孫建輝　周青罡　沈麗琴　霍海如　李小芹　李洪梅

[摘要] 目的 研究腎寶片的補腎作用，并探討其作用機制。 方法 采用腺嘌呤致Wistar大鼠腎陽虛模型，按體重隨機分為正常對照組，模型對照組，腎寶片1.14、0.57、0.29 g/kg劑量組，枸櫞酸西地那非片組，每組13只。除正常對照組外，其余大鼠灌胃腺嘌呤500 mg/kg體重，連續(xù)10 d。造模第二天開始各組分別灌胃給藥，正常對照組和模型對照組灌胃相同容積的蒸餾水，連續(xù)給藥24 d。比較各組大鼠體重、自主活動次數(shù)、低溫游泳存活時間、血清睪酮（T）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）及總一氧化氮合酶（NOS）水平。采用去勢大鼠模型，按體重隨機選取12只為正常對照組，其余大鼠進行去勢手術(shù)，將去勢大鼠按體重隨機分為模型對照組、腎寶片2.28、1.14、0.57 g/kg劑量組及枸櫞酸西地那非片組，每組12只。各組分別灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥24 d，正常對照組和模型對照組灌胃相同容積的蒸餾水。比較各組勃起潛伏期、陰莖海綿體內(nèi)壓/血壓（ICP/BP）、cGMP和總NOS及血清T水平。 結(jié)果 腎陽虛模型對照組體重、自主活動次數(shù)、低溫游泳存活時間、血清T含量、陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平低于正常對照組，血清BUN、Cre、MDA含量高于正常對照組（P < 0.05）。腎寶片1.14、0.57、0.29 g/kg劑量組低溫游泳存活時間長于模型對照組、血清BUN含量低于模型對照組，腎寶片1.14、0.57 g/kg劑量組自主活動次數(shù)、陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平高于模型對照組，腎寶片0.57 g/kg劑量組血清T含量、SOD活性高于模型對照組、Cre含量低于模型對照組（均P < 0.05）;腎寶片1.14、0.57、0.29 g/kg劑量組體重、血清MDA含量、陰莖海綿體內(nèi)總NOS水平與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。去勢大鼠模型對照組勃起潛伏期高于正常對照組，血清T含量、陰莖海綿體ICP值、ICP/BP比值、陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平低于正常對照組（P < 0.01）。腎寶片2.28、1.14、0.57 g/kg劑量組勃起潛伏期低于模型對照組，血清T含量、陰莖海綿體ICP值、ICP/BP比值高于模型對照組，腎寶片2.28 g/kg劑量組陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平高于模型對照組（均P < 0.05）;腎寶片2.28、1.14、0.57 g/kg劑量組BP值、陰莖海綿體總NOS水平與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結(jié)論 腎寶片具有補腎作用，其作用機制與增強雄激素含量、NO/cGMP通路活性以及SOD活性有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腎寶片;補腎;腎陽虛;睪酮;環(huán)磷酸鳥苷;陰莖海綿體內(nèi)壓力

[中圖分類號] R256.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（c）-0004-06

[Abstract] Objective To study the kidney-tonifying effect of Shenbao Tablets and explore its mechanism. Methods The model of kidney-yang deficiency of Wistar rats induced by adenine was adopted. They were randomly divided into normal control group， model control group， Shenbao Tablets 1.14， 0.57 and 0.29 g/kg dose groups， Sildenafil Citrate Tablets group， with 13 rats in each group. Except the normal control group， the other rats were gavaged with adenosine 500 mg/kg for 10 d. On the second day of modeling， each group was administrated by gavage for 24 d. The body weight， the number of independent activities， the survival time of swimming at low temperature， the serum testosterone （T）， blood urea nitrogen （BUN）， creatinine （Cre）， serum superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， cyclic guanosine phosphate （cGMP） and total nitric oxide synthase （NOS） were compared in each group. The castrated rat model was used， and 12 rats were randomly selected according to the body weight as the normal control group. The remaining rats were castrated. The castrated rats were randomly divided into model control group， Shenbao Tablets 2.28， 1.14 and 0.57 g/kg dose groups， and Sildenafil Citrate Tablets group， with 12 rats in each group. Each group was administrated by gavage once a day for 24 d， normal control group and model control group were gavaged the same volume of distilled water. The erectile latency，intracavernous pressure/blood pressure （ICP/BP）， cGMP and total NOS levels and serum T levels were compared in each group. Results The body weight， the number of independent activities， the survival time of low temperature swimming， serum T levels and cGMP in penile sponge in model control group of kidney-yang deficiency were lower than those in normal control group， and serum BUN， Cre and MDA levels were higher than those in normal control group （P < 0.05）. The survival time of low temperature swimming of Shenbao Tablets 1.14， 0.57 and 0.29 g/kg dose groups were longer than those of model control group， the BUN content was lower than that of model control group， the number of independent activities and cGMP levels in penile sponge of Shenbao Tablets 1.14 and 0.57 g/kg dose groups were higher than those of model control group， the serum T content and SOD activity of Shenbao Tablets 0.57 g/kg dose group were higher than those of model control group， and the Cre content was lower than that of model control group （all P < 0.05）. There were no significant differences in the body weight， serum MDA content and total NOS levels in penile sponge in Shenbao Tablets 1.14， 0.57， 0.29 g/kg dose groups and model control group （P > 0.05）. The erectile latency of castrated rats in model control group was higher than that in normal control group， and the serum T content， ICP value， ICP/BP ratio， cGMP level of penile sponge were lower than those in normal control group （P < 0.01）. The erectile latency of Shenbao Tablets 2.28， 1.14 and 0.57 g/kg dose groups were lower than those of model control group， the serum T content， ICP value and ICP/BP ratio of penile sponge were higher than those of model control group， the cGMP levels of penile sponge in Shenbao Tablets 2.28 g/kg dose group were higher than those of model control group （all P < 0.05）. There were no significant differences in BP value and total NOS of penile sponge in Shenbao Tablets 2.28， 1.14 and 0.57 g/kg dose groups and model control group （P > 0.05）. Conclusion Shenbao Tablets has the effect of kidney-tonifying， and its mechanism is related to the increase of androgen content， the enhancement of NO/cGMP pathway activity and SOD activity.

[Key words] Shenbao Tablets; Kidney-tonifying; Kidney-yang deficiency; Testosterone; Cyclic guanosine phosphate; Intracavernous pressure

中醫(yī)認為腎藏精，主天葵，為先天之本。腎中精氣內(nèi)寓元陰元陽，即腎陰腎陽。腎陽為周身陽氣之根本。若先天稟賦不足、久病勞倦、飲食不節(jié)、房事過度或年老體虛等，均可導致腎陽不足。腎陽虛證的主要癥狀包括面色發(fā)白、四肢冰冷、精神萎靡、遺精尿頻、四肢浮腫、胸悶氣短、痰多心悸、虛弱無力等[1]。久病及腎，腎精虧損、腎氣不足是各種慢性病發(fā)展的必然轉(zhuǎn)歸[2]。腎主生殖，人到老年往往出現(xiàn)生理性腎虛，此時下丘腦-垂體-性腺軸發(fā)生明顯改變，隨年齡增長，男性血漿睪酮水平呈下降趨勢;溫腎陽中藥可調(diào)節(jié)改善[3]。中醫(yī)認為男性勃起多與腎有關(guān)，對勃起功能障礙多數(shù)醫(yī)家認為腎虛為本，肝郁氣滯、血瘀、濕熱等為標，各種病理因素單一或聯(lián)合作用于人體以致本病[4]。李曰慶教授認為勃起功能障礙最常見的病因是腎虛、肝郁、血瘀以及濕熱，腎虛是發(fā)病之本，肝郁是病變之標[5]。腎陽虧虛是勃起功能障礙的主要病機，治療上以溫補腎陽為主。

腎寶片由淫羊藿、葫蘆巴、金櫻子、熟地黃等22味中藥制成，具有調(diào)和陰陽，溫陽補腎，扶正固本的作用。腎寶片是在腎寶合劑基礎(chǔ)上改進而來，腎寶合劑為《中華人民共和國藥典》[6]2015年版收載藥品，研究顯示[7]，腎寶合劑具有助陽與改善性功能的藥理作用。本研究采用腺嘌呤所致大鼠腎陽虛模型和去勢大鼠模型，評價腎寶片的補腎作用，并從性激素水平、一氧化氮-環(huán)磷酸鳥苷（NO-cGMP）通路、抗氧化等方面探討腎寶片的補腎作用機制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，雄性，體重160～180 g 78只、90～110 g 72只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2010-0034。本實驗遵循實驗動物保護和使用指南，并獲得中國中醫(yī)科學院中藥研究所實驗動物倫理委員會批準。

1.2試藥與儀器

腎寶片，江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號：1301004;枸櫞酸西地那非片，輝瑞制藥有限公司，批號：1283002;YLS-1B多功能大鼠自主活動記錄儀，濟南益延科技有限公司;RT-6000型酶標分析儀，深圳雷杜生命科學股份有限公司;AVE型半自動生化分析儀，愛威科技實業(yè)有限公司;M150多導電生理儀，美國Biopac公司;5922型離心機，KUBOTA公司。腺嘌呤，Amersco公司，有效期至03/2015。

1.3 方法

1.3.1 劑量設(shè)計

腎寶片，臨床用量9片/d，每片重0.7 g，按60 kg體重計算為0.105 g/kg，按動物與人公斤體重等效劑量折算，大鼠用0.57 g/kg為臨床等效劑量。枸櫞酸西地那非片，臨床推薦用量50 mg/d，按60 kg體重計算為0.83 mg/kg，按動物與人公斤體重等效劑量折算，大鼠用4.5 mg/kg為臨床等效劑量。

1.3.2 腎寶片對腺嘌呤致大鼠腎陽虛模型的影響

1.3.2.1 動物分組、造模、給藥? 選取160～180 g健康Wistar大鼠78只，按體重隨機分為正常對照組，模型對照組，腎寶片1.14、0.57、0.29 g/kg劑量組，枸櫞酸西地那非片組，每組13只。造模[8]：除正常對照組外，其余大鼠灌胃腺嘌呤500 mg/kg體重，連續(xù)10 d。造模第二天開始各組分別灌胃給藥，正常對照組和模型對照組灌胃相同容積的蒸餾水（10 mL/kg），連續(xù)給藥24 d。模型對照組體重明顯低于正常對照組，提示動物模型制備成功[3]。

1.3.2.2 動物自主活動次數(shù)的測定? 采用YLS-1B型多功能大鼠自主活動記錄儀，記錄大鼠10 min內(nèi)的自主活動次數(shù)。

1.3.2.3 低溫游泳存活時間的測定? 在不銹鋼水槽內(nèi)加水、冰，控制水溫在（10.0±0.5）℃，將動物放入水槽內(nèi)游泳開始計時，至大鼠頭部沉入水中10 s不能浮出水面，此時間為低溫游泳存活時間。

1.3.2.4 血清睪酮（T）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的檢測? 采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，眼眶取血，3000 r/min離心15 min（離心半徑為16.71 cm），分離血清，測定血清中T、BUN、Cre、SOD、MDA含量，按試劑盒說明書進行操作。

大鼠T ELISA試劑盒（BlueGene公司，批號：20130422）;BUN試劑盒（OPA法，北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號：20130102）;Cre試劑盒（苦味酸不除蛋白法，北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號：20130123）;SOD試劑盒（羥胺法，南京建成生物工程研究所，批號：20130313）;MDA試劑盒（TBA法，南京建成生物工程研究所，批號：20130329）。

1.3.2.5 陰莖海綿體內(nèi)cGMP和總一氧化氮合酶（NOS）水平的測定? 采用大鼠cGMP ELISA試劑盒（BlueGene公司，批號：20130422）、NOS測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20130419）測定，按說明書操作。

1.3.3腎寶片對去勢大鼠模型的影響

1.3.3.1動物造模、分組、給藥? 選取90～110 g健康Wistar大鼠，72只。造模：按體重隨機選取12只大鼠作為正常對照組，其余大鼠參考文獻[9]，進行去勢手術(shù)。分組：手術(shù)3 d后，將去勢大鼠按體重隨機分組，分別為模型對照組、腎寶片2.28、1.14、0.57 g/kg劑量組，枸櫞酸西地那非片組，每組12只。各組分別灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥24 d，正常對照組和模型對照組灌胃相同容積的蒸餾水（10 mL/kg）。

1.3.3.2 勃起潛伏期的測定? 將刺激電極置于大鼠陰莖部位，給予局部電刺激，電流強度為4 mA，從刺激開始至陰莖勃起時間為勃起潛伏期。

1.3.3.3 陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）及ICP/BP的測定? 參考文獻[10]，分離、暴露大鼠陰莖海綿體，采用Biopac電生理儀，測定血壓（BP）和ICP，計算ICP/BP的比值。

1.3.3.4 血清T含量的測定? 取血，離心，分離血清，操作同“1.3.2.4”，采用大鼠T ELISA試劑盒（BlueGene公司，批號：20130722）測定，按說明書操作。

1.3.3.5 陰莖海綿體內(nèi)cGMP和總NOS水平的測定? 測定方法同“1.3.2.5”。大鼠cGMP ELISA試劑盒，BlueGene公司，批號：20130722;總NOS測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20130716。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腎寶片對腺嘌呤致大鼠腎陽虛模型的研究結(jié)果

2.1.1 腎寶片對大鼠腎陽虛模型體重的影響

模型對照組結(jié)束時體重明顯低于正常對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），提示動物模型制備成功。腎寶片1.14、0.57、0.29 g/kg劑量組體重與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.1.2 腎寶片對腎陽虛模型自主活動次數(shù)、低溫游泳存活時間的影響

模型對照組大鼠自主活動次數(shù)、低溫游泳存活時間低于正常對照組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。腎寶片1.14、0.57 g/kg劑量組及枸櫞酸西地那非片組大鼠自主活動次數(shù)高于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05或P < 0.01）;腎寶片1.14、0.57、0.29 g/kg劑量組及枸櫞酸西地那非片組低溫游泳存活時間長于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。見表2。

3.1.3 腎寶片對大鼠腎陽虛模型血清中T、BUN、Cre含量的影響

模型對照組血清T含量低于正常對照組，BUN、Cre含量高于正常對照組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。腎寶片0.57 g/kg劑量組T含量高于模型對照組，腎寶片1.14、0.57、0.29 g/kg劑量組及枸櫞酸西地那非片組BUN含量低于模型對照組，腎寶片0.57 g/kg劑量組、枸櫞酸西地那非片組Cre含量低于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。見表3。

2.1.4 腎寶片對大鼠腎陽虛模型血清SOD、MDA含量的影響

腎寶片0.57 g/kg劑量組、枸櫞酸西地那非片組血清SOD活性高于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。模型對照組MDA含量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表4。

2.1.5 腎寶片對腎陽虛模型陰莖海綿體內(nèi)cGMP和總NOS含量的影響

模型對照組陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平低于正常對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;腎寶片1.14、0.57 g/kg劑量組及枸櫞酸西地那非片組陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平高于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。腎寶片1.14、0.57、0.29 g/kg劑量組陰莖海綿體內(nèi)總NOS含量與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表5。

2.2 腎寶片對去勢大鼠模型的研究結(jié)果

2.2.1 腎寶片對去勢大鼠勃起潛伏期、血清T含量的影響

模型對照組大鼠勃起潛伏期長于正常對照組;血清T含量低于正常對照組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。腎寶片2.28、1.14、0.57 g/kg劑量組及枸櫞酸西地那非片組勃起潛伏期短于模型對照組;血清T含量高于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表6。

2.2.2 腎寶片對去勢大鼠陰莖海綿體ICP、BP及ICP/BP的影響

模型對照組陰莖海綿體ICP值、ICP/BP比值低于正常對照組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。腎寶片2.28、1.14、0.57 g/kg劑量組及枸櫞酸西地那非片組陰莖海綿體ICP值、ICP/BP比值高于模型對照組，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。腎寶片2.28、1.14、0.57 g/kg劑量組BP值與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表7。

2.2.3 腎寶片對去勢大鼠陰莖海綿體內(nèi)cGMP和總NOS水平的影響

模型對照組大鼠陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平低于正常對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;腎寶片2.28 g/kg劑量組、枸櫞酸西地那非片組陰莖海綿體內(nèi)cGMP水平高于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。腎寶片2.28、1.14、0.57 g/kg劑量組總NOS水平與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表8。

4 討論

腎寶片中淫羊藿、葫蘆巴、補骨脂、蛇床子、肉蓯蓉溫補腎陽，金櫻子、菟絲子、覆盆子固精縮尿，熟地黃補血滋陰、益精填髓，制何首烏、枸杞子、菟絲子滋補肝腎，五味子收斂固澀、補腎寧心，黃芪補氣升陽，紅參大補元氣，白術(shù)健脾益氣，山藥補脾補腎，茯苓健脾寧心，當歸補血活血，川芎活血行氣，小茴香散寒理氣，車前子清熱通淋，炙甘草補脾益氣，全方配伍，共同發(fā)揮調(diào)和陰陽，溫陽補腎，扶正固本的作用。研究顯示單味藥淫羊藿[11]、肉蓯蓉[12]、熟地黃[13]等具有補腎作用。

動物體重下降、自主活動減少、抗應(yīng)激能力下降、血清T含量降低、腎功能改變等作為腎陽虛證動物模型的診斷指標[3，14]。本研究采用腺嘌呤造成大鼠腎陽虛模型，模型對照組體重、自主活動次數(shù)、低溫游泳存活時間、T含量均低于正常對照組，模型對照組血清BUN、Cre含量高于正常對照組（均P < 0.05），提示腎陽虛模型成立。腎寶片可增加腎陽虛模型自主活動次數(shù)、低溫游泳存活時間，降低血清BUN、Cre含量，提示腎寶片具有明顯的補腎、護腎作用。在去勢等極端情況下，雄性的勃起功能亦可受到顯著影響。據(jù)報道[15]在大鼠模型中，去勢可減少海綿體動脈流量、誘發(fā)靜脈漏，并使刺激海綿體神經(jīng)誘發(fā)的勃起反應(yīng)降低約50%。ICP測定是判斷陰莖勃起功能的金標準[16]。本研究采用去勢大鼠模型，所測指標如勃起潛伏期、陰莖海綿體ICP值、血清T含量等均顯示造模成功;腎寶片可明顯縮短勃起潛伏期，增加陰莖海綿體ICP值及ICP/BP比值，提示腎寶片具有補腎作用。

腎藏精功能與性激素關(guān)系密切，溫腎能改善腎功能，也能增加雄性激素水平[17]。T水平降低通常與肥胖、糖尿病、高脂血癥和代謝綜合征等代謝性疾病伴發(fā)，還可影響患者的勃起功能。T作為男性的主要雄性激素，20～29歲時達高峰，以后隨年齡增高而下降[18]。本研究結(jié)果顯示，腎寶片可增加腎陽虛模型和去勢大鼠的血清T含量，提示腎寶片可能通過下丘腦-垂體-性腺軸發(fā)揮補腎作用。

NO/cGMP通路是目前與陰莖勃起相關(guān)的最為經(jīng)典、研究最為深入的分子信號通路。當性刺激信號傳遞至陰莖海綿體時，左旋精氨酸在NOS作用下產(chǎn)生NO，NO進入海綿體平滑肌細胞內(nèi)刺激可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）將三磷酸鳥苷（GTP）轉(zhuǎn)化為最為重要的第二信使cGMP，后者激活cGMP特異性蛋白激酶（PKG），進而對多種離子通道產(chǎn)生影響，使海綿體平滑肌舒張，誘發(fā)陰莖組織充血勃起[19]。單體成分淫羊藿苷能明顯抑制磷酸二酯酶5活性，增加cGMP在陰莖海綿體平滑肌細胞內(nèi)的濃度，增強NO/cGMP通路活性，從而松弛陰莖海綿體平滑肌，改善勃起功能[20]。本研究結(jié)果顯示腎寶片可增加腎陽虛模型和去勢大鼠的陰莖海綿體cGMP水平，提示腎寶片可能通過NO/cGMP通路發(fā)揮補腎作用。

腎氣虛衰是衰老的主要原因，衰老的自由基學說認為自由基對機體的損傷與毒害是導致人體衰老的最重要的因素。隨著年齡的增殖，體內(nèi)清除自由基的酶類和非酶系統(tǒng)的功能逐漸衰減，自由基在體內(nèi)聚積的量不斷增加，對機體的持續(xù)性損害導致衰老的發(fā)生[21]。本研究結(jié)果顯示，腎寶片可增加腎陽虛模型血清SOD活性，提示抗氧化可能是其補腎作用機制之一。

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（收稿日期：2020-02-18? 本文編輯：劉明玉）