張海新，夏 召，許天啟，陳宜敏，周光雄

暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所 廣東省普通高校中藥和天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點實驗室，廣州 510632

小駁骨JusticiagendarussaBurm.f.為爵床科駁骨草屬多年生小灌木，又名接骨草，生于丘陵草坡，路旁村邊或灌木叢中，廣泛分布于中國、印度和馬來半島[1]。其干燥地上部分，被《中國藥典》2015年版一部收為新增藥材，具有祛風(fēng)濕、散淤血、續(xù)筋骨之功效。小駁骨作為一種民族傳統(tǒng)用藥，有著廣泛的臨床應(yīng)用，被廣泛用于治療筋膜骨折、創(chuàng)傷性損傷、月經(jīng)阻滯以及產(chǎn)后腹痛等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，小駁骨具有抗炎、抗氧化、止痛和肝保護(hù)等多種活性[2,3]。但其化學(xué)成分報道較少，為了更好地闡明小駁骨中具有生物活性的成分，本實驗綜合運(yùn)用各種現(xiàn)代色譜和光譜技術(shù)，對小駁骨地上部分95%乙醇提取物的乙酸乙酯部位進(jìn)行了深入的化學(xué)成分研究。并以LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞為模型，評估分離得到的單體化合物抑制NO釋放的作用，以進(jìn)行抗炎活性的篩選，以期進(jìn)一步豐富了小駁骨植物的成分多樣性，為后續(xù)該植物的活性成分的開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Bruker AV-300、AV-400和AV-600型核磁共振儀(德國布魯克公司)；LC-100型液相色譜儀(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司)；Agilent 6120 LC/MS TOF質(zhì)譜儀(美國安捷倫科技公司)；液相分析色譜柱為Ultimate XB-C18(4.6 × 250.0 mm，5 μm，美國Welch公司)；半制備液相色譜柱為Ultimate XB-C18(10.0 × 250.0 mm，5 μm，美國Welch公司)；Eyela旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100V-WB)；BP211D電子天平(Sartorouius公司)。TLC預(yù)制板(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(Pharmacia公司)；ODS(Silicycle公司)；核磁用氘代試劑(Merck公司)；色譜級甲醇(山東禹王公司)；液相用水(廣東怡寶公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞株

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7由暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所提供。

1.3 藥材來源

實驗藥材于2016年6月在中國廣東省廣州暨南大學(xué)校園內(nèi)采集，由暨南大學(xué)藥學(xué)院周光雄教授鑒定為爵床科植物小駁骨JusticiagendarussaBurm.f.的地上部分。模式標(biāo)本(JG-201601)存放在暨南大學(xué)生藥學(xué)教研室。

2 實驗方法

2.1 提取與分離

干燥的小駁骨地上部分20 kg，粗粉碎后用95%乙醇熱回流反復(fù)提取2次，80%乙醇熱回流提取1次，每次2 h，濾過，合并3次提取液，減壓濃縮至無醇味，得到粗提取物浸膏。粗提取物浸膏加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液分別減壓濃縮，得到石油醚部位(500 g)、乙酸乙酯部位(1.2 kg)。乙酸乙酯部位經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，石油醚-丙酮(V/V 100∶0→0∶100)梯度洗脫，經(jīng)TLC分析合并后得到24個組分Fr.1～24。Fr.20經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)，(100∶0→0∶100)多梯度洗脫，經(jīng)TLC分析合并得到8個子流分Fr.24-1～8。Fr.24-1重結(jié)晶得化合物1(3 mg)。Fr.24-6經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(甲醇)，得到Fr.24-6-1～10。Fr.24-6-4經(jīng)半制備液相(甲醇/水 32%)，重結(jié)晶得到化合物16(7 mg)和17(5 mg)。Fr.8經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜，二氯甲烷-乙酸乙酯(100∶0→0∶100)多梯度洗脫，經(jīng)TLC分析合并得到9個子流分Fr.8-1～9。Fr.8-2經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇 1∶1)，得到Fr.8-2-1～12。Fr.8-2-2經(jīng)半制備液相(甲醇/水 56%)得到化合物2(6 mg)和3(10 mg)。Fr.8-2-6經(jīng)半制備液相(甲醇/水 47%)得到化合物4(10 mg)。Fr.8-6經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇 1∶1)，得到Fr.8-6-1～9。Fr.8-6-5經(jīng)半制備液相(甲醇/水 55%)得到化合物5(20 mg)和6(8 mg)。Fr.8-8經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇 1∶1)，得到Fr.8-8-1～12。Fr.8-8-4經(jīng)半制備液相(甲醇/水 57%)得到化合物8(5 mg)和9(10 mg)。Fr.10經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜，采用二氯甲烷-乙酸乙酯系統(tǒng)(100∶0→0∶100)多梯度洗脫，經(jīng)TLC分析合并得到10個子流分Fr.10-1～10。Fr.10-1經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇 1∶1)，得到流分Fr.10-1-1～8。Fr.10-1-1重結(jié)晶得11(3 mg)。Fr.10-1-2經(jīng)半制備液相(甲醇/水 50%)得到化合物7(5 mg)和10(10 mg)。Fr.10-4經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇 1∶1)，得到Fr.10-4-1～12。Fr.10-4-3經(jīng)半制備液相(甲醇/水 50%)得到化合物18(9 mg)、19(10 mg)和20(7 mg)。Fr.10-4-9經(jīng)半制備液相(甲醇/水 52%)得到化合物21(6 mg)。Fr.24經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)(100∶0→0∶100)多梯度洗脫，經(jīng)TLC分析合并得到12個子流分Fr.24-1～12。Fr.24-1經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(甲醇)，得到Fr.24-1-1～8。Fr.24-1-7經(jīng)半制備液相(甲醇/水 20%)得到化合物12(7 mg)。Fr.24-4經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(甲醇)，得到Fr.24-4-1～8。Fr.24-4-5經(jīng)半制備液相(甲醇/水 18%)得到化合物13(5 mg)。Fr.24-12經(jīng)反復(fù)ODS開放柱色譜，甲醇-水系統(tǒng)(20∶80→100∶0)多梯度洗脫，TLC分析合并7個子流分Fr.24-12-1～7。Fr.24-12-5經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(甲醇)，得到Fr.24-12-5-1～6。Fr.24-12-5-4經(jīng)半制備液相(甲醇/水 15%)得到化合物14(10 mg)和15(3 mg)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞用于實驗。

2.3 細(xì)胞活力實驗

RAW 264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋后接種到96孔板，每孔體積100 μL，最終每孔4 × 104個細(xì)胞。置恒溫培育箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，加入含有不同濃度的待測化合物及陽性對照藥(槲皮素)的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后棄去上清液，在每孔中加入5 mg/mL MTT，37 ℃下反應(yīng)4 h，棄去MTT，每孔加入200 μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm處測量各孔的OD值，計算化合物的IC50值。

2.4 抗炎活性實驗

抗炎活性采用抑制一氧化氮(NO)生成實驗，以LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7為檢測模型，應(yīng)用Griess試劑顯色法檢測一氧化氮生成量。RAW 264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋到每孔4 × 104個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 μL。置恒溫培育箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，加入含有不同濃度的待測化合物及陽性對照藥(槲皮素)的培養(yǎng)液，同時預(yù)先在培養(yǎng)液中加入100 ng/mL LPS。培養(yǎng)24 h后，吸取各孔上清液至新的96孔板中，每孔加入以1∶1比例混合的Griess A和B溶液100 μL。在3 000 rpm下離心1 min，繼續(xù)在黑暗處反應(yīng)10 min。用酶標(biāo)儀540 nm波長下測定各孔OD值，計算化合物的IC50值。

3 實驗結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色針狀晶體(甲醇);分子式為C11H11NO2。經(jīng)單晶X射線衍射確定其結(jié)構(gòu)(圖1)為2,3,3a,5-四氫-1H-苯并[d]吡咯并[2,1-b][1,3]惡嗪-1-酮，并得到其晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)：晶體屬單斜晶系，空間群為P21/n；晶胞參數(shù)：a=10.152 9(4)?，b= 7.407 6(3)?，c= 11.749 8(4)?，α= 90°，β= 98.068(4)°，γ= 90°，晶胞體積V=(874.946)?3；晶胞內(nèi)分子數(shù)Z= 4；計算密度Dcalc= 1.436 mg/m3；F(000)= 400，T=293(2)K?；衔?(CCDC 1968067)的晶體學(xué)數(shù)據(jù)已上傳劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心晶體數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為www.ccdc.cam.ac.uk)，讀者可以從該中心免費(fèi)獲得。

圖1 化合物1～21的化學(xué)結(jié)構(gòu)

化合物2無色針狀晶體(甲醇);HR-ESI-MS：m/z135.044 6[M-H]-(計算值為135.044 6)，確定其相對分子量為136，分子式C8H8O2。1H NMR(300 MHz，CD3OD)δ：7.87(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2，6)，6.83(2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)，2.51(3H，s，-CH3)；13C NMR(75 MHz，CD3OD)δ：132.1(C-1)，130.1(C-2，6)，116.2(C-3，5)，164.1(C-4)，199.5(C-7)，26.3(-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報道一致，故鑒定化合物2為4′-羥基苯乙酮。

化合物3黃色粉末(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z189.052 9[M + Na]+(計算值為189.052 8)，確定其相對分子量為166，分子式C9H10O3。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.43(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2)，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，7.49(1H，dd，J=8.2，2.1 Hz，H-6)，3.82(3H，s，-OCH3)，2.48(3H，s，-CH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：128.7(C-1)，111.1(C-2)，152.0(C-3)，147.6(C-4)，114.9(C-5)，123.4(C-6)，196.0(C-7)，55.6(-OCH3)，26.2(-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報道一致，故鑒定化合物3為apocynin。

化合物4淡黃色針狀結(jié)晶(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z325.072 9[M + Na]+(計算值為325.068 8)，確定其相對分子量為302，分子式C16H14O6。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.70(1H，d，J= 8.8 Hz，H-4)，6.44(1H，d，J=8.8 Hz，H-5)，2.53(3H，s，H-9)，2.22(3H，s，H-10)，6.70(1H，d，J=8.7 Hz，H-3′)，6.76(1H，d，J=8.7 Hz，H-4′),12.92(1H，s，-OH)，9.36(1H，s，-OH)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：111.6(C-1)，162.3(C-2)，112.2(C-3)，132.1(C-4)，107.7(C-5)，162.9(C-6)，203.2(C-7)，202.8(C-8)，30.6(C-9)，26.1(C-10)，115.8(C-1′)，147.1(C-2′)，117.6(C-3′)，118.8(C-4′)，148.0(C-5′)，137.0(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報道一致，故鑒定化合物4為白首烏二苯酮。

化合物5無色針狀晶體(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z123.044 9[M + H]+(計算值為123.044 5)，確定其相對分子量為122，分子式C7H6O2。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.80(2H，m，H-2，6)，6.90(2H，m，H-3，5)，9.76(1H，s，H-7)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：165.3(C-1)，130.3(C-2，6)，116.9(C-3，5)，133.4(C-4)，192.9(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道一致，故鑒定化合物5為對羥基苯甲醛。

化合物6無色針晶(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z161.028 7[M + Na]+(計算值為161.021 5),確定其相對分子量為138，分子式C7H6O3。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.94(1H，m，H-2)，7.51(1H，ddd，J=8.7，7.2，1.8 Hz，H-3)，6.90(1H，m，H-4)，7.79(1H，dd，J=7.9，1.8 Hz，H-5)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：113.0(C-1)，130.3(C-2)，119.2(C-3)，135.7(C-4)，17.1(C-5)，161.2(C-6)，172.0(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報道一致，故鑒定化合物6為水楊酸。

化合物7無色針晶(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z153.054 8[M + H]+(計算值為153.055 1),確定其相對分子量為152，分子式C8H8O3。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.22(1H，d，J= 2.0 Hz，H-3)，6.35(1H，dd，J=8.8，2.0 Hz，H-5)，7.73(1H，d，J=8.8 Hz，H-6)，2.50(3H，s，-CH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：112.7(C-1)，165.3(C-2)，102.3(C-3)，164.2(C-4)，108.2(C-5)，133.6(C-6)，202.5(C-7)，26.3(-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道一致，故鑒定化合物7為2,4-二羥基苯乙酮。

化合物8黃色粉末(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z153.055 3[M + H]+(計算值為153.055 1),確定其相對分子量為152，分子式C8H8O3。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.79(1H，d，J= 8.8 Hz，H-3)，6.99(1H，dd，J=8.8，3.0 Hz，H-4)，7.19(1H，d，J=3.0 Hz，H-6)，2.57(3H，s，-CH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：115.4(C-1)，153.7(C-2)，118.2(C-3)，124.4(C-4)，149.4(C-5)，120.2(C-6)，203.9(C-7)，27.7(-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道一致，故鑒定化合物8為2,5-二羥基苯乙酮。

化合物9無色顆粒(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z169.012 8[M + H]+(計算值為169.086 4),確定其相對分子量為168，分子式C9H12O3。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.20(3H，s，H-2，4，6)，3.80(9H，s，1，3，5-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：147.4(C-1，3，5)，106.9(C-2，4，6)，56.0(1，3，5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道一致，故鑒定化合物9為1,3,5-三甲氧基苯。

化合物10紅色粉末(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z219.063 6[M + Na]+(計算值為219.063 3)，確定其相對分子量為196，分子式C10H12O4。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.18(2H，s，H-2，6)，2.47(3H，s，-CH3)，3.77(6H，s，3，5-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：196.9(C-2，6)，148.3(C-3，5)，197.4(C-7)，26.7(-CH3)，56.6(3-OCH3)，55.2(5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致，故鑒定化合物10為丁香酮。

化合物11無色針狀結(jié)晶(甲醇)；分子式為C9H16O4。經(jīng)單晶X射線衍射確定其結(jié)構(gòu)(圖2)為壬二酸，并得到其晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)：晶體屬單斜晶系，空間群為P21/c；晶胞參數(shù)：a=5.484 6(4)?，b= 9.447 5(8)?，c= 18.807 9(5)?，α= 90°，β= 95.708(7)°，γ= 90°，晶胞體積V= 969.71(15)?3；晶胞內(nèi)分子數(shù)Z= 4；計算密度Dcalc= 1.289 mg/m3；F(000)= 408，T=293(2)K。化合物11(CCDC 1968064)的晶體學(xué)數(shù)據(jù)已上傳劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心晶體數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為www.ccdc.cam.ac.uk)，讀者可以從該中心免費(fèi)獲得。

化合物12白色粉末(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z543.184 5[M + Na]+(計算值為543.184 2)，確定其相對分子量為520，分子式C26H32O11。1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ：6.88(1H，br s，H-2′)，6.95(1H，br s，H-2′′)，6.73(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.75(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5′′)，6.85(1H，d，J= 8.4 Hz，H-6′)，7.04(1H，d，J= 8.4 Hz，H-6′′)，4.61(1H，d，J= 4.0 Hz，H-7′)，4.66(1H，d，J= 4.0 Hz，H-7′′)，4.88(1H，d，J= 4.0 Hz，Glc-1)，3.76(3H，s，3′-OCH3)，3.77(3H，s，3′′-OCH3)；13C NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：132.0(C-1′)，35.1(C-1′′)，110.4(C-2′，2′′)，147.5(C-3′)，148.9(C-3′′)，145.8(C-4′)，146.1(C-4′′)，115.1(C-5′，5′′)，118.1(C-6′)，118.6(C-6′′)，85.1(C-7)，84.8(C-7′)，53.5(C-8)，53.7(C-8′)，70.8(C-9)，71.0(C-9′)，100.1(Glc-1)，73.2(Glc-2)，77.0(Glc-3)，69.6(Glc-4)，76.8(Glc-5)，60.6(Glc-6)，55.6(3′-OCH3)，55.7(3′′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道一致，故鑒定化合物12為(+)-松脂素-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物13白色粉末(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z409.183 4[M + Na]+(計算值為409.183 9)，確定其相對分子量為386，分子式C19H30O8。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：2.05(1H，d，J=17.0 Hz，H1-2)，2.58(1H，d，J=17.0 Hz，H2-2)，5.76(1H，br s)，5.95(1H，d，J=15.5 Hz，H-7)，5.64(1H，dd，J= 15.5，6.4 Hz，H-8)，4.43(1H，m，H-9)，1.19(3H，d，J= 6.5 Hz，H-10)，0.93(3H，s，H-11)，0.92(3H，s，H-12)，1.82(3H，d，J=1.3 Hz，H-13)，4.99(1H，s，6-OH)，4.09(1H，d，J= 7.7 Hz，Glc-1)，3.11(1H，s，Glc-2)，3.03(1H，s，Glc-3)，2.92(1H，s，Glc-4)，2.94(1H，s，Glc-5)，3.41(2H，m，Glc-6)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：41.0(C-1)，49.3(C-2)，197.4(C-3)，125.6(C-4)，163.8(C-5)，77.9(C-6)，131.6(C-7)，131.5(C-8)，72.0(C-9)，22.1(C-10)，23.1(C-11)，24.1(C-12)，18.6(C-13)，100.0(Glc-1)，73.3(Glc-2)，77.0(Glc-3)，70.0(Glc-4)，77.2(Glc-5)，61.1(Glc-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道一致，故鑒定化合物13為corchoionoside C。

化合物14白色粉末(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z517.109 3[M + Na]+(計算值為517.095 7)，確定其相對分子量為494，分子式C22H22O13。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.53(1H，s，H-8)，7.60(1H，d，J=2.7 Hz，H-2′)，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，7.57(1H，d，J= 8.1 Hz，H-6′)，5.60(1H，d，J= 7.0 Hz，Glc-1)，3.09～3.60(6H，m，Glc-2-Glc-6)，3.75(3H，s，6-OCH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.7(C-2)，133.3(C-3)，178.0(C-4)，152.7(C-5)，131.5(C-6)，151.9(C-7)，94.2(C-8)，157.7(C-9)，104.8(C-10)，122.0(C-1′)，116.6(C-2′)，145.1(C-3′)，148.8(C-4′)，115.6(C-5′)，121.6(C-6′)，101.2(Glc-1)，74.4(Glc-2)，76.8(Glc-3)，70.2(Glc-4)，77.8(Glc-5)，61.3(Glc-6)，60.4(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道一致，故鑒定化合物14為patuletin-3-O-glucoside。

化合物15黃色粉末(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z517.096 4[M + Na]+(計算值為517.095 7)，確定其相對分子量為494，分子式C22H22O13。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.47(1H，s，H-5)，7.58(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，6.83(1H，d，J=8.9 Hz，H-5′)，7.56(1H，d，J= 8.9 Hz，H-6′)，5.40(1H，d，J= 7.4 Hz，Glc-1)，3.09～3.58(6H，m，Glc-2-Glc-6)，3.75(3H，s，6-OCH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.0(C-2)，133.0(C-3)，177.5(C-4)，93.9(C-5)，151.7(C-6)，131.5(C-7)，152.3(C-8)，158.4(C-9)，104.0(C-10)，121.5(C-1′)，116.1(C-2′)，144.9(C-3′)，148.5(C-4′)，115.2(C-5′)，121.2(C-6′)，101.0(Glc-1)，74.1(Glc-2)，76.5(Glc-3)，70.0(Glc-4)，77.5(Glc-5)，61.0(Glc-6)，59.9(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道一致，故鑒定化合物15為commicarpiflavonol glucoside A。

化合物16無色針晶(甲醇)；分子式為C9H11NO5。經(jīng)單晶X射線衍射確定其結(jié)構(gòu)(圖3)為1,2,3-三甲氧基-5-硝基苯，并得到其晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)：晶體屬單斜晶系，空間群為P21/n；晶胞參數(shù)：a=6.840 5(9)?，b= 13.738(2)?，c= 10.330 9(12)?，α= 90°，β= 99.311(12)°，γ= 90°，晶胞體積V= 958.1(2)?3；晶胞內(nèi)分子數(shù)Z= 4；計算密度Dcalc= 1.478 mg/m3；F(000)= 448，T=293(2)K?；衔?6(CCDC 1968065)的晶體學(xué)數(shù)據(jù)已上傳劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心晶體數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為www.ccdc.cam.ac.uk)，讀者可以從該中心免費(fèi)獲得。

化合物17無色針晶(甲醇)；分子式為C6H5NO3。經(jīng)單晶X射線衍射確定其結(jié)構(gòu)(圖4)為4-硝基苯酚，并得到其晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)：晶體屬單斜晶系，空間群為C2；晶胞參數(shù)：a=21.153 9(8)?，b= 3.611 8(10)?，c= 10.292 6(4)?，α= 90°，β= 117.234(12)°，γ= 90°，晶胞體積V= 699.22(5)?3；晶胞內(nèi)分子數(shù)Z= 4；計算密度Dcalc= 1.321 mg/m3；F(000)= 288，T=293(2)K?；衔?7(CCDC 1968066)的晶體學(xué)數(shù)據(jù)已上傳劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心晶體數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為www.ccdc.cam.ac.uk)，讀者可以從該中心免費(fèi)獲得。

化合物18黃色油狀(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z365.361 0[M + Na]+(計算值為365.266 9)，確定其相對分子量為342，分子式C20H38O4。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：5.30(1H，dt，J=4.7，9.4 Hz，H-9)，2.10(2H，m，H-11)，2.01(1H，m，H-1′)，4.04(2H，s，OH)，0.85(3H，t，J= 6.9 Hz，-CH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：174.2(C-1)，35.1(C-2)，25.1(C-3)，28.6(C-4)，26.6(C-5)，28.8(C-6)，28.8(C-7)，28.7(C-8)，129.7(C-9)，129.7(C-10)，31.3(C-11)，28.7(C-12)，29.0(C-13)，29.0(C-14)，28.9(C-15)，29.1(C-16)，22.1(C-17)，14.0(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道一致，故鑒定化合物18為單油酸甘油酯。

化合物19黃色油狀(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z279.217 4[M + Na]+(計算值為279.230 1)，確定其相對分子量為256，分子式C16H32O2。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：1.23-1.10(24H，m，-CH2)，2.17(3H，t，J=7.4 Hz，-OCH2CH3)，0.85(3H，t，J=6.9 Hz，-CH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：174.6(C-1)，33.7(C-2)，24.6(C-3)，28.7(C-4)，28.6(C-5)，28.9(C-6)，29.0(C-7)，29.0(C-8)，29.0(C-9)，29.0(C-10)，29.0(C-11)，28.6(C-12)，22.1(C-13)，14.0(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道一致，故鑒定化合物19為tetradecanoate。

化合物20無色片狀晶體(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z307.261 4[M + Na]+(計算值為307.150 0)，確定其相對分子量為284，分子式C18H36O2。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：1.99(2H，m，H-2)，0.85(3H，t，J=6.8 Hz，-CH3)，4.04(1H，s，-OH)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：35.1(C-2)，26.6(C-3)，28.6(C-4)，28.7(C-5)，29.0(C-6)，29.0(C-7)，29.1×8(C-8～15)，31.3(C-16)，22.1(C-17)，14.0(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道一致，故鑒定化合物20為硬脂酸。

化合物21無色針晶(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z257.248 1[M + Na]+(計算值為257.096 9)，確定其相對分子量為256，分子式C16H32O2。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：1.99(2H，m，H-2)，0.85(3H，t，J=6.8 Hz，-CH3)，4.04(1H，s，-OH)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：35.1(C-2)，26.6(C-3)，28.6(C-4)，28.7(C-5)，29.0(C-6)，29.0(C-7)，29.1×8(C-8-15)，31.3(C-16)，22.1(C-17)，14.0(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道一致，故鑒定化合物21為棕櫚酸。

3.2 抗炎活性實驗結(jié)果

21個化合物(1～21)的細(xì)胞活力和抗炎活性結(jié)果見表1。陽性藥的IC50值為16.94±0.40 μM,化合物4、6、8的IC50值均小于陽性藥的IC50，表明化合物4、6、8具有顯著的抗炎活性。

表1 化合物1～21的細(xì)胞活力和抑制NO生成活性

4 討論與結(jié)論

本研究從小駁骨的乙醇提物中分離鑒定了21個化合物，包括酚酸類，脂肪酸類，糖苷類等。其中，化合物1和16為新天然產(chǎn)物，所有化合物均首次從該植物中分離得到。對其抗炎活性進(jìn)行了初步篩選，只有化合物4、6、8有抗炎活性，但這一些化合物的活性在一定程度上揭示了該藥治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，對于小駁骨中活性成分的后期研究和質(zhì)量控制研究具有一定的參考價值和指導(dǎo)意義。本論文在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步豐富了小駁骨的化學(xué)成分種類，為該種藥用資源的綜合開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。