瓶(加內(nèi)襯)，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分析。

質(zhì)量控制樣本(QC樣本)：從每份樣品中稱量等量單面針(兩面針)粉末，將稱取的粉末混合成一個混合樣本，用作QC樣本。將QC樣本均勻的插入到分析序列中，以考察整個分析過程的重復(fù)性。

1.4 GC-MS條件

HP-5石英毛細(xì)管柱；進樣口溫度270 ℃；載氣為He；體積流量1 mL/min；進樣量1 μL；分流比25∶1；電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度270 ℃；溶劑延遲5 min；TIC模式質(zhì)量范圍m/z35～550。

GC升溫程序:70 ℃，保持2 min；70～85 ℃，10 ℃/min；185 ℃，保持3 min；185 ～210 ℃，3 ℃/min；210 ℃，保持2 min；210～270 ℃，15 ℃/min；270 ℃，保持10 min。

1.5 代謝物鑒定

利用AMDIS自動質(zhì)譜圖卷積識別軟件結(jié)合美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)化學(xué)數(shù)據(jù)庫，將GC-MS檢測出的主要代謝物成分與在線EI-MS數(shù)據(jù)庫(oliver fiehn lab)和相關(guān)文獻報道的化合物進行匹配，鑒定相似度大于85%且滿足80%的通用性原則，RSD小于30%(QC)的代謝物。最后以核糖醇(內(nèi)標(biāo))的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)歸一化所有物質(zhì)的峰面積。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，得到單面針和兩面針GC-MS指紋圖譜，并做相似度評價；所有均做Pareto scaling處理，利用多元變量統(tǒng)計分析軟件(SIMCA)進行主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)篩選出差異性代謝物。為進一步明確單面針和兩面針?biāo)幉牡牟町?，本研究以相對峰面積作為指標(biāo)分析差異性成分在單面針和兩面針中的相對含量。最后，通過MetaboAnalyst4.0(http://www.metaboanalyst.ca/)、KEGG(https://www.kegg.jp/)等工具及代謝數(shù)據(jù)庫的路徑分析以及查閱文獻，分析篩選后得到代謝途徑，并構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與討論

2.1 建立代謝物指紋圖譜及相似度分析

分別取單面針、兩面針的供試品溶液按“1.3”項下條件進樣測定，得到其代謝物指紋圖譜如圖1所示。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，分析得到其相似度熱點圖，由圖2可知，被測同種植物組內(nèi)初級代謝產(chǎn)物相似度高(r>0.8)，而組間(非同種植物)的相似度較低(0.5

圖2 單面針(S組)和兩面針(L組)的相似度比較

圖1 單面針和兩面針GC-MS圖譜

2.2 代謝物GC-MS數(shù)據(jù)鑒定

利用NIST以及在線數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關(guān)文獻，將這些通過GC-MS檢測出的代謝物的保留時間、精確分子量及碎片離子與化合物進行匹配，最終鑒定出49個相似度在85%以上的代謝物。這些代謝物的相對含量見圖3，結(jié)果可得兩面針中大部分的初級代謝物的含量均高于單面針，這些鑒定出來的代謝產(chǎn)物可以分為有機酸類、糖類、氨基酸類、多元醇、脂肪酸、胺、糖苷和其他物質(zhì)，分別占總代謝物的31%、27%、12%、12%、10%、4%、2%和2%。

圖3 代謝物的鑒定以及相對含量圖

2.3 潛在差異性代謝物的驗證

首先，本研究利用無監(jiān)督的PCA方法得到所有數(shù)據(jù)樣本的得分圖4。從圖中可看出，QC樣本在中心緊密聚集，隨著時間的推移顯示出最小的漂移，說明了本研究建立的GC-MS方法所得數(shù)據(jù)具有可靠性，組間的分離是由于真實的生物變異性而不是分析方差造成的，可進行接下來的數(shù)據(jù)處理。在單面針與兩面針的PCA圖中，代謝物均分布在95%的置信區(qū)間內(nèi)，沒有異常樣本值，但有個別數(shù)據(jù)存在部分的交叉，所以為了突出組間差異，便于后續(xù)尋找差異成分，本研究進一步利用有監(jiān)督的OPLS-DA方法來進行分析(圖4)，從圖中可看出單面針、兩面針各自聚為一類，表明單面針和兩面針代謝物成分的差異較顯著。對模型進一步利用置換檢測，發(fā)現(xiàn)模型R2Y與Q2分別達到0.981和0.855，說明模型較優(yōu)、無顯著過擬合現(xiàn)象。利用相應(yīng)S-plot圖(圖5)尋找二者之間的差異[12]，篩選P<0.05，P(corr)>0.5以及VIP得分圖中VIP>1(圖6)的變量，根據(jù)HMDB和KEGG等數(shù)據(jù)庫以及文獻中數(shù)據(jù)對差異物進行比對，從中篩選出5個差異性代謝物，分別為quininic acid、D-talose、glycerol、D-glucose以及D-fructose。

圖6 VIP評分圖

圖5 S-plot圖

圖4 PCA和OPLS-DA的得分圖

2.4 標(biāo)記代謝物的相關(guān)與差異分析

同時，為進一步探尋各差異性代謝物之間的關(guān)系，本研究以各代謝物的相對含量為對象，通過以各個代謝物之間的相關(guān)系數(shù)為指標(biāo)，得到其相關(guān)系數(shù)熱點圖(圖7)。在相關(guān)值大于0.50的閾值(r值> 0.5)時，有超過20對代謝物呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，超過10對代謝物呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中quininic acid、D-talose、glycerol、D-glucose以及D-fructose之間均具有較高的相關(guān)系數(shù)，說明篩選得到的差異性代謝物之間相互關(guān)聯(lián)且共同作用，未來對這些代謝物作用的詳細(xì)研究將有助于闡明這些代謝物中的關(guān)鍵代謝網(wǎng)絡(luò)。

圖7 代謝物相關(guān)系數(shù)熱點圖

為明確上述成分在單面針和兩面針?biāo)幉闹械暮坎町?，本研究以差異性代謝物的相對含量作為指標(biāo)進行比較，從圖8中可以直觀地看出，兩面針中quininic acid、D-talose、glycerol、D-glucose以及D-fructose的相對含量均顯著高于單面針，結(jié)合KEGG等數(shù)據(jù)庫進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1)這些代謝物與苯丙氨酸途徑，果糖和甘露糖代謝，糖酵解以及淀粉與蔗糖代謝相關(guān)[13]。

表1 標(biāo)志代謝物相關(guān)通路

圖8 差異性代謝物的相對含量比較盒型圖

2.5 代謝通路富集分析

對代謝物的相對含量進行富集分析，結(jié)果如圖9所示，圓圈的大小呈現(xiàn)出通路的富集倍數(shù)，圓圈體積越大，表示通路的富集程度和重要性越大，虛線代表各個通路之間的相互作用關(guān)系。由結(jié)果可知，氨基酸和糖類相關(guān)的代謝通路變化顯著，共分析得到4條代謝通路：包括苯丙氨酸等氨基酸的代謝和糖酵解、氨基糖代謝、淀粉和蔗糖代謝等糖類代謝相關(guān)通路。

圖9 代謝物富集分析及相關(guān)代謝物通路圖

奎寧酸是一種芳香族氨基酸生物合成的前體物質(zhì)，植物體內(nèi)的苯丙氨酸解氨酶(PAL)可促進奎寧酸的合成，PAL是連接初級代謝和苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶與限速酶[14]，而黃酮類化合物的生物合成都是通過苯丙烷類生物途徑，因奎寧酸在兩面針中含量高于單面針，故而在單面針與兩面針的次級代謝產(chǎn)物中，黃酮類化合物如橙皮苷、牡荊素等含量在兩面針中較為豐富[15]。苯丙氨酸代謝途徑是植物次級代謝中很重要的一條通路，在PLA作用下苯丙氨酸被催化生成香豆酸、咖啡酸、芥子酸等中間產(chǎn)物，再在4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)催化下生成苯丙烷酸CoA酯，進一步轉(zhuǎn)化為苯丙素類化合物。這些次生代謝產(chǎn)物對植物生長發(fā)育、抵御病蟲害、構(gòu)成植物支撐系統(tǒng)等方面具有重要意義。同時，兩面針作為廣泛應(yīng)用于臨床的中藥材，其生物堿類、木質(zhì)素類、黃酮類等化合物為其主要藥效物質(zhì)[16]，苯并菲啶類生物堿藥理活性最為顯著，具有較強的抗腫瘤活性[17]，總生物堿有明顯的抗急性腦缺血作用、抗炎抗?jié)冏饔肹18]、抑制乙酰膽堿酶活性、抗病毒作用[19]，木質(zhì)素化合物具有較顯著的鎮(zhèn)痛作用，故此途徑對控制藥材質(zhì)量及衡量藥用價值有一定參考意義。相比于單面針，兩面針的差異代謝物的含量均較高，且苯丙氨酸代謝途徑更為活躍，故藥效物質(zhì)積累更為豐富，提示這是兩者產(chǎn)生差異的原因。

此外，其他的差異性通路與糖代謝具有顯著相關(guān)，而糖代謝的調(diào)節(jié)與植物激素組成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)體系對植物生長發(fā)育和基因表達起重要調(diào)控作用，進而對植物表型產(chǎn)生一定影響。糖的代謝是整個生物代謝的中心，它聯(lián)通了脂類代謝、核酸代謝、蛋白質(zhì)代謝及次生物質(zhì)代謝[20]。糖類的合成與分解影響細(xì)胞及溶液的滲透勢，而氧份運輸?shù)膭恿退值牧鲃泳Q于滲透勢的變化，從而影響植物氣孔開閉、花藥裂開等活動[21]。同時，糖代謝引起的滲透勢還起到調(diào)節(jié)植物抗脅迫環(huán)境的能力，從而導(dǎo)致植物的表型出現(xiàn)宏觀上的差異。糖類的代謝及運輸分配還會影響進入細(xì)胞的糖及貯存的糖的形式，從而對植物的品質(zhì)、中藥材的有效成分含量均會產(chǎn)生影響，通過運用代謝物通路的富集技術(shù)找到關(guān)鍵性代謝通路，可以對單面針和兩面針進行質(zhì)量控制和品質(zhì)評價。

3 結(jié)論

本研究采用基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)，篩選出5個差異性代謝物，通過研究它們在單面針和兩面針中的相對含量，發(fā)現(xiàn)兩面針中quininic acid、D-talose、glycerol、D-glucose以及D-fructose的相對含量均顯著高于單面針。利用KEGG等數(shù)據(jù)庫對這些差異性代謝物進行特異性鑒定，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)是主要代謝途徑的關(guān)鍵中間體，參與苯丙氨酸途徑，果糖和甘露糖代謝[22]，糖酵解以及淀粉與蔗糖代謝[23]等多種代謝途徑。提示代謝組學(xué)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析方法可作為區(qū)分單面針與兩面針特征性成分的有效方法，該分析結(jié)果對深入研究單面針與兩面針質(zhì)量差異的機理具有一定的參考價值，今后可作為通過代謝工程提高質(zhì)量的基礎(chǔ)，對于單面針和兩面針的質(zhì)量控制、農(nóng)業(yè)種植以及品質(zhì)提升具有重要的意義。