危芙蓉，朱慧慧，賈孝凱，汪俊云

鉤蟲是3種主要的土源性線蟲之一，寄生人體的鉤蟲主要由十二指腸溝口線蟲(AncylostomaDuodenaleDubini,1843)，簡(jiǎn)稱十二指腸鉤蟲和美洲板口線蟲(NecatorAmericanusStiles，1902)，簡(jiǎn)稱美洲鉤蟲。鉤蟲呈全球性分布，據(jù)估計(jì)有4億7 200萬人感染，造成400萬殘疾調(diào)整生命年(DALYs)[1]。 雖然我國(guó)鉤蟲感染率顯著下降，從1988-1992年全國(guó)人體寄生蟲分布調(diào)查時(shí)的17.17%，到2014-2016年全國(guó)人體重點(diǎn)寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查時(shí)的2.62%，但在人群土源性線蟲感染中，鉤蟲感染率明顯高于蛔蟲和鞭蟲[2]。因此，鉤蟲病是嚴(yán)重危害人們健康的重要公共衛(wèi)生問題。

對(duì)鉤蟲病的檢測(cè)目前極大依賴鏡檢法，該方法敏感度和特異度低，并依賴于檢測(cè)人員的鏡檢能力。而十二指腸鉤蟲和美洲鉤蟲蟲卵無法通過鏡檢法鑒別，需進(jìn)一步孵化出鉤蚴以鑒別確診。然而，隨著防治工作的進(jìn)展，鉤蟲病的感染率和感染度逐漸降低[2-3]，此法已難以應(yīng)用于大規(guī)模監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。而免疫學(xué)法檢測(cè)的敏感性和特異性均存在局限，建立更敏感特異、簡(jiǎn)便快速的鉤蟲病檢測(cè)方法是防治工作亟待解決的問題。核糖體轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列(ITS)在種內(nèi)具有高度保守性，而在種間顯示不同程度的差異，因此已應(yīng)用于鉤蟲的分子檢測(cè)[4-6]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是近年發(fā)展起來的高效、簡(jiǎn)便的DNA擴(kuò)增技術(shù)[7]，近年來逐漸應(yīng)用于糞便中病原體DNA的檢測(cè)[8-9]。本研究以美洲鉤蟲ITS序列為目標(biāo)序列，通過軟件設(shè)計(jì)特異引物應(yīng)用于LAMP擴(kuò)增美洲鉤蟲ITS序列，并優(yōu)化擴(kuò)增條件，對(duì)建立的LAMP方法評(píng)價(jià)其檢測(cè)的靈敏度和特異性，并應(yīng)用現(xiàn)場(chǎng)樣本評(píng)價(jià)其檢測(cè)的敏感性和特異性，從而建立起以蟲卵為檢測(cè)材料的檢測(cè)美洲鉤蟲病的LAMP法，為美洲鉤蟲病提供特異、敏感、快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，從而有助于我國(guó)鉤蟲病的防治。

1 材料與方法

1.1樣本來源 美洲鉤蟲蟲卵由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所藥物室提供。日本血吸蟲成蟲、鞭蟲成蟲、豬蛔蟲成蟲、蟯蟲成蟲由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所健教中心提供。人糞便樣本來自2017年四川省隆昌縣、安徽省桐城市現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所土食源室和安徽省桐城市血防所提供。新鮮的糞樣，經(jīng)改良加藤法鏡檢后，4 ℃保存，用于核酸提取。

1.2主要試劑 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒購于北京藍(lán)譜生物科技有限公司，常用DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒均購于德國(guó)Qiagen公司，Taq聚合酶、DNA標(biāo)記物均購于日本TaKaRa公司，瓊脂糖購自美國(guó)Promega公司，PCR儀(C1000TM Thermal Cycler)、電泳儀(PowerPac Basic)和凝膠成像系統(tǒng)(Molecular Imager Gel Doc XR System)均為美國(guó)BioRad公司產(chǎn)品。

1.3DNA提取 寄生蟲樣本按照試劑盒的操作步驟操作。提取糞便DNA樣本時(shí)，在糞便樣品中加入少量0.1mm玻璃珠，經(jīng)高速震蕩混懸后，按照QlAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒的操作步驟操作。提取的DNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中美洲鉤蟲ITS基因(登錄號(hào) LC036565.1)序列設(shè)計(jì)LAMP擴(kuò)增引物，其中包括1對(duì)外引物(F3和B3)和1對(duì)內(nèi)引物(FIP和BIP)。F3：5′-TTCAATCGCAATGGCTTG-3′ B3：5′-CTCACATTGGGCTAAAAAGG-3′ FIP：5′-TCGACGATGATCCATCTGCAAACCGGGTAAAAGTCGTAAC-3′ BIP：5′-CATGATCTAGAGAAACCAACACGCGTGGTG-ATACTCCCAACTT-3′。并參照文獻(xiàn)[5]合成PCR引物，RTHW1F：5′-GATGAGCATTGCWTGAATGCCG-3′ RTHW1R：5′-GCAAGTRCCGTTCGACAAACAG-3′，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.5LAMP的敏感度和特異度評(píng)價(jià) 美洲鉤蟲DNA(濃度1 200 pg/mL)，按10倍稀釋為120 pg/mL、12 pg/mL、1.2 pg/mL、120 fg/mL、12 fg/mL、1.2 fg/mL和0.12 fg/mL后模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)。以日本血吸蟲、鞭蟲、豬蛔蟲、蟯蟲等DNA為模板，進(jìn)行LAMP檢測(cè)方法，觀察是否存在交叉反應(yīng)。

1.6LAMP檢測(cè) 反應(yīng)體系為25 μL，取糞樣DNA 2.0 μL，依次加入12.5 μL 2×反應(yīng)緩沖液、1.0 μL引物混合物(1.6 μmol/L的FIP和BIP、0.2 μmol/L的F3和B3)，1.0 μL Bst DNA聚合酶(8U)以及1.0 μL鈣黃綠素顯色劑，加無核酸酶水至總體積25 μL，充分混勻后將反應(yīng)管置于63 ℃水浴孵育70 min。反應(yīng)結(jié)束后，肉眼觀察各反應(yīng)管的顏色，綠色為陽性，棕色為陰性。以美洲鉤蟲蟲卵DNA為陽性對(duì)照、無核酸酶水為陰性對(duì)照。

1.7PCR檢測(cè)及產(chǎn)物鑒定 25 μL PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μL、dNTP混合液(10 mmol/L)1 μL、正反向引物各1 μL(10 mmol/L)、Taq酶1 μL(5 U/μL)、DNA模板1 μL，加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果登陸GenBank進(jìn)行序列比對(duì)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)算LAMP相對(duì)鏡檢法和PCR法檢測(cè)美洲鉤蟲的敏感性和特異性。敏感性和特異性的計(jì)算公式如下：敏感性(%)=[真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))]×100%；特異性=[真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))]×100%。LAMP和PCR檢測(cè)結(jié)果，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)敏感性和特異性進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1LAMP檢測(cè)美洲鉤蟲靈敏度和特異度 已建立的LAMP法，與日本血吸蟲、鞭蟲、豬蛔蟲、蟯蟲、肺吸蟲均未見交叉反應(yīng)。以美洲鉤蟲20條成蟲DNA為模板，按10倍稀釋為120 pg/mL、12 pg/mL、1.2 pg/mL、120 fg/mL、12 fg/mL、1.2 fg/mL和0.12 fg/mL后模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)，LAMP法可檢測(cè)出稀釋度為1.2 fg/mL的樣本，即極限D(zhuǎn)NA濃度為1.2 fg/mL，見圖1。

圖1 以美洲鉤蟲成蟲DNA為模板的LAMP法敏感性評(píng)價(jià)Fig.1 Sensitivity evaluation of LAMP method based on DNA of adult hookworm

2.2患者和健康人糞樣檢測(cè)結(jié)果 現(xiàn)場(chǎng)采集的糞便樣本，分別用Kato-Katz法、PCR法和LAMP法檢測(cè)美洲鉤蟲感染情況。將本研究建立的LAMP法分別與Kato-Katz法和PCR法檢測(cè)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，LAMP法相對(duì)Kato-Katz法的敏感性和特異性分別為95.24%和97.06%(見表1)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.5，P=0.479 5)。LAMP法相對(duì)PCR法的敏感性和特異性均為100%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表2，圖2)。

表1 LAMP法和鏡檢法檢測(cè)結(jié)果比較Tab.1 Comparison test between LAMP and Kato-Katz

表2 LAMP法和PCR法檢測(cè)結(jié)果比較Tab.2 Comparison test between LAMP and PCR

A：M為DNA標(biāo)記物、P為陽性對(duì)照、N為陰性對(duì)照。1、3、4、6、8和9為PCR陽性的糞便樣本，2、5、7為PCR陰性的糞便樣本。B：P為陽性對(duì)照、N為陰性對(duì)照。1、3、4、6、8和9為L(zhǎng)AMP陽性的糞便樣本，2、5、7為L(zhǎng)AMP陰性的糞便樣本。圖2 PCR (A)和LAMP (B)檢測(cè)糞便樣本中美洲鉤蟲的結(jié)果Fig.2 Detection of N. Americanus of fecal samples by PCR (A) and LAMP (B), respectively

3 討 論

傳統(tǒng)的運(yùn)用形態(tài)學(xué)方法鏡檢鉤蟲的手段，所需儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，但一方面要求檢測(cè)者具有較高的專業(yè)知識(shí)，需要通過長(zhǎng)期的訓(xùn)練達(dá)到較熟練的技術(shù)，與檢測(cè)者的經(jīng)驗(yàn)存在較大關(guān)聯(lián)。另一方面對(duì)待檢樣本也有較高要求，首先要保證樣本的新鮮度，短時(shí)內(nèi)需要金策。同時(shí)，對(duì)于輕度感染患者，驅(qū)蟲后獲取的蟲體較少或蟲體破損等均會(huì)影響檢查者的判斷[10]。因此，傳統(tǒng)檢測(cè)方法在低感染率流行區(qū)做大規(guī)模流行病學(xué)篩查費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，具有較高敏感度和特異度的檢測(cè)方法被應(yīng)用于鉤蟲檢測(cè)中，如PCR技術(shù)[11]，彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)分類上的不足。進(jìn)一步實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[12-13]，減少了原始PCR技術(shù)中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳觀察條帶步驟。但以上PCR技術(shù)必須在一定的實(shí)驗(yàn)室條件下完成，對(duì)儀器設(shè)備有一定的要求。LAMP是一種新的核酸擴(kuò)增方法，具有敏感、特異、簡(jiǎn)易、快速等特點(diǎn)，無需高端儀器設(shè)備，可直接用肉眼觀察結(jié)果，已應(yīng)用于病原檢測(cè)中。

本研究建立的LAMP法以檢測(cè)糞便中美洲鉤蟲蟲卵為目的，可有效檢測(cè)DNA濃度低至1.2 fg/mL的樣本，在目前感染率較低的國(guó)情下，降低了漏檢率，為篩查和治療提供了有效的診斷手段。在LAMP法與Kato-Katz法對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)Kato-Katz法陽性，而LAMP陰性的情況，原因可能是由于蟲卵在糞便中分布不均，隨機(jī)抽取糞樣時(shí)存在漏檢的情況。本研究中，Kato-Katz法一糞三檢，而LAMP法僅隨機(jī)抽取一份樣本，因此漏檢率顯著增高。然而在檢測(cè)樣本量降低2/3的情況下，LAMP法相對(duì)Kato-Katz法能達(dá)到極高的敏感性和特異性，說明了本研究中LAMP法具有較大的現(xiàn)場(chǎng)推廣價(jià)值。

為提高LAMP法的敏感度和特異度，可從以下2個(gè)方面避免假陰性和假陽性情況。第一，提高鉤蟲蟲卵DNA提取效率。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于美洲鉤蟲蟲卵卵殼具有一定的保護(hù)能力，因此DNA提取時(shí)需要采取措施破壁以釋放DNA。本實(shí)驗(yàn)在糞樣中加入0.1 mm玻璃珠，經(jīng)高速震蕩后，按照試劑盒的手冊(cè)進(jìn)行操作，可有效提取鉤蟲蟲卵DNA，提高檢出率。第二，減少污染以降低假陽性率的發(fā)生?；贚AMP法的高靈敏度，該法容易出現(xiàn)假陽性情況。正確的實(shí)驗(yàn)操作手法，避免實(shí)驗(yàn)試劑的污染。同時(shí)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，避免打開反應(yīng)管，有效避免氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

利益沖突：無