魏艷梅，陳惠琴，楊 理，梅文莉，陳志寶,3*，戴好富*

1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101；3廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湛江 524088

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)，也稱作樺樹茸、白樺茸，是俄羅斯的一種民間藥用真菌，主產(chǎn)于北緯40°～50°的高寒地區(qū)，在我國(guó)主要分布于吉林和黑龍江省，其寄生于白樺樹上，生長(zhǎng)期達(dá)15～20年，可耐零下40 ℃的極寒[1]。樺褐孔菌入藥部位主要是菌核，大量藥理實(shí)驗(yàn)表明其有治療糖尿病[2]、抗癌[3,4](乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、宮頸癌)、抗病毒[5]和增強(qiáng)免疫力[6]等作用。還有研究發(fā)現(xiàn)從樺褐孔菌中分離得到的樺褐孔菌醇可以保護(hù)PC12細(xì)胞免受氧葡萄糖剝奪-再恢復(fù)引起的損傷[7]，表明其有用于治療中風(fēng)的可能。而目前關(guān)于樺褐孔菌中化合物對(duì)與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的膽堿酯酶抑制作用的研究較少，為了進(jìn)一步明確樺褐孔菌中的藥理活性成分，本課題對(duì)樺褐孔菌乙酸乙酯部分進(jìn)行了化學(xué)成分研究，并對(duì)分離得到的所有單體化合物進(jìn)行膽堿酯酶抑制活性以及細(xì)胞毒活性測(cè)試。

1 儀器與材料

Bruker AV-500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；Autospec300質(zhì)譜儀(英國(guó)VG公司)；分析型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；半制備高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司)；紅外光譜儀(Nicolet 380美國(guó)賽默飛世爾Thermo公司)；紫外光譜儀(UV-2550 Shimadzu)；旋光儀MCP 5100(奧地利Anton Paar有限公司)；N-1000(2 L)立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和CA-1111冷卻水循環(huán)裝置(上海愛朗儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)真空泵(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)；SW-40超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；ELX-800酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司)；AS 220.R2 萬(wàn)分之一電子秤(RADWAG Wagi Elektroniczne)；Sephadex LH-20凝膠(Merck Co.,Ltd.)；C18反相硅膠(20～45 μm，日本Fuji Silysia Chemical Ltd公司)；柱層析用硅膠和薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠)；乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、碘代硫代乙酰膽堿、二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)和他克林均購(gòu)自Sigma公司；人慢性髓原白血病細(xì)胞(K562)、人肝癌細(xì)胞(BEL-7402)、人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)購(gòu)買自中國(guó)中科院上海生命科學(xué)研究院，人肺癌細(xì)胞(A549)和人宮頸癌細(xì)胞(Hela)購(gòu)買自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

樺褐孔菌樣品于2017年6月購(gòu)買自俄羅斯，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所王軍博士鑒定為樺褐孔菌(Inonotusobliquus)，標(biāo)本(No.20170620)存放于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

2 提取與分離

將塊狀的樺褐孔菌(13.0 kg)粉粹，用95%的乙醇浸泡提取3次，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到乙醇浸膏0.76 kg。將乙醇浸膏用水分散形成懸濁液，依次用石油醚和乙酸乙酯分別萃取3次，分別濃縮得石油醚萃取物(32.8 g)和乙酸乙酯萃取物(211.0 g)。將乙酸乙酯萃取物(211.0 g)經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(100∶1→1∶1)梯度洗脫得到28個(gè)流份(Fr.1～Fr.28)。

Fr.3重結(jié)晶得化合物4(2.5 g)。Fr.5(17.0 g)先經(jīng)C18反相硅膠柱色譜以甲醇-水(1∶1→1∶0)梯度洗脫，得到25個(gè)流份(Subfr.5-1～Subfr.5-25)。Subfr.5-18(258.9 mg)經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-氯仿-丙酮(10∶5∶0.1→0∶1∶1)梯度洗脫，得到16個(gè)流份(Subfr.5-18-1～Subfr.5-18-16)。Subfr.5-18-13(45.8 mg)經(jīng)硅膠H柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(20∶1)等梯度洗脫，得到化合物8(25.8 mg)。Subfr.5-18-15(42.0 mg)經(jīng)硅膠H柱色譜以石油醚-氯仿-乙酸乙酯(6∶5∶1)等梯度洗脫，得到化合物7(22.5 mg)。Fr.9(5.2 g)經(jīng)硅膠柱以石油醚-氯仿-乙酸乙酯(6∶3∶0.01→0∶1∶1)梯度洗脫，得到15個(gè)流份(Subfr.9-1～Subfr.9-14)，Subfr.9-9(1.0 g)經(jīng)硅膠柱以石油醚-氯仿-丙酮(30∶1∶0.3→0∶1∶1)梯度洗脫得到5個(gè)流份(Subfr.9-9-1～Subfr.9-9-5)，將Subfr.9-9-3重結(jié)晶得化合物3(33.4 mg)。Subfr.9-15(1.4 g)經(jīng)硅膠柱以石油醚-二氯甲烷-異丙醇(5∶3∶0.25→1∶2∶0)梯度洗脫，得到22個(gè)流份(Subfr.9-15-1～Subfr.9-15-22)，Subfr.9-15-3重結(jié)晶得到化合物2(65.2 mg)。Fr.11(4.3 g)經(jīng)C18反相硅膠柱色譜以甲醇-水(1∶1→1∶0)梯度洗脫，得到33個(gè)流份(Subfr.11-1～Subfr.11-33)。Subfr.11-27(840.6 mg)經(jīng)硅膠柱以石油醚-乙酸乙酯(40∶1→10∶1)梯度洗脫，得到24個(gè)流份(Subfr.11-27-1～Subfr.11-27-24)。Subfr.11-27-12(8.5 g)經(jīng)制備TLC以氯仿-甲醇(100∶1)等梯度洗脫得化合物1(8.0 mg)。

Fr.19(7.4 g)經(jīng)C18反相硅膠柱色譜以甲醇-水(3∶7→1∶0)梯度洗脫，得到32個(gè)流份(Subfr.19-1～Subfr.19-32)。Subfr.19-3(112.8 mg)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱以氯仿-甲醇(1∶1)除雜，再經(jīng)硅膠柱以石油醚-丙酮(10∶1)等梯度洗脫得化合物9(22.5 mg)。Subfr.19-23(155.9 mg)經(jīng)硅膠柱石油醚-氯仿-乙酸乙酯(10∶5∶1→∶1∶2∶1)梯度洗脫得到4個(gè)流份(Subfr.19-23-1～Subfr.19-23-4)。Subfr.19-23-1(12.9 mg)經(jīng)制備TLC以石油醚-氯仿-異丙醇(5∶5∶0.5)展開得到化合物5(6.4 mg)。Subfr.19-23-4(12.7 mg)先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱除雜，再經(jīng)硅膠柱以氯仿-甲醇(60∶1)等梯度洗脫得到化合物6(3.9 mg)。

Fr.26(25.3 mg)經(jīng)C18反相硅膠柱色譜，以甲醇-水(1∶9→1∶0)梯度洗脫，得到12個(gè)流份(subf.26-1～Subfr.26-12)。Subfr.26-2(0.4 g)經(jīng)凝膠柱色譜(100%甲醇)劃分為5個(gè)流份(Subfr.26-2-1～Subfr.26-2-5)，Subfr.26-2-4(82.1 mg)通過(guò)半制備HPLC(C18柱，甲醇-酸水V∶V = 18∶82等梯度洗脫，流速為4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm)分離得到化合物10(5.5 mg，tR=6 min)和11(5.1 mg，tR=8 min)。Subfr.26-4-9(20.0 mg)經(jīng)半制備HPLC(C18柱，甲醇-酸水V∶V = 35∶65等梯度洗脫，流速為4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm)分離得到化合物12(1.3 mg，tR=7 min)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z445[M + H]+；分子式為C30H52O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.20(1H，dd，J= 11.5，4.8 Hz，H-3)，1.22(3H，s，H-29)，1.12(3H，s，H-30)，1.06(3H，s，H-25)，0.97(3H，s，H-26)，0.96(3H，s，H-27)，0.84(3H，s，H-24)，0.81(3H，s，H-23)，0.76(3H，s，H-28)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：38.8(C-1)，27.5(C-2)，79.1(C-3)，39.0(C-4)，55.3(C-5)，18.5(C-6)，34.7(C-7)，41.5(C-8)，55.3(C-9)，37.2(C-10)，21.5(C-11)，29.2(C-12)，37.6(C-13)，43.7(C-14)，27.7(C-15)，35.7(C-16)，44.8(C-17)，48.4(C-18)，50.1(C-19)，73.6(C-20)，28.9(C-21)，40.4(C-22)，28.1(C-23)，15.5(C-24)，16.3(C-25)，16.3(C-26)，15.0(C-27)，19.4(C-28)，24.9(C-29)，31.7(C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物1為monogynol A(圖1)。

圖1 化合物1～12的化學(xué)結(jié)構(gòu)

化合物2白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z457[M + H]+；分子式為C30H48O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.58(1H，s，H-30a)，4.46(1H，s，H-30b)，2.87(1H，m，H-3)，1.54(3H，s，H-29)，1.15(1H，d，J= 12.6 Hz，H-9)，0.83(3H，s，H-27)，0.76(3H，s，H-23)，0.76(3H，s，H-24)，0.66(3H，s，H-26)，0.55(3H，s，H-25)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：38.3(C-1)，27.2(C-2)，76.9(C-3)，38.6(C-4)，55.0(C-5)，18.0(C-6)，34.0(C-7)，40.3(C-8)，50.0(C-9)，36.8(C-10)，20.5(C-11)，25.2(C-12)，37.7(C-13)，42.1(C-14)，30.2(C-15)，31.8(C-16)，55.5(C-17)，48.6(C-18)，46.7(C-19)，150.4(C-20)，29.3(C-21)，36.4(C-22)，28.2(C-23)，15.8(C-24)，15.9(C-25)，16.0(C-26)，14.5(C-27)，177.3(C-28)，19.0(C-29)，109.7(C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物2為樺木酸。

化合物3白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z443[M + H]+；分子式為C30H50O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.68(1H，br s，H-30a)，4.58(1H，br s，H-30a)，3.79(1H，d，J= 10.7 Hz，H-28a)，3.33(1H，d，J= 10.7 Hz，H-28b)，3.18(1H，dd，J= 11.4，4.8 Hz，H-3)，1.68(3H，s，H-29)，1.64(1H，m，H-13)，1.60(1H，m，H-18)，1.02(3H，s，H-26)，0.98(3H，s，H-27)，0.96(3H，s，H-23)，0.82(3H，s，H-25)，0.76(3H，s，H-24)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：38.8(C-1)，27.5(C-2)，79.1(C-3)，39.0(C-4)，55.4(C-5)，18.4(C-6)，34.4(C-7)，41.0(C-8)，50.5(C-9)，37.3(C-10)，21.0(C-11)，25.3(C-12)，37.4(C-13)，42.8(C-14)，27.2(C-15)，29.3(C-16)，47.9(C-17)，48.9(C-18)，47.9(C-19)，150.6(C-20)，29.9(C-21)，34.1(C-22)，28.1(C-23)，15.5(C-24)，16.3(C-25)，16.1(C-26)，14.9(C-27)，60.2(C-28)，19.2(C-29)，109.8(C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物3為白樺酯醇。

化合物4白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z427[M + H]+；分子式C30H50O；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.09(1H，t，J= 7.0 Hz，H-24)，3.23(1H，dd，J= 11.6，4.5 Hz，H-3)，1.68(3H，s，H-26)，1.60(3H，s，H-27)，0.99(3H，s，H-28)，0.97(3H，s，H-19)，0.90(3H，d，J= 6.4 Hz，H-21)，0.87(3H，s，H-30)，0.80(3H，s，H-28)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：36.5(C-1)，28.0(C-2)，79.1(C-3)，39.0(C-4)，50.5(C-5)，18.4(C-6)，26.6(C-7)，134.5(C-8)，134.5(C-9)，37.2(C-10)，21.1(C-11)，31.0(C-12)，44.6(C-13)，49.9(C-14)，31.1(C-15)，28.3(C-16)，50.5(C-17)，15.9(C-18)，19.3(C-19)，36.4(C-20)，18.8(C-21)，35.7(C-22)，25.1(C-23)，125.4(C-24)，131.0(C-25)，25.9(C-26)，17.8(C-27)，15.6(C-28)，28.1(C-29)，24.4(C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物4為羊毛甾醇。

化合物5白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z459[M + H]+；分子式C30H50O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.21(1H，t，J= 7.4 Hz，H-24)，4.01(1H，dd，J= 10.8，4.0 Hz，H-21)，3.82(1H，dt，J= 10.6，2.9 Hz，H-22)，3.71(1H，t，J= 10.6 Hz，H-21)，3.22(1H，dd，J= 11.6，4.5 Hz，H-3)，1.75(3H，s，H-26)，1.68(3H，s，H-27)，0.99(3H，s，H-28)，0.98(3H，s，H-19)，0.85(3H，s，H-30)，0.81(3H，s，H-29)，0.77(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：35.7(C-1)，28.0(C-2)，79.1(C-3)，39.0(C-4)，50.5(C-5)，18.4(C-6)，26.6(C-7)，134.2(C-8)，134.7(C-9)，37.2(C-10)，21.2(C-11)，27.5(C-12)，44.8(C-13)，49.8(C-14)，30.9(C-15)，30.9(C-16)，47.4(C-17)，16.0(C-18)，19.3(C-19)，43.2(C-20)，63.6(C-21)，75.4(C-22)，30.0(C-23)，121.0(C-24)，135.9(C-25)，26.1(C-26)，18.2(C-27)，15.6(C-28)，28.1(C-29)，24.4(C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物5為inoterpene D。

化合物6白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z457[M + H]+；分子式C30H48O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：8.31(1H,s，H-21)，5.44(1H，d，J= 6.3 Hz，H-7)，5.36(1H，d，J= 6.4 Hz，H-11)，3.00(1H，m，H-3)，1.09(3H，s，H-26)，1.06(3H，s，H-27)，0.91(3H，s，H-28)，0.90(3H，s，H-19)，0.84(3H，s，H-30)，0.77(3H，s，H-29)，0.56(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：35.4(C-1)，27.5(C-2)，76.8(C-3)，38.3(C-4)，48.9(C-5)，22.6(C-6)，119.7(C-7)，142.5(C-8)，145.7(C-9)，37.0(C-10)，116.1(C-11)，34.8(C-12)，43.4(C-13)，49.5(C-14)，31.1(C-15)，26.3(C-16)，48.9(C-17)，16.4(C-18)，22.5(C-19)，48.7(C-20)，79.1(C-21)，24.0(C-22)，28.2(C-23)，57.7(C-24)，70.7(C-25)，28.7(C-26)，27.1(C-27)，16.1(C-28)，28.3(C-29)，25.5(C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物6為inonotsutriol C。

化合物7白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z445[M + H]+；分子式C29H48O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.39(1H，m，H-7)，5.21(1H，dd，J= 15.3，7.3 Hz，H-23)，5.15(1H，dd，J= 15.3，8.0 Hz，H-22)，4.04(1H，tt，J= 11.0，4.8 Hz，H-3)，3.38(3H，s，6-OCH3)，3.16(1H，d，J= 4.7 Hz，H-6)，2.02(1H，m，H-20)，1.84(1H，m，H-24)，1.01(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，0.99(3H，s，H-19)，0.91(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)，0.83(3H，d，J= 6.4 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J= 6.5 Hz，H-27)，0.58(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：32.9(C-1)，31.0(C-2)，67.9(C-3)，39.7(C-4)，76.5(C-5)，82.6(C-6)，115.1(C-7)，143.8(C-8)，44.0(C-9)，37.4(C-10)，22.3(C-11)，39.5(C-12)，44.0(C-13)，55.1(C-14)，23.0(C-15)，28.1(C-16)，56.1(C-17)，12.4(C-18)，18.5(C-19)，40.5(C-20)，21.2(C-21)，135.6(C-22)，132.2(C-23)，42.9(C-24)，33.2(C-25)，20.1(C-26)，19.8(C-27)，17.7(C-28)，58.4(6-OCH3)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物7為(3β,5α,6β,22E)-6-methoxyergosta-7,22-diene-3,5-diol。

化合物8白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z429[M + H]+；分子式C28H44O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.50(1H，d，J= 8.4 Hz，H-7)，6.24(1H，d，J= 8.4 Hz，H-6)，5.21(1H，dd，J= 15.3，7.5 Hz，H-23)，5.13(1H，dd，J= 15.2，8.3 Hz，H-22)，3.96(1H，dd，J= 10.6，4.6 Hz，H-3)，0.99(3H，d，J= 6.4 Hz，H-21)，0.90(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)，0.88(3H，s，H-19)，0.82(3H，d，J= 7.3 Hz，H-26)，0.81(1H，d，J= 7.3 Hz，H-27)，0.80(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：34.8(C-1)，30.2(C-2)，66.6(C-3)，37.1(C-4)，82.3(C-5)，135.3(C-6)，130.9(C-7)，79.6(C-8)，51.2(C-9)，37.1(C-10)，20.8(C-11)，39.5(C-12)，44.7(C-13)，51.8(C-14)，23.5(C-15)，28.8(C-16)，56.3(C-17)，13.0(C-18)，18.3(C-19)，39.9(C-20)，21.0(C-21)，135.5(C-22)，132.4(C-23)，42.9(C-24)，33.2(C-25)，20.1(C-26)，19.8(C-27)，17.7(C-28)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物8為過(guò)氧化麥角甾醇。

化合物9白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z169[M + H]+；分子式C8H8O4；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.47(1H，m，H-7)，7.46(1H，m，H-3)，6.75(1H，d，J= 8.8 Hz，H-4)，3.80(3H，s，H-8)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：170.04(C-1)，123.02(C-2)，113.73(C-3)，115.79(C-4)，152.59(C-5)，148.59(C-6)，125.24(C-7)，56.35(C-8)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物9為香草酸。

化合物10黃色油狀(MeOH)；ESI-MS：m/z259[M + H]+；分子式C14H10O5；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：9.69(1H，s，H-8)，7.33(1H，m，H-6)，7.32(1H，m，H-5′)，6.91(1H，d，J= 8.0 Hz，H-7)，6.85(1H，s，H-2′)，6.74(2H，s，H-4，6′)，5.22(1H，s，H-2)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：104.8(C-2)，115.8(C-4)，130.8(C-5)，126.4(C-6)，116.2(C-7)，147.2(C-8)，153.7(C-9)，193.1(C-10)，146.1(C-1′)，114.8(C-2′)，146.7(C-3′)，131.1(C-4′)，115.4(C-5′)，119.4(C-6′)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物10為2-(3′,4′-二羥苯基)-1,3-胡椒環(huán)-5-醛。

化合物11無(wú)色油狀(MeOH)；ESI-MS：m/z243[M + H]+；分子式C11H14O6；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：9.40(1H，s，OH-4)，7.28(2H，s，H-2，H-6)，5.10(1H，d，J= 6.9 Hz，OH-8)，4.99(1H，m，H-8)，4.74(1H，t，J= 5.9 Hz，OH-9)，3.82(6H，s，OCH3-3，OCH3-5)，3.68(1H，m，H-9a)，3.60(1H，m，H-9b)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：125.5(C-1)，106.6(C-2)，147.5(C-3)，141.1(C-4)，147.5(C-5)，106.6(C-6)，198.4(C-7)，73.8(C-8)，64.4(C-9)，56.2(OCH3-1，OCH3-2)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物11為2,3-二羥基-1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙酮。

化合物12無(wú)色油狀(MeOH)；ESI-MS：m/z227[M + H]+；分子式C11H14O5；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.33(2H，s，H-2，H-6)，3.95(1H，t，J= 6.2 Hz，H-9)，3.91(6H，s，OCH3-3，OCH3-5)，3.19(3H，t，J= 6.2 Hz，H-8)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：129.3(C-1)，107.3(C-2)，149.0(C-3)，142.6(C-4)，149.0(C-5)，107.3(C-6)，199.7(C-7)，41.7(C-8)，58.9(C-9)，56.9(OCH3-3，OCH3-5)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定化合物12為3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)propan-1-one。

4 活性測(cè)試

4.1 膽堿酯酶抑制活性測(cè)試

采用Ellman法[20]測(cè)定各單體化合物的乙/丁酰膽堿酯酶抑制活性。取150 μL PBS緩沖液(pH為8.0)、10 μL待測(cè)化合物溶液和20 μL乙/丁酰膽堿酯酶溶液(濃度為0.1 U/mL)于96孔板中，于30℃放置15 min后，依次加入10 μL 5，5′-二硫-雙-2-硝基苯甲酸溶液(DTNB，濃度為2 mM)和10 μL碘代硫代乙酰膽堿溶液(AICI，濃度為10 mM)/10 μL硫代碘代丁酰膽堿溶液(BICI，濃度為10 mM)，充分混勻，30 min后，在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定并記錄每孔的吸光度，重復(fù)三次取平均值。以他克林作為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO作為陰性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)操作3次。按下面公式計(jì)算各濃度下的抑制率，并計(jì)算得到化合物對(duì)乙/丁酰膽堿酯酶的半抑制濃度(IC50值)。

結(jié)果(表1)顯示化合物2和3具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制作用，化合物2、3、4和6顯示有較好的丁酰膽堿酯酶抑制活性，其他化合物均未表現(xiàn)出明顯活性。

表1 化合物的膽堿酯酶抑制活性

4.2 化合物對(duì)膽堿酯酶的動(dòng)力學(xué)測(cè)試

按照“4.1”方法，在不同底物[S]和樣品的濃度下，分別測(cè)定各反應(yīng)體系的吸光度變化率，以底物濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)初始速率的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖。然后根據(jù)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率數(shù)值(Vmax)的變化可判斷抑制類型。以化合物濃度為橫坐標(biāo)，雙倒數(shù)圖中各個(gè)濃度直線的斜率為縱坐標(biāo)，作二級(jí)曲線圖，與X軸的截距為抑制常數(shù)Ki。

競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑的雙倒數(shù)方程可表示為：

混合型抑制劑的雙倒數(shù)方程可表示為：

式中，[S]為底物濃度，[I]為抑制劑濃度，Vmax為最大速率，Km為米氏常數(shù)，Ki和Kis分別表示抑制劑與游離酶和酶-底物復(fù)合物結(jié)合的解離常數(shù)。

由化合物2(A)和3(B)抑制乙酰膽堿酯酶的雙倒數(shù)圖(圖2)可知，所有直線均交于第二象限內(nèi)，該結(jié)果表明，化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制屬于混合型抑制劑，化合物既可以和游離酶結(jié)合也可以和酶-底物復(fù)合物結(jié)合。由化合物2(C)和3(D)抑制丁酰膽堿酯酶雙倒數(shù)圖(圖3)可知，所有直線均交于Y軸，該結(jié)果表明，化合物2、3對(duì)丁酰膽堿酯酶的抑制均屬于競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，化合物與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的結(jié)合位點(diǎn)。

圖2 化合物2(A)和3(B)抑制乙酰膽堿酯酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖

圖3 化合物2(C)和3(D)抑制丁酰膽堿酯酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖

4.3 細(xì)胞毒活性測(cè)定

采用MTT法[21]測(cè)定化合物的腫瘤細(xì)胞抑制活性，分別在96孔板上接種100 μL濃度約5×104個(gè)/mL的待測(cè)細(xì)胞，于37 ℃，5% CO2，90%以上濕度條件下培養(yǎng)24 h，加入100 μL待測(cè)化合物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，向每孔細(xì)胞中加入15 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，4 h后吸走上清液，再向每孔加入100 μL DMSO，使其充分溶解。在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的OD值，按下面公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。陽(yáng)性對(duì)照組為鹽酸阿霉素，陰性對(duì)照組為DMSO，待測(cè)化合物設(shè)為5個(gè)濃度梯度，橫坐標(biāo)表示待測(cè)化合物濃度，縱坐標(biāo)表示抑制率，作圖求出待測(cè)化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

對(duì)化合物1～6和9～12進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)試，結(jié)果(表2)表明化合物1、5和6對(duì)不同的細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的抑制活性，化合物4、9、10、11和12對(duì)檢測(cè)的所有細(xì)胞均沒有細(xì)胞毒性(IC50> 100)。

表2 樺褐孔菌中化合物的細(xì)胞毒活性

5 討論

樺褐孔菌具有悠久的民間藥用歷史，在臨床應(yīng)用方面療效顯著，在糖尿病、抗腫瘤等藥用領(lǐng)域顯示出較好療效，目前已成為國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。樺褐孔菌的藥理活性主要集中在抗腫瘤，降血糖等方面，對(duì)于其他方面的活性研究較少，因此有必要探索其潛在的其他生物活性，為充分挖掘其潛在價(jià)值提供理論支持。本研究對(duì)樺褐孔菌乙醇提取物的乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，共分離鑒定了12個(gè)化合物，其中化合物1、10和11為首次從樺褐孔菌中分離得到?；钚院Y選結(jié)果顯示，化合物1、5和6對(duì)多種腫瘤細(xì)胞顯示出較好的細(xì)胞毒活性，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道化合物2和3對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有較好的細(xì)胞毒活性[22，23]，佐證了樺褐孔菌的抗腫瘤活性。除此之外，化合物2、3、4和6的丁酰膽堿酯酶抑制活性較好，化合物2和3對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性較好。通過(guò)動(dòng)力學(xué)分析闡明了這些化合物與膽堿酯酶的酶抑制機(jī)制，化合物2和3為乙酰膽堿酯酶混合型抑制劑，化合物能與乙酰膽堿酯酶的活性部位結(jié)合，也可以與酶和底物的復(fù)合物結(jié)合從而抑制其活性；而對(duì)丁酰膽堿酯酶則屬于競(jìng)爭(zhēng)型抑制，通過(guò)與其催化中心的活性位點(diǎn)相結(jié)合從而抑制其活性。膽堿酯酶是參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種關(guān)鍵酶，神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默病(AD)就與大腦內(nèi)乙酰膽堿的缺失有關(guān)，因此開發(fā)針對(duì)膽堿酯酶有活性的藥物意義重大。本文初步闡釋了化合物2和3抑制膽堿酯酶的作用機(jī)制，為樺褐孔菌針對(duì)阿爾茲海默病開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。