高加龍，章超樺，秦小明，曹文紅，鄭惠娜，林海生

不同溫度無水?；顚ο愀勰迪犖⑸锖突緺I養(yǎng)成分的影響

高加龍，章超樺，秦小明，曹文紅，鄭惠娜，林海生

（廣東海洋大學食品科技學院//國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江）//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室//廣東省海洋生物制品工程實驗室//水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088；海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心（大連工業(yè)大學），遼寧 大連 116034）

【】研究溫度對無水?；钕愀勰迪牐ǎ┐婊顮顟B(tài)、微生物以及營養(yǎng)品質(zhì)的影響。對在4 ℃、10 ℃和15 ℃條件下?；畈煌瑫r間的牡蠣存活率、菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)以及主要營養(yǎng)成分含量進行測定。4 ℃條件下?；? d后牡蠣存活率仍可達到95 %，高于10 ℃和15 ℃的存活率；在保活前期，牡蠣菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)變化不大，當4 ℃?；? d后，10 ℃?；? d后和15 ℃?；? d后微生物數(shù)量急劇上升，超過了國際微生物標準委員會新鮮雙殼貝類的微生物限量標準；在保活過程中，牡蠣的水分含量變化差異不顯著（> 0.05），隨著?；顣r間的延長，蛋白質(zhì)含量稍有下降，而脂肪含量和糖原含量則消耗較多，乳酸含量逐漸上升；與4 ℃相比，10 ℃和15 ℃條件下?；畹哪迪犞竞吞窃南母?。4 ℃條件下牡蠣?；顣r間更長，營養(yǎng)物質(zhì)損失相對較低，更利于牡蠣?；盍魍?。

香港牡蠣；無水?；睿晃⑸?；營養(yǎng)成分

牡蠣是我國第一大養(yǎng)殖貝類，2018年總產(chǎn)量約514萬t[1]。香港牡蠣（）是我國南海海域主要養(yǎng)殖品種，主要分布在廣東汕頭、江門、陽江、湛江，廣西欽州、北海、防城港以及越南沿海等地。在我國，牡蠣主要以鮮銷為主，鮮活牡蠣在泡沫箱加冰包裝后無水運輸。相比有水保活運輸，水產(chǎn)品加冰無水運輸不僅能夠促進產(chǎn)品的鮮度，防止運輸和?；钸^程中失重，減少死亡率，還可以簡化運輸管理、降低運輸成本[2-3]。除運輸外，雙殼貝類的貿(mào)易鏈還包含捕獲、凈化和儲存等環(huán)節(jié)，在整個貿(mào)易過程中貝類會受到多種壓力，包括長時間的空氣暴露和溫度波動。這些應(yīng)激源強烈地降低動物質(zhì)量，引起動物代謝發(fā)生重要變化，并造成貿(mào)易鏈的重大經(jīng)濟損失，因此，監(jiān)測保護雙殼類動物的生理狀況對于避免死亡率和優(yōu)化利益相關(guān)者的盈利能力至關(guān)重要[4-5]。

牡蠣自身帶有很多微生物且處于可繁殖狀態(tài)，如果在運輸過程中發(fā)生死亡，會加速微生物的繁殖并影響其他牡蠣的存活及品質(zhì)，因此，牡蠣的?；罴斑\輸過程中的微生物以及品質(zhì)控制成為了鮮活牡蠣銷售的關(guān)鍵問題。本研究以香港牡蠣為研究對象，探討經(jīng)過凈化后的牡蠣在不同溫度條件下無水保活過程中存活率、體內(nèi)菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)以及主要營養(yǎng)成分含量的變化規(guī)律，旨在為牡蠣的低溫?；钸\輸提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香港牡蠣（），殼長8~ 10 cm，購自湛江官渡牡蠣養(yǎng)殖場，1 h內(nèi)運到實驗室，清洗后置于水產(chǎn)品低溫凈化系統(tǒng)。凈化24 h后挑選成活且殼無破損的牡蠣作為樣品；將牡蠣樣品分為3組，分別儲藏在4、10和15 ℃條件下，在儲藏期間每天統(tǒng)計存活率，儲藏開始0 h、12 h以及1 ~ 9 d各時間段分別取3個活牡蠣檢測菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)，0 ~ 9 d每天分別取5個牡蠣測定基本營養(yǎng)成分及糖原和乳酸等指標含量。

所用成品微生物培養(yǎng)基干粉均購自北京陸橋公司，按說明書配制滅菌后使用。糖原和乳酸測定試劑盒，購自南京建成。其余化學試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯層析柜，上海浦西；VAP 450全自動凱氏定氮儀，Gerhardt公司；Varioskan Flash全自動酶標儀，Thermo Scientific公司；SZF-06A粗脂肪測定儀，上海洪記儀器設(shè)備有限公司；水產(chǎn)品低溫凈化設(shè)備，廣州創(chuàng)領(lǐng)水產(chǎn)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凈化方法 牡蠣的凈化工藝流程參照貝類凈化技術(shù)規(guī)范SC/T 3013?2002[6]。天然海水取自湛江東海島龍海天海濱的海水井，在凈化設(shè)備暫養(yǎng)池中以5 m3/h流速循環(huán)制冷至20 ℃，通臭氧至臭氧濃度達到0.15 mg/L，循環(huán)海水紫外線（λ = 254 nm）殺菌，牡蠣經(jīng)海水清洗后在預冷滅菌海水中凈化24 h[7]。

1.3.2 方案設(shè)計 凈化后的牡蠣共300個，在50 cm × 30 cm × 30 cm泡沫箱中分裝，約5 kg/箱，裝箱前在箱底鋪一層約1 cm厚的冰袋，加蓋后分別放置在溫度設(shè)定為4、10和15 ℃的層析柜中儲藏，每個溫度條件約100個牡蠣，隨之對牡蠣在無水?；钸^程中各種儲藏溫度條件下的存活狀態(tài)、微生物數(shù)量以及主要營養(yǎng)成分進行研究。

1.3.3 檢活方法 采用目測法，依據(jù)牡蠣的貝殼張開情況，能自由閉合的為活貝，不能閉合的為死貝。存活率為活牡蠣占牡蠣總數(shù)的百分比。

1.3.4 微生物測定 取實驗活牡蠣，在流水下將表面沖洗干凈，無菌取牡蠣可食部分25 g，加無菌生理鹽水225 mL，3 000 r/min均質(zhì)5 min[8]。菌落總數(shù)的測定按照GB 4789.2?2016規(guī)定進行[9]；大腸菌群的測定按照GB 4789.3?2016平板計數(shù)法規(guī)定進行[10]。每個時間節(jié)點分別測定3個牡蠣的菌數(shù)，結(jié)果取平均值。

1.3.5 主要營養(yǎng)成分測定 水分采用常壓干燥法測定；蛋白采用全自動凱氏定氮儀直接測定；脂肪采用索氏抽提法在索氏抽提器中測定；糖原采用肌糖原和肝糖原測定試劑盒測定；乳酸采用乳酸（Lactic Acid）測定試劑盒測定。每個保活時間節(jié)點各取5個牡蠣，開殼取肉，在定性濾紙上吸干外表水分，每個牡蠣勻漿后測定以上各指標，結(jié)果取平均值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 26.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，采用鄧肯氏法進行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同?；顪囟葘δ迪牬婊盥实挠绊?/h3>

凈化后的香港牡蠣，分別于4 ℃、10 ℃和15 ℃層析柜內(nèi)無水保活，每天目測檢活統(tǒng)計存活率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同保活溫度下香港牡蠣的存活率

從圖1存活率數(shù)據(jù)來看，保活2 d內(nèi)香港牡蠣在3個溫度條件下均無死貝出現(xiàn)，存活率100 %，之后隨著?；顣r間的延長存活率有所下降。對比3個?；顪囟龋? ℃下?；钅迪牭拇婊盥首罡?，15 ℃下存活率最低；?；? d后4 ℃、10 ℃和15 ℃條件下?；畹哪迪牬婊盥史謩e為95 %、93 %和88 %。4 ℃接近于牡蠣的生態(tài)冰溫[7]，在此溫度下牡蠣處于休眠或者半休眠狀態(tài)，代謝活動比較微弱，可以較長時間保持其生命活力；隨著溫度升高，牡蠣的新陳代謝逐漸增強，能耗增大，在沒有食物供給的情況下，死亡率逐漸增大。本實驗?；顥l件下香港牡蠣的存活率遠高于郭曉偉等[11]對太平洋牡蠣冰溫條件下的存活率（?；? d后存活率50 %），該研究中牡蠣外殼包裹保鮮膜可能影響到牡蠣的存活。其他雙殼貝類?；钛芯恐校成蓉悾ǎ┰? ℃條件下無水?；?0 d后存活率可以達到91%[12]；菲律賓簾蛤（）4 ℃下半干?；羁梢源婊? d以上（以LT50計），而在22 ℃條件下只可存活1 d（以LT50計）[12]?？梢?，雙殼貝類的存活率與?；顪囟汝P(guān)系很大。因此，在實際生產(chǎn)過程中，牡蠣銷售商根據(jù)?；顣r間選擇?；顪囟龋瑢Χ掏具\輸?shù)哪迪犞皇羌颖采w后常溫運輸，而運輸時間較長的線路宜采用恒溫車低溫運輸。

2.2 不同?；顪囟葘δ迪牼淇倲?shù)和大腸菌群的影響

貝類凈化是將濾食性的雙殼貝類放在一個潔凈的水環(huán)境中，使之張殼，排除致病微生物和泥沙的過程。一方面是使水產(chǎn)生物腸道排空，防止運輸途中產(chǎn)生有毒排泄物的積累而污染水質(zhì)；另一方面是對其進行馴冷化，使其降低新陳代謝，從而適應(yīng)低溫運輸[14-15]。貝類凈化的效果與其水泵運動（water-pumping activity）有關(guān)，有報道海灣牡蠣（）和太平洋牡蠣（）會隨著凈化溫度的提高而增加水泵運動次數(shù)，而且夏天采收的牡蠣會比其他季節(jié)采收的牡蠣含有較少的副溶血性弧菌[16-17]?？紤]以上原因及課題組前期研究結(jié)果[7]，本試驗采用20 ℃殺菌海水進行牡蠣凈化。

天然海水經(jīng)紫外和臭氧殺菌，取25 mL殺菌海水按1.3.4方法測定大腸菌群數(shù)和菌落總數(shù)，結(jié)果顯示殺菌后海水中的菌落總數(shù)為23 CFU/mL，大腸菌群未檢出。在20 ℃恒溫條件下牡蠣在循環(huán)海水中凈化24 h，牡蠣肉的菌落總數(shù)由凈化前的4.2×105CFU/g降低為2.2×104CFU/g，凈化前后均符合國際微生物標準委員會對新鮮雙殼貝類的微生物限量標準（菌落總數(shù)的限量為5×105CFU/g）[18]。將凈化后的牡蠣分裝在泡沫箱中于不同溫度條件下進行無水?；睿煌；顪囟群蜁r間對牡蠣的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)的影響分別如圖2、3所示。

凡含一個相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）

凡含一個相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）

從圖2可見，牡蠣在4 d內(nèi)所有組菌落總數(shù)變化無顯著性差異（> 0.05），5 d后15 ℃下保活組的菌落總數(shù)增長速率顯著快于4 ℃下?；罱M（< 0.05），6 d后10 ℃和15 ℃?；罱M的菌落總數(shù)增長速率均高于4 ℃保活組（< 0.05）。4 ℃?；罱M在6 d后菌落總數(shù)急劇上升，超過了上述微生物限量標準（5×105CFU/g），在7 d時達到1.8×106CFU/g。圖3大腸菌群數(shù)數(shù)據(jù)顯示，牡蠣在10 ℃和15 ℃條件下大腸菌群數(shù)均高于4 ℃?；罱M，且在3 ~ 7 d時均呈現(xiàn)顯著性差異（< 0.05）。說明?；钸^程中牡蠣的微生物含量與牡蠣?；顪囟群痛婊盥视泻艽箨P(guān)系。參考圖1存活率數(shù)據(jù)，牡蠣在4 ℃、10 ℃和15 ℃條件下分別?；? d、4 d和3 d后存活率均低于96 %，當死貝數(shù)量增加到一定程度會嚴重影響同一包裝箱內(nèi)其他牡蠣的微生物數(shù)量，進而影響其他牡蠣的存活狀況，而冰溫對有害微生物生長及各種酶的活性具有明顯的抑制作用，有利于貝類長時間?；頪19-20]。

2.3 不同?；顪囟葘δ迪牷緺I養(yǎng)成分含量的影響

不同溫度無水?；畹哪迪?，在?；铍A段每天取樣測定其水分、粗蛋白、粗脂肪、糖原、乳酸的含量。由圖4可見，樣品牡蠣含水量較高，?；钪跛仲|(zhì)量分數(shù)為83.8%（以干基計），在?；钋捌诒３址€(wěn)定，4 d后稍有下降；?；? d后牡蠣可食部分的水分質(zhì)量分數(shù)仍然高于82.0 %，較保活之初下降了2.1 %，而保活溫度對牡蠣水分含量影響也不大（> 0.05）。研究報道，海灣扇貝在低溫無水?；?0 d后水分含量僅下降了1.1%[21]。雙殼貝類在在低溫密閉的保濕環(huán)境下水分含量損失較小，一是可能因為加冰和加蓋保持了相對恒定的濕度、溫度和氧氣，導致貝類的代謝降低，有利于貝類在無水環(huán)境中敞殼獲得氧氣[22]；二是可能因為貝類在低溫無水?；钸^程中自身代謝消耗水分較少，隨著?；顣r間延長，死亡率增大，體液損失增多造成水分含量減少[23]。

圖4 不同溫度無水保活過程中香港牡蠣體內(nèi)水分含量的變化

圖5是?；钸^程中牡蠣粗蛋白含量（以干基計）的變化趨勢。保活2 d內(nèi)，粗蛋白含量無顯著性變化（> 0.05），5 d后粗蛋白含量平緩下降，10 ℃?；罱M蛋白質(zhì)含量與4 ℃、15 ℃存在顯著性差異（< 0.05），?；? d后粗蛋白含量下降約10%。牡蠣在無水?；钸^程中沒有食物來源，主要利用自身供能物質(zhì)來維持生命[24]，但作為供能物質(zhì)之一的粗蛋白消耗并不大，由此推斷香港牡蠣在?；钸^程中的主要供能物質(zhì)不是蛋白質(zhì)。

凡含一個相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）；以干基計

隨著保活時間的延長，香港牡蠣粗脂肪含量（干基）呈下降趨勢。在保活2 ~ 9 d內(nèi)（除5 d時），10 ℃組牡蠣脂肪含量顯著小于4 ℃?；罱M（< 0.05）；在保活6 ~ 8 d內(nèi)，10 ℃組牡蠣脂肪含量與15 ℃保活組存在顯著性差異（< 0.05）。與?；钋跋啾龋? ℃組?；? d后，牡蠣粗脂肪含量下降了14.8%，10 ℃組和15 ℃組分別下降了40.4%和34.1%（圖6）。說明粗脂肪是牡蠣在生態(tài)冰溫?；顥l件下的主要供能物質(zhì)之一，溫度越高，牡蠣代謝越旺盛，能量需求越高，所以脂肪消耗越多。文蛤和波紋巴非蛤均被證明以脂肪和碳水化合物為主要供能物質(zhì)[25-26]。

糖原是貝類的主要能源貯藏形式，在沒有食物供給的條件下，為了維持其生命活動，糖原首先被大量消耗，糖原的水平可反映貝類在脅迫條件下維持其基本生存和應(yīng)對持續(xù)的脅迫因素的能力[27]。圖7是香港牡蠣無水保活過程中糖原含量變化趨勢。在?；钸^程中牡蠣糖原含量逐漸下降，4 ℃條件下?；? d后糖原由?；畛跗诘?8.5 mg/g降低至36.1 mg/g，降低了25.5%，而10 ℃和15 ℃條件下則降低了約41.0%；在?；? ~ 9 d內(nèi)，4 ℃?；钅迪牭奶窃匡@著高于10 ℃和15 ℃條件下牡蠣糖原含量（< 0.05），可見糖原是香港牡蠣在無水保活條件下除脂肪外的另一主要供能物質(zhì)，而且，保活溫度越高，牡蠣自身需要耗能也越高。

凡含一個相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）；以干基計

凡含一個相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）；以干基計

由圖8可知，牡蠣在三種溫度?；钸^程中乳酸含量呈上升趨勢，除4 d時外，?；?~9 d內(nèi)4 ℃?；钅迪牭娜樗岷烤@著低于15 ℃條件下牡蠣乳酸含量（< 0.05）。4 ℃下?；? d，乳酸含量由10.08 μmol/g上升到24.31 μmol/g，增加了141.2%，15 ℃下則增加了176.2%。由此可見，相比于蛋白質(zhì)的消耗，香港牡蠣在無水?；钸^程中消耗更多的脂肪和糖原。波紋巴非蛤在15 ℃條件下?；? d后，粗蛋白、粗脂肪和糖原分別下降了10.5%、20.0%和31.0%，而乳酸含量上升50.1%[26]。

凡含一個相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）；以干基計

將乳酸含量的變化曲線與糖原含量的變化曲線相比較，可以看出，乳酸含量的變化曲線與糖原含量的變化曲線呈負相關(guān)，即隨著糖原含量的下降，乳酸含量上升。在低溫無水?；钸^程中，牡蠣進行無氧呼吸，糖原代謝產(chǎn)生大量乳酸，因此在體內(nèi)的含量呈上升趨勢[28]。

3 討論與結(jié)論

香港牡蠣是華南地區(qū)的主要養(yǎng)殖品種，其營養(yǎng)豐富，具有高蛋白低脂肪等特點。近年來隨著消費模式的改變，越來越多的人通過電商途徑購買鮮活牡蠣，本研究模擬了當前國內(nèi)電商運輸及短途運輸溫度（4 ℃、10 ℃和15 ℃）條件，并對該條件下無水?；钸^程中香港牡蠣的存活率、微生物數(shù)量以及主要營養(yǎng)成分含量的變化進行研究。

在3種實驗溫度條件下，香港牡蠣保活2 d內(nèi)均無死貝出現(xiàn)，4 ℃下保活9 d后存活率仍然達到95%，存活率高于其他2個溫度。在?；钋捌?，牡蠣菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)變化不大，在4 ℃保活6 d，10 ℃?；? d和15 ℃?；? d后微生物數(shù)量急劇上升，超過了國際微生物標準委員會對新鮮雙殼貝類的微生物限量標準，可見，牡蠣保活過程中微生物數(shù)量與存活率有很大關(guān)系。

在無水保活過程中，牡蠣的水分含量變化不大，隨著保活時間的延長，蛋白質(zhì)含量稍有下降，而脂肪含量和糖原含量則消耗較多，與4 ℃相比，10 ℃和15 ℃條件下保活的牡蠣脂肪和糖原的消耗更多，可見，脂肪與糖原是牡蠣更重要的供能物質(zhì)。在牡蠣無水?；钸^程中，伴隨著無氧呼吸，脂肪與糖原含量逐漸降低，乳酸上升，隨之造成牡蠣風味的變化，因此在食用放置較久的牡蠣時會感覺到肥美度、鮮甜度以及口感均低于新鮮牡蠣。

本研究可為牡蠣?；钸\輸提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，根據(jù)牡蠣的存活率、微生物數(shù)量以及營養(yǎng)物質(zhì)等的變化可以選擇更加合適的運輸條件及?；顣r間。

在實際運輸過程中會有顛簸與磕碰等現(xiàn)象，造成牡蠣死亡率上升，從而引起牡蠣微生物及其他生理生化物質(zhì)的變化，為更客觀反映牡蠣冷鏈流通過程中品質(zhì)特征，建立牡蠣品質(zhì)評價及安全控制體系，現(xiàn)實生產(chǎn)運輸條件下牡蠣的存活率、微生物數(shù)量、營養(yǎng)物質(zhì)以及風味物質(zhì)的變化有待進一步研究。

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Effects of Different Temperatures Waterless Keep Alive on Total Number of Bacteria and Coliform Group, and Basic Nutritional Compositions in

GAO Jia-long, ZHANG Chao-hua, QIN Xiao-ming, CAO Wen-hong, ZHENG Hui-na, LIN Hai-sheng

（,,(),,,,524088,;(),116034,）

【】To assess the effect of temperatures on the survival status, microorganisms and nutritional quality of oyster.【】The survival rate, total bacterial count, number of coliform group and basic nutritional compositions of oyster during waterless keep alive at 4 ℃, 10 ℃ and 15 ℃ were determined.【】The survival rate of oysters was 95 % after 9 days keep alive at 4 ℃, which was higher than those observed at 10 ℃ and 15 ℃. At the early stage of waterless keep alive, the total bacterial count and number of coliform group in oysters changed little. After 6 days keep alive at 4 ℃, 5 days keep alive at 10 ℃ and 4 days keep alive at 15 ℃, the number of microorganisms increased sharply and exceeded the limit of the International Committee on Microbial Standards for fresh bivalve shellfish. During the waterless keep alive period, the moisture content of oysters did not change much, the protein content decreased slightly, the fat content and glycogen content were consumed more with the extension of the keep alive time, while the content of lactic acid increased gradually. The consumptions of fat and glycogen in oysters during keep alive at 10 ℃ and 15 ℃ were higher than those at 4 ℃.【】The keep alive time of oyster was longer and nutrient loss was relatively lower at 4 ℃，which is more appropriate for keeping alive and circulation of.

; waterless keep alive; microbiology; nutritional compositions

TS254.4

A

1673-9159（2020）05-0090-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.011

2020-01-21

“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2019YFD0901601）；廣東省科技計劃項目（2015B020205003）；廣東省應(yīng)用型科技研發(fā)專項資金項目（2016B020235002）；貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-49）；廣西科技重大專項（桂科AA16380014）；廣東普通高等學校水產(chǎn)品高值化加工與利用創(chuàng)新團隊項目（GDOU2016030503）

高加龍（1983－），男，博士，講師，研究方向為水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。Email: garonne@126.com

章超樺（1956－），男，博士，教授，研究方向為水產(chǎn)品精深加工。Email: Zhangch2@139.com

高加龍，章超樺，秦小明，等. 不同溫度無水保活對香港牡蠣微生物和基本營養(yǎng)成分的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（5）：90-96.