劉想忠　寧宇　胡靜　楊傲飛　蔡寒濤　李章華

[摘要] 目的 探討極度低氧條件下Ckip-1 siRNA促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨分化作用。 方法 差速貼壁法分離培養(yǎng)兔BMSCs，常氧（20%）及極度低氧（1%）條件下培養(yǎng)72 h，實時熒光定量PCR（qPCR）及Western blot檢測成骨基因Run相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、SMAD5及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）表達(dá)，培養(yǎng)3、5、7 d后檢測上清中堿性磷酸酶（ALP）活性。再將BMSCs置于1%氧濃度下培養(yǎng)72 h，觀察Ckip-1 siRNA對Runx2、SMAD5及BMP2表達(dá)及ALP活性的影響。 結(jié)果 1%氧濃度下BMSCs的成骨基因表達(dá)及ALP活性明顯低于20%氧濃度下，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;Ckip-1 siRNA轉(zhuǎn)染后BMSCs成骨基因表達(dá)及ALP活性明顯高于未轉(zhuǎn)染，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 極度低氧可抑制BMSCs成骨分化能力，而Ckip-1 siRNA促進BMSCs在極度低氧條件下向成骨細(xì)胞分化。

[關(guān)鍵詞] 低氧;Ckip-1 siRNA;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;成骨分化

[中圖分類號] R331.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（c）-0010-06

[Abstract] Objective To investigate the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） by Ckip-1 siRNA under extreme hypoxia. Methods BMSCs were isolated and cultured in normal oxygen （20%） and extreme hypoxia （1%） for 72 h. The expression of osteogenic gene Runt-related transcription factor 2 （Runx2）， Smad5 and bone morphogenetic protein 2 （BMP2） were detected by real-time quantitative PCR （qPCR） and Western blot. Alkaline phosphatase （ALP） activity in the supernatant was detected after 3， 5， 7 days of culture. BMSCs were cultured in 1% oxygen for 72 h to observe the effect of Ckip-1 siRNA on the expression of Runx2， Smad5， BMP2 and the activity of ALP. Results The osteogenic gene expression and ALP activity of BMSCs in 1% oxygen concentration were significantly lower than those in 20% oxygen concentration group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）; the osteogenic gene expression and ALP activity of BMSCs after transfection with Ckip-1 siRNA were significantly higher than those without transfection， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Hypoxia can inhibit the osteogenic differentiation of BMSCs， and Ckip-1 siRNA can promote the differentiation of BMSCs into osteoblasts.

[Key words] Hypoxia; Ckip-1 siRNA; Bone marrow derived mesenchymal stem cells; Osteogenic differentiation

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種多能干細(xì)胞，其在常氧下可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等，且易于培養(yǎng)。因此，在干細(xì)胞移植方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。然而，發(fā)生骨折或股骨頭壞死時，局部往往形成缺血缺氧環(huán)境，可使局部氧濃度降至1%～2%，甚至更低[3-5]。BMSCs作為種子細(xì)胞，其移植后在低氧條件下生物學(xué)特性的維持是影響療效的關(guān)鍵。目前，關(guān)于在低氧條件下干細(xì)胞的成骨分化能力尚存在爭議，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為極度低氧可抑制BMSCs成骨分化能力[6]。酪蛋白激酶2相互作用蛋白1（casein kinase 2 interaction protein 1，Ckip-1）是近些年發(fā)現(xiàn)的一種負(fù)性調(diào)控蛋白，可抑制Run相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）等成骨基因的表達(dá)而起到成骨抑制作用，敲低其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，可一定程度上促進干細(xì)胞的成骨能力[7-8]。本研究擬觀察敲低BMSCs中Ckip-1表達(dá)是否可增強BMSCs在極度低氧環(huán)境下的成骨分化能力，為后期應(yīng)用Ckip-1治療股骨頭壞死提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

MSCM專用培養(yǎng)基（Sciencell公司，美國）;RNA提取試劑盒（OMEGA公司，美國）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（TOYOBO公司，日本）;引物均由上海生工合成;Ckip-1 siRNA由蘇州貝信公司合成;LipofectaminTM 2000（Invitrogen公司）;成骨誘導(dǎo)液（Cyagen公司，日本）;堿性磷酸酶ALP檢測試劑盒（大連Meilunbio公司）;Runx2兔抗鼠單克隆抗體（Abcam公司，美國）;SMAD5兔單克隆抗體（NOVUS，美國）;BMP2兔單克隆抗體（Bioss公司）。CO2培養(yǎng)箱（Thermal，美國，184L）;qPCR儀器（BIORAD，美國，CFX96）;倒置相差顯微鏡（Leica，德國，SP8-STED）;酶聯(lián)免疫檢測儀（Molecular，美國，ELX800）;低溫離心機（SCILOGEX，美國，D3024）。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔BMSCs原代細(xì)胞提取、培養(yǎng)與鑒定? 取成年新西蘭兔4月齡，雌雄不限，按實驗室之前方法提取、培養(yǎng)與鑒定BMSCs[9]。

不同氧濃度下細(xì)胞的培養(yǎng)：將第3代BMSCs接種于6孔板，分為20%氧濃度組及1%氧濃度組，待貼壁后，將MSCM培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)液2 mL，轉(zhuǎn)至含37℃、5%CO2、氧濃度分別為20%及1%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、5、7 d。

Ckip-1 siRNA轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)：對第3代BMSCs進行Ckip-1 siRNA轉(zhuǎn)染，分為空白組、陰性對照組及Ckip-1 siRNA組，Ckip-1 siRNA終濃度為50 pmol/mL，1%氧濃度條件下培養(yǎng)3、5、7 d。

1.2.2 ALP活性檢測? 細(xì)胞培養(yǎng)完成后收集上清，根據(jù)ALP試劑盒說明，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔及樣品孔，以510 nm波長檢測吸光度，計算公式：ALP活性（金氏單位/100 mL）=（測量的OD值-空白孔OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)孔OD值-空白孔OD值）。

1.2.3 成骨基因mRNA表達(dá)檢測? 細(xì)胞培養(yǎng)完成后，PBS洗滌收集細(xì)胞，按1×106個細(xì)胞加1 ml Trizol Reagent 進行總RNA提取，紫外分光光度儀測定純度A260/A280比值為1.80～1.90，定量，各取1 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。引物設(shè)計：按照NCBI GENE查詢的Runx2、SMAD5、BMP2及GAPDH基因序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Runx2引物序列：上游5′-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3′，下游5′-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3′;GAPDH引物序列：上游5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′;Smad5引物序列：上游5′-TGCCTATATGCCACCTGAT′，下游：5′-CTGAACATCTCTGCTGGATAT-3′;BMP2引物序列：上游5′-TGCACCCAGATGAACACAGC-3′，下游5′-TCCGCTGTTTGTGTTTCGCT-3′;qPCR反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL的SYBRMIX，1 μL的上下游引物混合液及1 μL cDNA，加入DEPC水補至20 μL，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，72℃退火15 s，60℃延伸15 s，39個循環(huán)后檢測溶解曲線。

1.2.4 Western blot檢測成骨基因蛋白表達(dá)? 細(xì)胞培養(yǎng)完成后，PBS洗滌兩次收集細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，0℃裂解30 min，半徑為20 cm的低溫離心機12 000 r/min離心15 min后，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。上清加入蛋白上樣緩沖液于100℃變性5 min。配置10%分離膠及濃縮膠，行SDS-PAGE電泳，200 mA恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜。脫脂奶粉配置5%封閉液，封閉60 min，以GAPDH蛋白為內(nèi)參，分別加入GAPDH抗體、Runx2抗體、Smad5抗體及BMP2抗體，4℃孵育過夜。二抗室溫孵育1 h。超敏ECL試劑盒反應(yīng)后，在Biorad化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影。

1.2.5 檢測Ckip-1 siRNA對BMSCs細(xì)胞Ckip-1基因的沉默作用? 將第3代BMSCs均勻種植于6孔板中，貼壁后進行siRNA轉(zhuǎn)染，分為空白組、陰性對照組及Ckip-1 siRNA組，用無血清DMEM稀釋siRNA、Negative control及Lipo2000，根據(jù)siRNA說明書以10、20、50 pmol/mL的Ckip-1 siRNA終濃度進行轉(zhuǎn)染，1%氧濃度培養(yǎng)72 h。qPCR檢測Ckip-1的表達(dá)。Ckip-1引物物序列：上游引物5′-TGCTGGGAGAG-GCGTCATCG-3′，下游引物5′-GCTCTTGCGGTACT-GGCTGTG-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料以頻數(shù)、構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察

BMSCs貼壁后呈梭形、多角形，隨著培養(yǎng)時間延長，出現(xiàn)克隆式生長，呈長梭形。在低倍鏡下呈緊密排列的旋渦狀生長（圖1A），在高倍鏡下呈長梭形、成纖維細(xì)胞樣生長（圖1B）。見圖1。

2.2 不同氧濃度下成骨基因表達(dá)

2.2.1 ALP活性檢測? 1%氧濃度組培養(yǎng)3、5、7 d細(xì)胞ALP活性明顯低于20%氧濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2.2 不同氧濃度下成骨基因mRNA表達(dá)比較? 培養(yǎng)細(xì)胞72 h后。qPCR結(jié)果顯示：1%氧濃度組細(xì)胞成骨基因Runx2、SMAD5及BMP2的表達(dá)均低于20%氧濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

2.2.3 不同氧濃度下成骨基因蛋白表達(dá)比較? 培養(yǎng)細(xì)胞72 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示：1%氧濃度組細(xì)胞成骨基因蛋白表達(dá)明顯低于20%氧濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

2.3 Ckip-1 siRNA對BMSCs的沉默作用

Ckip-1 siRNA轉(zhuǎn)染72 h后，qPCR結(jié)果顯示：10、20、50 pmol/mL Ckip-1 siRNA組中Ckip-1的表達(dá)量均低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;在50 pmol/mL時最低，50 pmol/mL組Ckip-1的表達(dá)量明顯低于20 pmol/mL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。因此后續(xù)實驗取50 pmol/mL為最終濃度。見圖4。

2.4 在1%氧條件下Ckip-1 siRNA對BMSCs成骨基因表達(dá)的影響

2.4.1 ALP活性檢測? 在不同時間段，Ckip-1 siRNA組上清中ALP活性均高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.4.2 Ckip-1 siRNA對BMSCs成骨基因mRNA表達(dá)的影響? 培養(yǎng)細(xì)胞72 h后，qPCR結(jié)果顯示：1%氧條件下，Ckip-1 siRNA組細(xì)胞成骨基因Runx2、SMAD5及BMP2 mRNA表達(dá)均高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖5。

2.4.3 Ckip-1 siRNA對BMSCs成骨基因蛋白表達(dá)的影響? 培養(yǎng)細(xì)胞72 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示：Ckip-sRNA組細(xì)胞成骨基因蛋白表達(dá)明顯高于空白組，差異差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖6。

3 討論

BMSCs作為多能干細(xì)胞，在組織工程中的應(yīng)用具有重要地位。體外培養(yǎng)BMSCs大多數(shù)是在常氧環(huán)境下進行，然而在體內(nèi)很多部位氧濃度較低，如軟骨或關(guān)節(jié)部位氧濃度一般在6%～10%，深部關(guān)節(jié)更是可達(dá)1%，發(fā)生大面積骨缺損及股骨頭壞死等疾病時，氧濃度還可降至更低水平[10-11]。進行外源性干細(xì)胞移植治療這類疾病時，干細(xì)胞將面臨嚴(yán)重的缺血缺氧、營養(yǎng)因子缺乏等一系列問題，因此，提高BMSCs在低氧環(huán)境中的存活能力并維持成骨特性非常重要。盡管對低氧狀態(tài)下干細(xì)胞的研究較多，但對BMSCs在低氧下的生物學(xué)特性仍未達(dá)成共識。研究顯示[12-13]，低氧可誘導(dǎo)干細(xì)胞高表達(dá)低氧誘導(dǎo)因子，激活血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，促進其成血管能力。胡旭治等[14]通過低氧劑CoCl2建立低氧模型，發(fā)現(xiàn)BMSCs的成骨基因蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。羅蕓等[15]通過比較20%、10%及5%氧濃度下充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，5%氧條件下對細(xì)胞除具有抗凋亡作用外，還有成神經(jīng)誘導(dǎo)能力。Holzwarth等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)充質(zhì)干細(xì)胞由常氧轉(zhuǎn)移至1%氧濃度后，其生長多停滯在G1期，成骨及成脂分化能力均減弱，但由1%氧濃度恢復(fù)至3%氧濃度時，則成骨分化能力有所提高。ALP是細(xì)胞成骨分化的早期指標(biāo)，與細(xì)胞成骨能力有關(guān)[17]。本研究中，BMSCs在1%氧濃度下培養(yǎng)3、5、7 d后，上清中ALP活性明顯低于20%氧濃度，且各項成骨蛋白Runx2、SMAD5及BMP2的表達(dá)量均較20%氧濃度低。

為改善BMSCs在低氧環(huán)境下的耐受能力，廖紅興等[18]將載有骨形態(tài)發(fā)生蛋白6及低氧誘導(dǎo)因子1a的腺病毒轉(zhuǎn)染入干細(xì)胞內(nèi)，并在2%氧濃度下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，實驗組血管及成骨能力均明顯增強。王梓豪等[19]研究顯示，過表達(dá)GATA-4-BMSCs可以通過增強BMSCs抗凋亡能力，有效改善小鼠心肌梗死后的心功能。提示通過對干細(xì)胞進行干預(yù)可促進其成骨分化能力。

Ckip-1對MSCs的調(diào)節(jié)作用近年來受到人們的廣泛關(guān)注，作為骨負(fù)性調(diào)節(jié)因子，Ckip-1的C末端結(jié)構(gòu)域可以與Smurf1兩個WW結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)發(fā)生相互作用以激活Smurf1因子，進而激活泛素-蛋白酶降解系統(tǒng)，降解Runx2、BMP2等成骨基因表達(dá)，抑制體內(nèi)成骨，引起骨質(zhì)疏松[20-22]。通過不同方式干擾Ckip-1的表達(dá)，可一定程度上促進干細(xì)胞成骨，如陳俊鳳等[23]通過使干細(xì)胞的microRNA-20a過表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)可抑制Ckip-1表達(dá)，進而促進成骨基因表達(dá)?；蛘咄ㄟ^其特異性siRNA，也可降低Ckip-1表達(dá)，在體內(nèi)可增加骨量及骨小梁體積。在體外，還可抑制BMSCS凋亡，而促進成骨能力，提高骨鈣素表達(dá)[24]。然而，目前關(guān)于Ckip-1對充質(zhì)干細(xì)胞的研究多是在常氧條件下進行的，在低氧環(huán)境下是否仍具有同樣作用，研究較少。本研究在極度低氧環(huán)境下敲低BMSCs內(nèi)Ckip-1表達(dá)，以探索是否在低氧環(huán)境下Ckip-1 siRNA仍有促成骨能力，為改善BMSCs在極度缺氧環(huán)境中的成骨能力尋找新方法。本研究首先驗證了低氧環(huán)境下Ckip-1 siRNA的特異性干擾作用，結(jié)果顯示隨著濃度的提高，Ckip-1 siRNA的抑制作用更加明顯。故本研究選取最高濃度50 pmol/mL作為實驗濃度，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Ckip-1 siRNA后，BMSCs的成骨基因表達(dá)明顯上調(diào)，提示在極度低氧條件下，BMSC轉(zhuǎn)入Ckip-1 siRNA后成骨能力明顯提高。

綜上所述，在極度低氧條件下，BMSCs的成骨分化能力明顯受抑制，通過轉(zhuǎn)染Ckip-1 siRNA降低Ckip-1的表達(dá)，可一定程度上提高BMSCs的成骨能力。這提示，當(dāng)對骨折或股骨頭壞死等局部引起極度缺氧疾病進行干細(xì)胞移植時，通過抑制Ckip-1表達(dá)，可在一定程度上改善BMSCs的成骨能力。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Bashir J，Sherman A，Lee H，et al. Mesenchymal stem cell therapies in the treatment of musculoskeletal diseases [J]. Pm R，2014，6（1）：61-69.

[2]? Abdallah BM，Alzahrani AM，Kassem M. Secreted Clusterin protein inhibits osteoblast differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by suppressing ERK1/2 signaling pathway [J]. Bone，2018，110：221-229.

[3]? Gordillo GM，Sen CK. Revisiting the essential role of oxygen in wound healing [J]. Am J Surg，2003，186（3）：259-263.

[4]? Muinos-López E，Ripalda-Cemboráin P，López-Martínez T，et al. Hypoxia and Reactive Oxygen Species Homeostasis in Mesenchymal Progenitor Cells Define a Molecular Mechanism for Fracture Nonunion [J]. Stem Cells，2016， 34（9）：2342-2353.

[5]? Li Z，Liao W，Zhao Q，et al. Angiogenesis and bone regeneration by allogeneic mesenchymal stem cell intravenous transplantation in rabbit model of avascular necrotic femoral head [J]. J Surg Res，2013，183（1）：193-203.

[6]? 趙強，廖文，柳銘，等.低氧對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨相關(guān)基6因表達(dá)的影響[J].生物技術(shù)通訊，2012，23（6）：833-836.

[7]? Peng X，Wu X，Zhang J，et al. The role of CKIP-1 in osteoporosis development and treatment [J]. Bone Joint Res，2018，7（2）：173-178.

[8]? 胡炯，王博，吳鵬，等.Ckip-1與骨質(zhì)疏松的最新研究進展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2016，22（8）：1053-1057.

[9]? Li ZH，Liao W，Cui XL，et al. Intravenous transplantation of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells and its directional migration to the necrotic femoral head [J]. Int J Med Sci，2011，8（1）：74-83.

[10]? Dinulovic I，F(xiàn)urrer R，Handschin C. Plasticity of the Muscle Stem Cell Microenvironment[J]. Adv Exp Med Biol，2017，1041：141-169.

[11]? Chung HM，Won CH，Sung JH. Responses of adipose-derived stem cells during hypoxia：enhanced skin-regenerative potential [J]. Expert Opin Biol Ther，2009，9（12）：1499-1508.

[12]? Chen Y，Zhao Q，Yang X，et al. Effects of cobalt chloride on the stem cell marker expression and osteogenic differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth [J]. Cell Stress Chaperones，2019，24（3）：527-538.

[13]? 梁楚婷，郭煒驊，譚理，等.低氧誘導(dǎo)因子-1：細(xì)胞適應(yīng)氧供應(yīng)改變的關(guān)鍵蛋白[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2019，46（11）：1041-1049.

[14]? 胡旭治，史新連，鄧輝.大麻素Ⅱ型受體參與調(diào)控低氧微環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的骨向分化[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2019，49（8）：563-567.

[15]? 羅蕓，馬俊，錢前，等.不同低氧濃度對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2019， 31（8）：6-11.

[16]? Holzwarth C，Vaegler M，Gieseke F，et al. Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells [J]. BMC Cell Biol，2010，11：11.

[17]? 李頡頏，蘇志飛，白璇，等.唑來膦酸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化的作用研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2019，37（3）：242-247.

[18]? 廖紅興，張志輝，劉展亮，等.低氧誘導(dǎo)因子1α與骨形態(tài)發(fā)生蛋白6協(xié)同過表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧環(huán)境下的成骨和成血管效應(yīng)[J].中國組織工程研究，2019， 23（17）：26-32.

[19]? 王梓豪，賀繼剛，謝巧麗，等.過表達(dá)GATA-4的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞改善小鼠心肌梗死后的心功能[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2019，39（9）：1229-1233.

[20]? Lu K，Yin X，Weng T，et al. Targeting WW domains linker of HECT-type ubiquitin ligase Smurf1 for activation by Ckip-1 [J]. Nat Cell Biol，2008，10（8）：994-1002.

[21]? Piacentino ML，Bronner ME. Intracellular attenuation of BMP signaling via CKIP-1/Smurf1 is essential during neural crest induction [J]. PLoS Biol，2018，16（6）：e2004425.

[22]? Chan MC，Nguyen PH，Davis BN，et al. A novel regulatory mechanism of the bone morphogenetic protein （BMP） signaling pathway involving the carboxyl-terminal tail domain of BMP type Ⅱ receptor [J]. Mol Cell Biol，2007， 27（16）：5776-5789.

[23]? 陳俊鳳，楊燕美，董溪溪，等.MicroRNA-20a通過調(diào)節(jié)Ckip-1促進小鼠C3H/10T1/2成骨分化[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2017，25（1）：214-220.

[24]? Zhou ZC，Che L，Kong L，et al. CKIP-1 silencing promotes new bone formation in rat mandibular distraction osteogenesis [J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol，2017，123（1）：e1-e9.

（收稿日期：2020-02-06? 本文編輯：劉永巧）