馬名揚(yáng)　原翔　劉怡文　孫江濤

[摘要] 目的 分析CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征及5年生存期的相關(guān)性，并探討其臨床意義及預(yù)后價值。 方法 選擇2014年1月～2015年3月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的130例表皮生長因子受體（EGFR）為陽性的肺腺癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織石蠟包埋標(biāo)本為研究對象，采用免疫組織化學(xué)方法檢測其組織中浸潤的CD8+T淋巴細(xì)胞表面NKG2A蛋白表達(dá)情況，并分析NKG2A的表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征及5年生存期的相關(guān)性;采用Cox回歸法分析各因素對預(yù)后的影響;采用Kaplan-Meier法分析NKG2A蛋白高表達(dá)與生存時間之間相關(guān)性。 結(jié)果 肺腺癌及相應(yīng)癌旁肺組織中浸潤的CD8+T淋巴細(xì)胞胞膜均可見NKG2A蛋白表達(dá)，在肺腺癌組織中，中、低分化NKG2A免疫組化評分高于高分化，且低分化高于中分化（P < 0.05）。NKG2A蛋白高表達(dá)與肺腺癌患者的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及5年生存情況具有相關(guān)性（P < 0.05）。NKG2A蛋白高表達(dá)為影響肺腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素。且NKG2A蛋白高表達(dá)患者的5年生存率及中位生存時間均明顯低于低表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A高表達(dá)，可能通過削弱其抗腫瘤免疫，促進(jìn)了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。抑制NKG2A表達(dá)可能為肺腺癌的免疫治療提供新的思路和有效治療手段。

[關(guān)鍵詞] 肺腺癌;CD8+T淋巴細(xì)胞;自然殺傷細(xì)胞表面抑制性受體A;預(yù)后

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（c）-0015-05

[Abstract] Objective To analyze the correlation between expression of CD8+T cell surface inhibitory receptor NKG2A and clinicopathological characteristics and 5-year survival in patients with lung adenocarcinoma， and to explore its clinical significance and prognostic value. Methods From January 2014 to March 2015， 130 cases of lung adenocarcinoma with epidermal growth factor receptor （EGFR） （+） were resected in the First Affiliated Hospital of He′nan University of Science and Technology， and the paraffin-embedded samples of the carcinema tissues and adjacent lung tissues of patients with lung adenocarcinoma were selected as the research objects， immunohistochemistry was used to detect the expression of NKG2A protein on the surface of infiltrated CD8+T lymphocytes， and the correlation between NKG2A expression and clinicopathological characteristics and 5-year survival in patients with lung adenocarcinoma was analyzed. The influence of each factor on prognosis was analyzed by Cox regression method. The correlation between NKG2A protein expression and survival time was analyzed by Kaplan-Meier method. Results The expression of NKG2A protein was observed in the membrane of infiltrated CD8+T lymphocytes in lung adenocarcinoma and corresponding adjacent lung tissues， in lung adenocarcinoma tissues， the immunohistochemical score of NKG2A was higher than that of high differentiation and low differentiation than that of medium differentiation （P < 0.05）. High expression of NKG2A protein was associated with differentiation， lymph node metastasis， clinical stage and 5-year survival in patients with lung adenocarcinoma （P < 0.05）. The degree of differentiation， lymph node metastasis， clinical stage and high expression of NKG2A protein were independent risk factors for the prognosis of patients with lung adenocarcinoma. Moreover， the 5-year survival rate and median survival time of patients with high NKG2A protein expression were significantly lower than those with low expression， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion The high expression of the inhibitory receptor NKG2A on the surface of CD8+T lymphocytes may promote the development of lung adenocarcinoma by weakening its anti-tumor immunity. Inhibition of NKG2A expression may provide a new idea and an effective treatment for lung adenocarcinoma.

[Key words] Lung adenocarcinoma; CD8+T lymphocytes; NKG2A; Prognosis

肺癌已成為世界發(fā)病率增幅最大的癌癥之一，且在相當(dāng)長的時間內(nèi)，它將穩(wěn)居癌癥死亡原因之首位[1]，主要分為兩大組織學(xué)類型，小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌。肺腺癌為非小細(xì)胞肺癌的重要組織學(xué)亞型，早期多表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病的一般癥狀，如咳嗽、低熱、胸痛等，易被忽略，確診時多發(fā)展至晚期，預(yù)后極差[2]。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷發(fā)展、進(jìn)步，靶向治療逐漸成為一種新的治療方式。前期研究大都集中在癌細(xì)胞自身，有關(guān)腫瘤微環(huán)境的作用則探討不多。實際上，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)[3-4]。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生長的特殊環(huán)境，研究顯示腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的互相作用可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且對免疫細(xì)胞抑制性受體表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸[4]。著名的NKG2A屬于C型（鈣依賴型）凝集素超家族的Ⅱ型糖蛋白，基因定位于人12號染色體短臂，胞內(nèi)段含有2個ITIM，因而具有抑制功能，傳遞負(fù)反應(yīng)信號。相關(guān)研究[5-6]表明，特異CD8+T淋巴細(xì)胞表面都會表達(dá)NKG2A等抑制性受體，從而削弱其抗腫瘤免疫，增加腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測肺腺癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織中浸潤的CD8+T淋巴細(xì)胞NKG2A蛋白表達(dá)情況，并分析其高表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征及5年生存期之間相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)NKG2A蛋白高表達(dá)與肺腺癌的惡性進(jìn)展之間存在相關(guān)性，抑制NKG2A蛋白的表達(dá)可以作為靶向治療的一個新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月～2015年3月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的表皮生長因了受體（EGFR）為陽性的肺腺癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織石蠟包埋標(biāo)本為觀察對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①治療性肺腺癌切除術(shù)后，同時具備癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織（距癌組織邊緣> 5 cm）;②術(shù)前均未接受免疫治療及放、化療;③術(shù)后病理診斷為肺腺癌;④隨訪時間為5年。共納入組織標(biāo)本130例，其中男73例，女57例;年齡≤60歲57例，年齡>60歲73例;高、中及低分化分別有34、70及26例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移79例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期75例，Ⅲ～Ⅳ期55例。本研究經(jīng)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院及河南科技大學(xué)腫瘤研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，并于術(shù)前獲得患者書面知情同意。

1.2 試劑與儀器

免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP-9000）;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、檸檬酸抗原修復(fù)液與二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，P1010、C1010與DA1010）;CD8兔多克隆抗體（美國abcam公司，ab4055）與NKG2A兔多克隆抗體（美國abcam公司，ab96319）。光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司，E100+ISH500）。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測組織中浸潤的CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A蛋白的表達(dá)

每例患者癌組織及相應(yīng)癌旁肺組織各取兩張石蠟包埋標(biāo)本連續(xù)切片，片厚2 μm;常規(guī)溶蠟脫蠟，梯度乙醇水化（體積分?jǐn)?shù)100%、90%、80%與70%）;檸檬酸抗原修復(fù)15 min;PBS沖洗;過氧化物酶阻斷劑封閉20 min;PBS沖洗;山羊血清封閉30 min;于兩張連續(xù)切片上分別加入CD8+T淋巴細(xì)胞抗體與NKG2A抗體（PBS稀釋比1∶200）各50 μL，4℃孵育過夜;PBS沖洗;山羊抗鼠/兔聚合物室溫下孵育20 min;PBS沖洗;鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶室溫封閉15 min;PBS沖洗;DAB顯色10 min;蒸餾水終止顯色;蘇木精復(fù)染10 min;梯度乙醇脫水（體積分?jǐn)?shù)70%、80%、90%與100%）;二甲苯透明;封片;使用光學(xué)顯微鏡觀察兩張連續(xù)切片中同一位置CD8+T淋巴細(xì)胞與NKG2A蛋白的表達(dá)，以兩張連續(xù)切片同一位置細(xì)胞膜出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，隨機(jī)取5個高倍鏡視野（400×）評分均值為最終免疫組織化學(xué)評分（評分細(xì)則見參考文獻(xiàn)[7]）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。各因素對預(yù)后的影響采用Cox回歸分析;生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法;生存時間之間差異分析采用Log-rank檢驗（生存時間為入院時間至最后一次隨訪日期或死亡），以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌及癌旁肺組織中CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A蛋白的表達(dá)

肺腺癌及癌旁肺組織中均可見間質(zhì)淋巴細(xì)胞胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，為浸潤的CD8+T淋巴細(xì)胞（圖1A、C、E、G），在右側(cè)連續(xù)切片中可見同一位置淋巴細(xì)胞胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，為CD8+T淋巴細(xì)胞NKG2A蛋白表達(dá)陽性（圖1B、D、F、H）。高、中、低分化肺腺癌組織CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A蛋白免疫組織化學(xué)評分中、低分化評分高分化，且低分化高于中分化（P < 0.05）。見圖1（封三）、表1。

2.2 肺腺癌患者CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A蛋白表達(dá)與其臨床病理特征相關(guān)性

CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A蛋白高表達(dá)與肺腺癌患者的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及5年生存情況具有相關(guān)性（P < 0.05）。見表2。

2.3 肺腺癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

以生存和死亡作為因變量，NKG2A蛋白表達(dá)為自變量（陽性=1，陰性=0），結(jié)果顯示CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A蛋白表達(dá)陽性為影響肺腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素（β = 0.85，Wald = 7.78，HR = 2.35，95%CI：1.29～4.28，P < 0.05）。

2.4 CD8+T淋巴細(xì)胞NKG2A蛋白表達(dá)與肺腺癌患者5年生存預(yù)后相關(guān)性

130例肺腺癌患者中CD8+T淋巴細(xì)胞NKG2A蛋白表達(dá)陽性者的5年生存率及中位生存時間均明顯低于表達(dá)陰性者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3、圖2～3。

3 討論

肺腺癌是一種臨床上較為常見的惡性腫瘤，雖然目前已有手術(shù)、放療、化療等治療手段，但治療效果仍不理想。因此，尋找與肺腺癌惡性進(jìn)展密切相關(guān)的因素，為治療提供可能的新靶點意義重大[8]。鮮有關(guān)于腫瘤微環(huán)境作用的相關(guān)報道。腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境密切相關(guān)[9-13]。研究表明腫瘤細(xì)胞與宿主之間的相互作用是腫瘤生長與存活的起始選擇壓力，這種相互作用可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3，14-16]。同時腫瘤細(xì)胞對免疫細(xì)胞抑制性受體表達(dá)的調(diào)節(jié)，是腫瘤削弱宿主微環(huán)境中免疫細(xì)胞殺傷力、誘導(dǎo)免疫耐受甚至功能耗竭，最終導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制[17-19]。

本研究顯示肺腺癌組織中CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A蛋白表達(dá)顯著升高，提示腫瘤組織中可聚集大量不具備殺傷能力的CD8+T淋巴細(xì)胞，從而增加腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。且NKG2A蛋白表達(dá)隨分化程度降低而逐漸升高，提示隨著腫瘤惡性程度的增加，NKG2A蛋白表達(dá)逐漸升高;同時淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者及臨床分期為Ⅲ/Ⅳ期患者的NKG2A蛋白表達(dá)顯著增高，提示NKG2A蛋白高表達(dá)與肺腺癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。本研究還顯示NKG2A蛋白表達(dá)陽性者的5年生存率及中位生存時間均顯著低于表達(dá)陰性者，提示NKG2A蛋白可作為免疫治療的新靶點，有效抑制其表達(dá)可能延長肺腺癌患者的生存期。

綜上所述，在肺腺癌中，NKG2A通過負(fù)性調(diào)控CD8+T淋巴細(xì)胞活性，從而增加腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，抑制NKG2A可能是肺腺癌免疫治療的潛在靶點之一，在肺腺癌的臨床治療方面具有十分重要的科學(xué)理論意義和廣泛的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2020-03-09? 本文編輯：封? ?華）