張海鵬，鐘佑宏，段存娟，郭 牧，段 彪，李 偉，王 鵬，吳鶴松

梁河縣位于云南省西部，地處東經(jīng)98°09′-98°39′，北緯24°35′-24°56′，年平均氣溫18.28 ℃，年均降水量1 334 mm，是云南省家鼠鼠疫疫源地。自1870年有鼠疫的流行記載以來，1944年到1955年發(fā)生人間病例2 047例[1]，之后進入微弱流行期，只在鼠間偶有分離到鼠疫菌。80年代鼠疫復燃，1990年于遮島鎮(zhèn)、九保鄉(xiāng)再次暴發(fā)鼠間鼠疫，流行至2001年，并出現(xiàn)1例人間腺鼠疫[2]，之后漸漸轉弱，2007年在鼠間偶有流行。2008年至今，持續(xù)監(jiān)測未發(fā)現(xiàn)鼠疫流行的相關信息，鼠疫流行進入靜息期。噬菌體是一種具有嚴格宿主特異性只感染一種細菌或只寄居在宿主菌體內而不感染哺乳動物細胞的病毒[3-4]。梁河縣家鼠鼠疫疫源地中有無鼠疫噬菌體的存在，鼠疫噬菌體在不同的宿主動物中攜帶率是否有差異，其對鼠疫的流行與靜息是否有特殊意義。為此本研究對梁河縣家鼠鼠疫疫源地曾流行過鼠疫的鄉(xiāng)鎮(zhèn)進行鼠疫噬菌體分離鑒定。

1 材料與方法

1.1標本來源 2017年選取梁河縣4個曾流行過鼠疫的鄉(xiāng)鎮(zhèn)(九保鄉(xiāng)、芒東鎮(zhèn)、河西鄉(xiāng)、遮島鎮(zhèn))利用鼠鋏法捕獲的鼠類動物經(jīng)鑒定后在無菌條件下解剖，取腸置于盛有10 mL改良PBS增菌液的培養(yǎng)管中，4 ℃冰箱保存待檢。

1.2主要儀器設備、培養(yǎng)基和試劑 日立HT770透射電鏡、0.22 μm除菌濾器、恒溫氣浴振蕩培養(yǎng)箱；改良PBS增菌液、LB培養(yǎng)基(固、液)均按常規(guī)方法制備和保存。

1.3鼠疫噬菌體的分離[5-6]將增菌液用0.22 μm除菌濾器過濾，獲得噬菌體原液，吸取10 mL加入到含有EV76菌懸液100 μL的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，充分混勻，置培養(yǎng)箱28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。取200 μL再次過濾的上清，加入100 μL EV76菌懸液充分混勻，傾倒雙層平板，置28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察有無噬菌斑。

1.4鼠疫噬菌體的純化 挑取單個噬菌斑加入到含有對數(shù)生長期鼠疫疫苗株EV76菌懸液300 μL的30 mL LB液體培養(yǎng)基中，重復進行單斑增殖6次，使所分噬菌體得到純化。

1.5鼠疫噬菌體電鏡掃描樣本制備[5-6]制作EV菌雙層平板，在表面滴加噬菌體，20 h左右形成大塊噬斑，用接種環(huán)取下上層半固體，浸泡于200 μL生理鹽水中1 h左右得到樣本，經(jīng)醋酸鈾染色，80 kV，放大倍數(shù)1 000～200 000條件下電鏡觀察。

2 結 果

2.1不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)分離鼠疫噬菌體結果 2017年梁河4鄉(xiāng)鎮(zhèn)共捕鼠338只，其中芒東鎮(zhèn)捕鼠207只、九保鄉(xiāng)捕鼠51只、河西鄉(xiāng)捕鼠49只、遮島鎮(zhèn)捕鼠31只。共分離到29株鼠疫噬菌體，總分離率為8.58%。其中遮島鎮(zhèn)分離到5株鼠疫噬菌體，分離率16.13%，分離率最高，將近總分離率的2倍，河西鄉(xiāng)分離到6株鼠疫噬菌體，分離率12.24%，九保鄉(xiāng)分離到6株鼠疫噬菌體，分離率11.76%，芒東鎮(zhèn)分離到12株鼠疫噬菌體，分離率5.8%為最低，詳見表1與圖1。

2.2不同鼠種鼠疫噬菌體的分離結果 本次調查捕獲的338只宿主動物包括野鼠、家鼠及其它野生小獸共14種，其中黃胸鼠為優(yōu)勢宿主動物，共捕獲234只，占此次捕獲動物總數(shù)的69.23%，其次為臭鼩鼱，捕獲率為12.82%。從234只黃胸鼠中分離到19株鼠疫噬菌體，分離率為8.12%；從43只臭鼩鼱中分離到8株鼠疫噬菌體，分離率為18.6%，詳見表2與圖1。

2.3所分噬菌體的噬菌斑 29株鼠疫噬菌體噬斑表現(xiàn)出多態(tài)性。有噬斑較大(直徑≥2.0 mm)且透明(如143號)者，有噬斑中等(2.0 mm≥直徑≥1.0 mm)且透明者(如337號)，有噬斑較小(直徑<1.0 mm)且半透明者(如72號與332號)，詳見圖2。

圖1 梁河縣4鄉(xiāng)鎮(zhèn)不同鼠種中分離鼠疫噬菌體地理圖Fig.1 Geographic map of Yersinia pestis phage isolated from different rats in 4 towns of Lianghe County

表2 梁河縣不同宿主動物鼠疫噬菌體的分離結果Tab.2 Results of Yersinia pestis phage isolation in different host animals in LiangHe County

圖2 梁河縣鼠中分離4株鼠疫噬菌體的噬菌斑圖Fig.2 Phage map of 4 Yersinia pestis phage isolated from rats in Lianghe County

2.4所分噬菌體的電鏡照片 選取2株鼠疫噬菌體使用HT770透射電鏡進行電鏡掃描，放大200 000倍觀察，如圖3所示，這2株鼠疫噬菌體均為肌尾型鼠疫噬菌體，其中LHS143號鼠疫噬菌體頭部直徑大約71 nm，尾長129 nm，LHS250號鼠疫噬菌體頭部直徑大約50 nm，尾長86 nm。

圖3 梁河縣鼠中分離2株鼠疫噬菌體的電鏡照片F(xiàn)ig.3 Electron micrograph of 2 Yersinia pestis phage isolated from rats in Lianghe County

3 討 論

3.1梁河家鼠鼠疫疫源地內廣泛存在鼠疫噬菌體

梁河縣在歷史上曾猖獗地流行過鼠疫，自1955-1956年控制了人間和鼠間鼠疫以來，鼠間仍有疫情[7]。2001年發(fā)生一次人間腺鼠疫，之后進入靜息期。本次研究在曾經(jīng)流行過鼠疫的4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)均分離到了鼠疫噬菌體，其中縣城所在地遮島鎮(zhèn)分離到5株鼠疫噬菌體，分離率最高(16.13%)，因其地理位置重要，人員密集，又是鼠疫流行過的疫點，加之鼠疫噬菌體分離率較高，在防控鼠疫中，應列在首位；芒東鎮(zhèn)分離到12株鼠疫噬菌體，分離率最低(5.8%)，證實了梁河家鼠鼠疫疫源地內廣泛存在鼠疫噬菌體，并且其攜帶率高于劍川縣與鶴慶縣野鼠鼠疫疫源地鼠疫噬菌體攜帶率[5-6](分別是1.4%及0.65%)。鼠疫噬菌體主要依靠鼠疫菌而生存，樣本中分離到鼠疫噬菌體，表明可能存在鼠疫菌或不久前曾感染過鼠疫菌[8]。本次研究在靜息疫點分離到鼠疫噬菌體，而未分離到鼠疫菌，可能是因為鼠疫菌發(fā)生了某種用現(xiàn)有檢測手段無法檢出的變異，只能充當鼠疫噬菌體的宿主；也可能是因為鼠疫流行后期，在人為干預下逐漸建立了新的生態(tài)平衡，疫源地再次靜息[9]，從而未能分離到鼠疫菌；又或者因為鼠疫噬菌體較強的生存能力[10]致使其脫離宿主后還可生存較長時間，因此在相當長的靜息期內仍可分離到鼠疫噬菌體。

3.2臭鼩鼱較黃胸鼠中有較高的鼠疫噬菌體攜帶率 梁河縣家鼠鼠疫疫源地內存在十幾種嚙齒動物，其中以黃胸鼠為優(yōu)勢種，占59.83%，臭鼩鼱是僅次于黃胸鼠的鼠疫菌宿主[7]，在鼠疫流行期，臭鼩鼱體內鼠疫菌的檢出率明顯高于黃胸鼠的檢出率。本次研究從234只黃胸鼠中分離到19株鼠疫噬菌體，分離率為8.12%；從43只臭鼩鼱中分離到8株鼠疫噬菌體，分離率為18.6%，從11只錫金小鼠中分離到1株鼠疫噬菌體，分離率為9.1%；從僅有的1只卡氏小鼠中亦分離到1株鼠疫噬菌體。一個值得注意的現(xiàn)象是此次臭鼩鼱中鼠疫噬菌體的分離率要明顯高于黃胸鼠中的分離率，分析其原因，可能是因為臭鼩鼱可棲息于室內、農耕區(qū)、灌木叢等地，活動范圍與生存能力較黃胸鼠(家鼠)強，接觸感染鼠疫噬菌體的機會更大。另外，在卡氏小鼠(家鼠)與錫金小鼠(家鼠)中均分離到鼠疫噬菌體，提示我們在鼠疫防控中，除了重視主要宿主黃胸鼠以外，其他家鼠也不能忽視。

3.3所分離的鼠疫噬菌體具有多態(tài)性 本研究中選取有代表性的2株噬菌體進行電鏡掃描，LHS143與LHS250均為肌尾病毒科鼠疫噬菌體，NCBI中公布的已測序完成的鼠疫噬菌體中有3株屬于肌尾病毒科噬菌體[11-12]，且經(jīng)基因比對3株之間無同源性[13]，表明肌尾病毒科鼠疫噬菌體基因組具有多態(tài)性。本研究分離的噬菌體噬斑表現(xiàn)出多態(tài)性，推測它們的基因組也可能具有多態(tài)性，需要對其基因組進一步研究。

利益沖突：無