魏丹丹，謝中藝，楊帆帆，尹芬芬，黃新祥，張 盈

VI型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system，T6SS)存在于約25%的革蘭陰性細(xì)菌中，是2006年P(guān)ukatzki等[1]首次在霍亂弧菌(V.cholerae)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)菌膜表面結(jié)構(gòu)類似于T4噬菌體，以一步法將效應(yīng)因子分泌至胞外的分泌系統(tǒng)[2]。T6SS可將毒性效應(yīng)物注入真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，進(jìn)而可被細(xì)菌用于破壞真核宿主細(xì)胞或?qū)蛊渌?xì)菌，而表達(dá)T6SS的細(xì)菌自身可合成免疫蛋白，以防止自我中毒或成為周圍同類細(xì)菌群體的攻擊目標(biāo)[3]。T6SS自發(fā)現(xiàn)以來(lái)被認(rèn)為是革蘭氏陰性菌重要的毒力決定因子[4]。本文主要圍繞T6SS分泌裝置的結(jié)構(gòu)、表達(dá)及其功能來(lái)進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 T6SS的結(jié)構(gòu)

在單個(gè)細(xì)菌基因組中常發(fā)現(xiàn)多個(gè)T6SS基因簇，例如副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)有2個(gè)T6SS基因簇[5]、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(B.pseudomallei)有6個(gè)T6SS基因簇[6]，它們的功能通常不具有冗余性。

T6SS是由13種VI型分泌系統(tǒng)核心結(jié)構(gòu)蛋白(Tss)組成的收縮裝置[7]。這個(gè)收縮裝置由3個(gè)主要復(fù)合物構(gòu)成：跨膜復(fù)合物、底板復(fù)合物和尾刺。以腸集聚性大腸埃希菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli，EAEC)為例(圖1)。

1.1跨膜復(fù)合物 該復(fù)合物通常由3種蛋白質(zhì)TssM，TssL和TssJ組成，構(gòu)成1個(gè)環(huán)狀的通道結(jié)構(gòu)跨越細(xì)胞膜[8]。TagL直接與TssL作用，通過(guò)單一的C-末端TMS(跨膜片段)將裝置錨定在膜上[9]。

1.2底板復(fù)合物 由TssE，TssF，TssG和TssK形成的底板復(fù)合物可連接跨膜復(fù)合物和尾部。組成底板復(fù)合物的這4種蛋白質(zhì)的比例是1∶2∶1∶6。TssG肽是核心，2個(gè)TssF與TssG一起形成三角形狀，而TssG的2個(gè)擴(kuò)展區(qū)域分別與2個(gè)TssK三聚體連接[10]。

1.3尾刺 尾刺主要由溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)六聚體形成的內(nèi)管及其頂部的尖峰復(fù)合物組成。尖峰復(fù)合物由纈氨酸-甘氨酸重復(fù)蛋白G(VgrG)的三聚體組成，并且在大多數(shù)情況下與脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸重復(fù)蛋白(PAAR)共同組成[10]，Hcp和VgrG同時(shí)也是分泌至胞外的轉(zhuǎn)位蛋白[11]。由TssB-TssC(VipA/VipB)組成的收縮鞘圍繞著尾刺[12]。尾部的組裝需要TssA，其與基板復(fù)合物，內(nèi)管和鞘組件相互作用并穩(wěn)定尾管的遠(yuǎn)端[13]。ClpB家族的AAA+ ATPase ClpV(TssH)可將尾管鞘解聚成單體成分再循環(huán)利用，并為尾管鞘的收縮提供能量[14]。在合適的條件下，T6SS可進(jìn)行組裝并發(fā)揮功能。

除了上述核心結(jié)構(gòu)蛋白外，T6SS基因簇還編碼輔助蛋白，其包含組裝分泌裝置所需的組分，控制T6SS的表達(dá)或活性作用的調(diào)節(jié)蛋白等[15]。編碼效應(yīng)蛋白的基因下游總是編碼1個(gè)同源的免疫蛋白，被稱為效應(yīng)蛋白/免疫對(duì)。如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)T6SS免疫蛋白(Tse-specific immunity protein)Tsi1、Tsi3可以分別抑制T6SS效應(yīng)蛋白(Type six exported)Tse1、Tse3水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖[16]，而免疫蛋白Tsi2直接與胞質(zhì)效應(yīng)蛋白Tse2結(jié)合形成毒素-免疫蛋白模塊，而使效應(yīng)蛋白失活[17]。

IM為內(nèi)膜；OM為外膜；Tss為Type six secretion；PAAR為Proline-Alanine-Alanine-Arginine；VgrG為Valine-glycine repeat proteins G；Hcp為Hemolysin-coregulated protein；TagA為3-methyl-adenine DNA glycosylase A圖1 VI型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖[56]Fig.1 Schematic representation of the T6SS[56]

2 T6SS的表達(dá)

T6SS的表達(dá)及活性受到各種機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，其機(jī)制可歸類為環(huán)境因素及自身調(diào)控因素。在不同細(xì)菌及不同T6SS亞型中T6SS被誘導(dǎo)表達(dá)所需的條件往往各不相同，這可能與其發(fā)揮功能的環(huán)境相關(guān)。

2.1環(huán)境因素對(duì)T6SS表達(dá)的影響V.parahaemolyticus的T6SS1分泌蛋白Hcp1在模擬海洋環(huán)境條件(2% NaCl，23～30 ℃)下表達(dá)水平較高，而T6SS2分泌蛋白Hcp2卻在模擬宿主體內(nèi)環(huán)境條件(0.5% NaCl，37 ℃)下表達(dá)水平高，這可能與V.parahaemolyticus在海水中時(shí)T6SS1起作用，而在海洋動(dòng)物體內(nèi)時(shí)T6SS2起作用有關(guān)[18]。

B.Pseudomallei的6個(gè)T6SS基因簇中只有T6SS2基因可在M9低鹽0.4%葡萄糖瓊脂造成的營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境中表達(dá)。有趣的是亞抑菌濃度的喹諾酮類抗生素能夠促進(jìn)此菌T6SS2、T6SS3、T6SS4、T6SS6的Hcp蛋白的表達(dá)，這提示了抗感染治療過(guò)程中抗生素足量使用的重要性[6]。

通過(guò)采用分裂GFP技術(shù)，Clemens DL等人確定了3種刺激物可以誘導(dǎo)新兇手弗朗西絲菌(Francisellanovicida)中T6SS IglA/IglB(VipA/VipB同系物)鞘的組裝，分別是1)巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，2)在5% KCl環(huán)境下指數(shù)晚期的高密度細(xì)菌條件，3)放置在蓋玻片下。KCl是巨噬細(xì)胞內(nèi)的一種刺激物，在體外培養(yǎng)基中可能需要更高濃度的KCl以補(bǔ)償細(xì)胞內(nèi)其他刺激物的缺失，而蓋玻片下的誘導(dǎo)機(jī)制目前尚不清楚，可能涉及物理刺激，氧氣張力改變或其他環(huán)境影響[19]。

Yang X等人發(fā)現(xiàn)假結(jié)核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)中GDP/GTP焦磷酸激酶RelA是主要的ppGpp合成酶，細(xì)胞內(nèi)氨基酸缺乏時(shí)，RelA響應(yīng)于核糖體A位點(diǎn)中未攜帶氨基酸的tRNA而合成(p)ppGpp(鳥(niǎo)苷四磷酸和鳥(niǎo)苷五磷酸)，通過(guò)調(diào)節(jié)因子RovM和RovA上調(diào)T6SS4的表達(dá)，以對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)饑餓引起的壓力[20]。

2.2細(xì)菌自身對(duì)T6SS表達(dá)的調(diào)控 細(xì)菌自身的調(diào)控對(duì)T6SS的表達(dá)及活性可總結(jié)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及翻譯后調(diào)控。1)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。腸集聚性大腸埃希菌EAEC在鐵富足的條件下，鐵攝取調(diào)控因子(ferric uptake regulator, Fur)可與sci1 T6SS基因簇啟動(dòng)子附近的Fur盒序列結(jié)合，從而抑制T6SS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[21]。細(xì)菌增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(bacterial enhancer binding proteins, bEBP)(即σ54激活蛋白)由T6SS毒力相關(guān)的分泌基因簇(Vas)編碼，可在T6SS啟動(dòng)子區(qū)域與σ54結(jié)合序列結(jié)合從而激活轉(zhuǎn)錄[22]。 2)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。P.aeruginosaT6SS含3個(gè)溶血素共調(diào)節(jié)蛋白分泌島(Hemolysin-coregulated protein secretion island，HSI)，分別為HSI-Ⅰ、HSI-Ⅱ和HSI-Ⅲ，其中HSI-I直接受二甲基轉(zhuǎn)移酶RsmA的負(fù)調(diào)控。雙組份調(diào)控系統(tǒng)GacS/GacA通過(guò)調(diào)節(jié)下游小RNA(rsmY和rsmZ)的表達(dá)來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。rsmZ為RsmA的拮抗劑，而傳感器激酶RetS是RsmA調(diào)控途徑的一部分。RetS是一種多功能調(diào)節(jié)劑，RetS突變可導(dǎo)致T6SS的上調(diào)[23]。3)翻譯后調(diào)控。如P.aeruginosaH1-T6SS翻譯后受到絲蘇氨酸蛋白激酶PpkA的正向調(diào)控，而受到同源磷酸酶PppA的負(fù)向調(diào)控，這種控制是通過(guò)含有插頭結(jié)構(gòu)域(Forkhead-associated domain，F(xiàn)HA)的Fha1蛋白結(jié)構(gòu)中蘇氨酸殘基的磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)的[24]。

3 T6SS的功能

3.1T6SS對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響 生物膜是細(xì)菌分泌脂質(zhì)蛋白、纖維蛋白、多糖基質(zhì)等形成大量聚集的細(xì)菌膜樣物，常粘附于固體表面。研究發(fā)現(xiàn)，T6SS突變菌形成生物膜能力顯著降低[25]。1)先前在E.coli和V.parahaemolyticus中的研究表明，T6SS本身編碼的蛋白具有促進(jìn)生物膜形成的能力，如外膜脂蛋白SciN[26]。2)在生物膜生長(zhǎng)期間T6SS相關(guān)蛋白被激活表達(dá)，與表征的生物膜因子如膜外多糖共同調(diào)節(jié)生物膜的形成[27]。3)T6SS也可通過(guò)影響生物膜相關(guān)基因發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，弗氏枸櫞酸桿菌CF74的T6SS缺陷株的全菌蛋白中FliC的表達(dá)明顯下調(diào)；在其培養(yǎng)上清中FliC、FlgK和FliD的表達(dá)下調(diào)均十分明顯[28]。EAEC中sci1 T6SS激活可促進(jìn)粘附，生物膜形成與黏附相關(guān)基因有密切關(guān)系。

3.2T6SS對(duì)細(xì)菌抗菌作用的影響 近年來(lái)不斷有報(bào)道，革蘭陰性菌利用T6SS分泌的抗菌因子參與細(xì)菌間的生存競(jìng)爭(zhēng)。T6SS可將效應(yīng)因子注射入鄰近的靶細(xì)胞以對(duì)抗其競(jìng)爭(zhēng)者。對(duì)于T6SS裝置的作用方式近些年通過(guò)活細(xì)胞熒光顯微技術(shù)在V.cholerae、沙雷氏菌和E.coli中直接觀察到了TssB鞘運(yùn)動(dòng)，分為3個(gè)步驟：1)鞘聚合成完全伸展?fàn)顟B(tài)，2)快速收縮，3)ClpV的分解[29-31]。目前己知的與細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)相關(guān)的T6SS效應(yīng)因子可歸為4類，分別為1)裂解細(xì)胞壁類效應(yīng)因子，如水解肽聚糖的酰胺酶Tse1、多糖酵解酶Tse3[32]；2)損傷細(xì)胞膜類效應(yīng)因子，如直接水解細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的磷脂酶效應(yīng)因子Tle家族[33]，刺入細(xì)胞膜導(dǎo)致滲透壓失衡的穿孔蛋白Colicin[34]；3)降解核酸效應(yīng)因子，如Rhs(Rearrangement hotspot)蛋白，編碼效應(yīng)因子C端核酸內(nèi)切酶區(qū)域，可降解靶細(xì)胞DNA[35]；4)生長(zhǎng)抑制因子如NAD(P)+糖基水解酶等[36]。其中針對(duì)于細(xì)胞膜的效應(yīng)因子也意味著對(duì)真核細(xì)胞膜起作用。

細(xì)菌在感染過(guò)程中往往需要比原土著菌群有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)以競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生存空間。Fu Y等[37]觀察到T6SS賦予V.cholerae特別的定植競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，并且該優(yōu)勢(shì)不依賴于抗真核效應(yīng)物VgrG1，表明T6SS可能通過(guò)其它效應(yīng)物作用于常駐的共生細(xì)菌物種。近期研究表明小鼠模型中V.cholerae的T6SS確實(shí)能夠殺死共生菌，并且這種抗菌活性有利于V.cholerae在小鼠體內(nèi)的定植[38]。還有研究表明鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)在腸道中的成功定植需要沙門氏菌致病島-6(SPI-6)編碼的T6SS。在體外環(huán)境中，膽汁鹽可增加S.TyphimuriumSPI-6的抗菌活性，使其以T6SS依賴的方式殺死共生細(xì)菌。Hcp1是在體外殺死產(chǎn)氧克雷伯菌的必要條件，且該活性是由Hcp1與抗菌酰胺酶Tae4的特異性相互作用介導(dǎo)的[39]。Hsieh PF等[40]的體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)胞內(nèi)增殖蛋白F1-2(Intracellular multiplication protein F，IcmF1-2)和Hcp在細(xì)菌種內(nèi)和種間殺傷作用中是必需的。

3.3T6SS影響細(xì)菌對(duì)真核細(xì)胞的致病力 細(xì)菌感染宿主的過(guò)程中需要克服宿主的免疫防御機(jī)制，T6SS在此過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。迄今為止發(fā)現(xiàn)的T6SS抗真核效應(yīng)因子可分為兩類：第一類為VgrG蛋白的亞類。如V.choleraeVgrG1中的C末端肌動(dòng)蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)域[41]和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)VgrG1中的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域?qū)φ婧怂拗骷?xì)胞具有細(xì)胞毒性作用[42]。第二類是獨(dú)立靶向宿主細(xì)胞的毒素。V.choleraVasX的N-末端PH同源結(jié)構(gòu)域(Pleckstrin homology domain)可能涉及結(jié)合宿主膜脂質(zhì)，從而干擾宿主磷酸肌醇代謝和信號(hào)傳導(dǎo)[43]。另外效應(yīng)蛋白Tle5A和Tle5B結(jié)合絲蘇氨酸激酶Akt也可促進(jìn)P.aeruginosa內(nèi)化作用[44]。

3.3.1對(duì)上皮細(xì)胞的作用 多數(shù)細(xì)菌雖然被認(rèn)為是細(xì)胞外病原體，但能夠侵入非吞噬細(xì)胞，如粘膜上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。免疫逃逸的機(jī)制之一是細(xì)菌逃避到無(wú)吞噬作用的宿主細(xì)胞中，以躲避宿主的免疫系統(tǒng)，成功感染并在宿主體內(nèi)持續(xù)存在，通過(guò)緊密的上皮細(xì)胞屏障侵入更深的組織[45]。

首先細(xì)菌黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，近期關(guān)于K.pneumoniae的研究表明在icmF1和icmF2缺陷時(shí)顯示出1型菌毛的表達(dá)降低，對(duì)結(jié)腸直腸上皮細(xì)胞的粘附和侵襲降低，并且在體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)力減弱[40]。其次細(xì)菌侵襲進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，最常見(jiàn)的內(nèi)化作用為改變肌動(dòng)蛋白重塑機(jī)制以操縱細(xì)胞骨架生成富含肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞表面突起，促進(jìn)粘附細(xì)菌的內(nèi)化。此外微管也參與了細(xì)菌的內(nèi)化。據(jù)報(bào)道秋水仙堿或諾考達(dá)唑抑制微管形成后，H2-T6SS分泌的VgrG2b蛋白促進(jìn)P.aeruginosa內(nèi)化進(jìn)入上皮細(xì)胞的作用被抑制[46]。研究表明將E.coliK1的Hcp1蛋白純化后干預(yù)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Hcp1蛋白不需要易位到細(xì)胞內(nèi)部也可誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞凋亡[47]。

3.3.2對(duì)巨噬細(xì)胞的作用 細(xì)菌T6SS與宿主巨噬細(xì)胞之間的作用，可歸為4類：1)操控宿主細(xì)胞骨架重排抑制吞噬。多種細(xì)菌中證實(shí)T6SS可通過(guò)改變巨噬細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)從而抵抗吞噬作用。新洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)T6SS效應(yīng)物TecA使Rho GTP酶脫去酰胺基，破壞巨噬細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架并激活Pyrin炎癥小體引發(fā)炎癥反應(yīng)[48]。2)抵抗巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的殺傷進(jìn)行免疫逃逸。據(jù)Wan B等人的報(bào)道腸出血型大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli, EHEC)以T6SS依賴的方式分泌效應(yīng)物KatN(含錳的過(guò)氧化氫酶)。RNA聚合酶σ因子RpoS和調(diào)控因子OxyR可以促進(jìn)katN的表達(dá)，而H-NS可抑制其表達(dá)。EHEC被巨噬細(xì)胞吞噬后，KatN可分泌到宿主細(xì)胞胞漿中，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平降低，促進(jìn)EHEC在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活[49]。此外，Y.pseudotuberculosisT6SS4分泌的Zn+結(jié)合蛋白底物YezP以結(jié)合鋅離子等方式逃避巨噬細(xì)胞的殺傷[50]。3)引起宿主細(xì)胞死亡。P.aeruginosaH2-T6SS的分泌蛋白磷脂酶TplE具有一個(gè)類似于真核PGAP1蛋白的結(jié)構(gòu)域，可定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并通過(guò)激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)，從而促進(jìn)自噬[51]。在鼠巨噬細(xì)胞中，遲鈍愛(ài)德華菌(E.tarda)上調(diào)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)/T6SS基因從而增強(qiáng)細(xì)菌毒力，使其可在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并誘導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)依賴的細(xì)胞凋亡[52]。4)引發(fā)炎癥應(yīng)答。Chen H等[53]發(fā)現(xiàn)E.tardaT6SS效應(yīng)物EvpP可抑制細(xì)胞質(zhì)Ca2+的增加，在MAPK-JNK的上游調(diào)節(jié)NLRP3炎性體，進(jìn)一步影響對(duì)caspase-1的激活。A.hydrophila中也證實(shí)Hcp能夠與巨噬細(xì)胞結(jié)合并誘導(dǎo)IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β的產(chǎn)生，從而影響巨噬細(xì)胞的活化，并招募其他細(xì)胞免疫成分[54]。

4 展 望

近年來(lái)，對(duì)于T6SS基因、結(jié)構(gòu)、調(diào)控、功能等各個(gè)方面的研究越來(lái)越深入。由于電子顯微鏡的應(yīng)用，不僅可確認(rèn)T6SS各結(jié)構(gòu)組成，對(duì)于其運(yùn)動(dòng)方式也可進(jìn)行更加直觀的觀察[10,55]。然而T6SS在不同的細(xì)菌中的功能表型有著很大的差異。細(xì)菌內(nèi)部對(duì)于T6SS功能的調(diào)控，以及T6SS到底涉及細(xì)菌哪些生理功能還需要進(jìn)一步的探究。最重要的是雖然在多種細(xì)菌中均有報(bào)道T6SS在細(xì)菌對(duì)宿主的致病力中起著重要的作用[49]，然而細(xì)菌T6SS是通過(guò)怎樣的機(jī)制對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，宿主又是通過(guò)怎樣的免疫機(jī)制應(yīng)對(duì)的，這些問(wèn)題依然值得關(guān)注，致病機(jī)理和防控措施問(wèn)題的探討對(duì)于感染性疾病的防治具有重要的意義。

利益沖突：無(wú)