林沛純，諶素華，王維民，劉海韻，黃丹思，楊志強(qiáng)

亨氏馬尾藻巖藻聚糖結(jié)構(gòu)鑒定及其對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)HMVEC損傷的保護(hù)作用

林沛純1,2，諶素華2,3，王維民2，劉海韻2，黃丹思2，楊志強(qiáng)2

（1. 廣東海洋大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；3. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108）

【】探討4種亨氏馬尾藻巖藻聚糖的結(jié)構(gòu)及其對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)HMVEC損傷的保護(hù)作用。以亨氏馬尾藻巖藻聚糖（FD1）為原料，過(guò) Sepharose Cl-6B瓊脂糖凝膠柱層析得到組分FS11，對(duì)FS11進(jìn)行化學(xué)組成分析和單糖分析，測(cè)定F、FD1、FS1、FS11等4種巖藻聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量、糖鏈構(gòu)象和紅外光譜，進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；采用MTT法測(cè)定3種巖藻聚糖對(duì)HMVEC存活率的影響，研究4種巖藻聚糖對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)HMVEC損傷的保護(hù)作用。與F、FD1、FS1比，F(xiàn)S11硫酸基和多糖含量最高。FS11中巖藻糖含量高達(dá)52.744%；F、FD1、FS1、FS11的相對(duì)分子質(zhì)量分布分別為474 576、459 032、201 285、190 049；I-KI紫外掃描和剛果紅實(shí)驗(yàn)表明巖藻聚糖具有復(fù)雜樹(shù)狀分支和多股螺旋結(jié)構(gòu)；紅外光譜結(jié)果表明各組分均有O—H、C—H多糖特征官能團(tuán)、S==O活性特征官能團(tuán)；加藥培養(yǎng)24 h，質(zhì)量濃度為500 μg/mL和1 000 μg/mL的4種巖藻聚糖（F、FD1、FS1、FS11）均能顯著減弱受氧化型低密度脂蛋白損傷的HMVEC的增殖抑制（＜0.01)。尾藻巖藻聚糖對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的HMVEC損傷具有保護(hù)作用。

亨氏馬尾藻；巖藻聚糖；結(jié)構(gòu)鑒定；誘導(dǎo)損傷；HMVEC

馬尾藻（）屬褐藻門（Phaeophyta）、墨角藻目（Fucales）、馬尾藻科（Sargassaceae）、馬尾藻屬（）。我國(guó)馬尾藻種類繁多，資源豐富，但開(kāi)發(fā)利用的程度較低[1]。馬尾藻中多糖含量豐富，其特征多糖巖藻聚糖為高度吸濕性多

糖[2]，最早由Kylin在二十世紀(jì)初提出并命名[3]。研究發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗凝血等多種活性[4-10]，目前關(guān)于巖藻聚糖結(jié)構(gòu)研究已有重要突破。Gerbst[11]發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖中存在α糖苷鍵，Bilan[12]在2010年提出3種巖藻聚糖結(jié)構(gòu)并初步確定硫酸基的位置，黃桂華[13]采用核磁共振（NMR）、高效液相色譜（HPLC）、傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析（FTIR）等方法研究巖藻聚糖的結(jié)構(gòu)。馬尾藻巖藻聚糖主要成分是L-巖藻糖和硫酸根[14]，其結(jié)構(gòu)特性對(duì)生物活性和藥物作用有很大影響[15]。

目前，對(duì)于巖藻聚糖抗血栓活性的研究多集中在海帶（）[13]上，關(guān)于馬尾藻巖藻聚糖抗血栓活性的研究甚少。本課題組劉海韻[16]采用 DEAE-52 和 Sepharose CL-6B 柱層析法制得不同馬尾藻巖藻聚糖組分，發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠黑尾血栓有較好的抑制效果，但是其體外抗血栓的機(jī)制尚不清楚。本研究采用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱層析法對(duì)亨氏馬尾藻進(jìn)行分離純化，得到馬尾藻巖藻聚糖，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并通過(guò)使用氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)HMVEC損傷，研究馬尾藻巖藻聚糖對(duì)HMVEC的保護(hù)作用，為深入研究馬尾藻巖藻聚糖對(duì)HMVEC的保護(hù)作用和抗血栓的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亨氏馬尾藻，采自廣東省湛江市硇洲島附近海域，經(jīng)清洗、曬干、粉碎得到粉末。對(duì)粉末采用超聲波輔助水提法，經(jīng)過(guò)二次醇沉、脫蛋白和去脂肪得到組分F，將F分別采用DEAE-52、Sepharose CL-6B柱層析法得到組分FD1和FS1。F、FD1和FS1的化學(xué)組成和單糖組成參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。

人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMVEC）購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。DEAE-52纖維素購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖液、DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%-EDTA胰酶均購(gòu)自gibco公司；雙抗（PS）購(gòu)自Hyclone公司；噻唑藍(lán)（MTT）、氧化型低密度脂蛋白、肝素鈉和Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5100紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；HR/T20MM高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡，德國(guó) Leica 公司；Varioskan Flash全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó) Thermo 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 馬尾藻巖藻聚糖分離純化 采用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱層析法[16]。用濃度0.1 mol/L的NaCl對(duì)FD1進(jìn)行洗脫，將得到的樣品命名為FS11。

1.3.2 化學(xué)組成測(cè)定 苯酚硫酸法[17]測(cè)定多糖含量；半胱氨酸鹽酸鹽法[18]測(cè)定L-巖藻糖含量；明膠比濁法[19]測(cè)定硫酸根含量；間羥基聯(lián)苯法[9]測(cè)定糖醛酸含量。

1.3.3 單糖組成測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定FS11的單糖組成。色譜條件：Agilent 1100高效液相色譜儀；色譜柱為XDB-C18，柱溫為30 ℃，柱流量為1.0 mL/min，以磷酸二氫鉀緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.6）/乙腈（體積比83∶17）為流動(dòng)相，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.4 相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定F、FD1、FS1和FS11的相對(duì)分子質(zhì)量，分別稱取一定量的各相對(duì)分子質(zhì)量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，以0.2 mol/L NaCl 為溶劑配制成10 mg/mL的溶液并過(guò)濾。水相儀器為PL-GPC 220，檢測(cè)器為PL-GPC 50（RI），色譜柱采用PL aquqgel-OH MIXED 8 μm 兩根串聯(lián)，以0.2 mol/L NaNO3和0.01 mol/L NaH2PO4為流動(dòng)相，調(diào)整流速為1 mL/min。

1.3.5 多糖糖鏈測(cè)定 配置1 mg/mL巖藻聚糖樣品溶液，取2 mL，加入1.2 mL I-KI試劑，混勻后在300 ~ 700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，根據(jù)掃描結(jié)果即可判斷樣品的糖鏈構(gòu)象。

以蒸餾水為空白對(duì)照，向2 mL蒸餾水中加入2 mL剛果紅試劑，混勻，在450 ~ 550 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，記錄最大吸光值所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)；滴加NaOH溶液，使其濃度從0.05 mol/L上升到

0.50 mol/L，同上進(jìn)行掃描。將5 mg多糖樣品加入2 mL水溶解，加入2 mL剛果紅試劑，混勻，重復(fù)以上步驟。以NaOH濃度為橫坐標(biāo)，樣品最大吸收波長(zhǎng)為縱坐標(biāo)，作圖。將樣品的曲線與剛果紅曲線進(jìn)行比較。

1.3.6 紅外光譜測(cè)定四種巖藻聚糖組分 將溴化鉀用瑪瑙研缽研磨，過(guò)孔徑0.147 mm網(wǎng)篩，紅外燈下干燥4 h，以溴化鉀壓成半透明薄片做空白，以樣品與溴化鉀混合制成壓片，在4 000 ~ 400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[20]。

1.3.7 馬尾藻巖藻聚糖對(duì)HMVEC存活影響 選擇匯合度80%以上的HMVEC，用胰酶酶解成細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，細(xì)胞密度為30 000 mL-1。培養(yǎng)24 h，加入質(zhì)量濃度為62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0 μg/mL的馬尾藻巖藻聚糖溶液（F、FD1、FS1）、空白對(duì)照組和質(zhì)量濃度為50、500、5 000 μg/mL的肝素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照組，分別培養(yǎng)24、48、72 h，后進(jìn)行MTT檢測(cè)。96孔板內(nèi)加入100 μL完全DMEM培養(yǎng)液和20 μL 5 mg/mL MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，棄去上清夜，加入150 μL DMSO，在室溫下震蕩10 min，最后于570 nm測(cè)值[21]，計(jì)算HMVEC存活率。

存活率=/0×100%，

式中，為實(shí)驗(yàn)組酶標(biāo)儀所測(cè)量的值，0為空白組所測(cè)量的值

1.3.8 氧化型低密度脂蛋白造模濃度與造模時(shí)間的確定 根據(jù)楊為亞[22]的方法并略做修改。培養(yǎng)細(xì)胞至進(jìn)入對(duì)數(shù)期，加入質(zhì)量濃度為6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL的氧化型低密度脂蛋白溶液和空白對(duì)照組，培養(yǎng)12 h，用倒置熒光顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，參照1.3.7 MTT方法測(cè)定值，計(jì)算HMVEC存活率。

1.3.9 馬尾藻巖藻聚糖對(duì)受氧化型低密度脂蛋白損傷的HMVEC增殖影響 細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，棄去上清液。加入由完全培養(yǎng)基配制的500 μg/mL和1 000 μg/mL 的F、FD1、FS1、FS11和500 μg/mL肝素鈉，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h后，加入100 μL的氧化型低密度脂蛋白溶液造模，培養(yǎng)12 h，按照1.3.8 MTT法測(cè)定值，計(jì)算HMVEC存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 FD1洗脫曲線

FD1的洗脫曲線如圖1。由圖1可得，F(xiàn)D1經(jīng)過(guò)Sepharose Cl-6B凝膠柱之后，除極少量的小分子被分離外，大部分組分集中在一個(gè)糖峰，將其命名為FS11。

圖1 FD1 Sepharose Cl-6B洗脫曲線

2.2 化學(xué)組成分析

組分FS11的化學(xué)組成分析結(jié)果見(jiàn)表1。與FD1[16]比較，組分FS11的四項(xiàng)化學(xué)組成指標(biāo)均有所提高，分別上升11.514%、2.377%、0.493%、1.177%。與F、FS1比較，F(xiàn)S11多糖含量分別提高16.341%和1.339%，硫酸基含量也提高18.445%和17.889%。

2.3 單糖組成分析

FS11的單糖組成分析結(jié)果見(jiàn)表2。表2可知，組分FS11含有阿拉伯糖，含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖6種單糖，與F、FD1和FS1結(jié)果一致。但4種組分中各種單糖的含量存在差異。單糖組成成分與含量取決于來(lái)源和提取方法，Lim[23]使用不同的提取方法從不同的海藻中提取的巖藻聚糖單糖組成也不一樣。4個(gè)組分均主要由巖藻糖組成，這是巖藻聚糖的主要特征[24]，其中，組分FS11的巖藻糖含量超過(guò)50%。

表1 FS11化學(xué)組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表2 FS11單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.4 相對(duì)分子質(zhì)量分布

F、FD1、FS1和FS11相對(duì)分子質(zhì)量分布的結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 4種巖藻聚糖相對(duì)分子質(zhì)量洗脫曲線

從圖2中4條洗脫曲線中得出，組分F、FD1、FS1、FS11的洗脫峰值出現(xiàn)的時(shí)間分別為12.40、12.70、12.52、12.62 min，計(jì)算得到對(duì)應(yīng)組分的重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為474 576、459 032、201 285、190 049。分離純化的方法不同，多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布也會(huì)不同[25]。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，組分FD1的相對(duì)分子質(zhì)量分布比F窄，而F和FD1分別經(jīng)過(guò)Sepharose-Cl 6B瓊脂糖凝膠柱層析后得到FS1和FS11的相對(duì)分子質(zhì)量分布更窄，說(shuō)明瓊脂糖凝膠對(duì)不同分子質(zhì)量的物質(zhì)有很好的分離作用。

2.5 糖鏈構(gòu)象分析

組分F、FD1、FS1、FS11糖鏈的構(gòu)象分析結(jié)果如圖3和圖4。

圖3可看出，各組分均在350 nm處有吸收峰，在500 nm處均無(wú)吸收峰，證明了馬尾藻巖藻聚糖的糖鏈構(gòu)象為較為復(fù)雜的支鏈結(jié)構(gòu)，可能含有多個(gè)樹(shù)狀分支；350 nm處的吸收峰峰型不穩(wěn)定，但是隨著不斷地分離純化，峰與峰之間的間隔變大，峰型變得較為清晰，證實(shí)多糖的純度有所提高。

各個(gè)組分的多糖與剛果紅結(jié)合后，最大吸收波長(zhǎng)與剛果紅相比明顯紅移（圖4）。根據(jù)剛果紅可與多股螺旋構(gòu)象的物質(zhì)形成配合物從而導(dǎo)致最大吸收波長(zhǎng)增大的理論依據(jù)，說(shuō)明剛果紅與粗多糖兩者形成了配合物，并在堿性條件下形成亞穩(wěn)區(qū)，表明馬尾藻巖藻聚糖中存在著多股螺旋構(gòu)象[26]。

圖3 4種巖藻糖的I-KI紫外掃描

2.6 紅外光譜分析

組分F、FD1、FS1、FS11巖藻聚糖的紅外光譜圖見(jiàn)圖5。

圖5可知，4個(gè)組分的紅外光譜圖大致相似，在2 904.7 ~ 2 920.2 cm-1處有C—H伸縮振動(dòng)形成的尖銳吸收峰，O—H和C—H形成的吸收峰為多糖類物質(zhì)的特征吸收峰；1 597.0 ~ 1 631.7 cm-1處有C==O伸縮振動(dòng)峰，F(xiàn)D1和FS11在該處形成的振動(dòng)吸收峰較強(qiáng)；在1 228.6 ~ 1 238.3 cm-1處有S==O的伸縮振動(dòng)，S==O為硫酸基的特征基團(tuán)；在960.5 ~ 964.4 cm-1處有吡喃環(huán)末端次甲基產(chǎn)生橫搖振動(dòng)所形成的小吸收峰；在887.2 ~ 904.6 cm-1處有特征吸收峰，證明多糖組分中含有β糖苷鍵；在806.2 ~ 831.3 cm-1處的特征吸收基團(tuán)為α糖苷鍵和C—O—S。

圖4 3種巖藻糖與剛果紅結(jié)合后的最大吸收波長(zhǎng)變化曲線

圖5 4種巖藻聚糖紅外光譜

2.7 氧化型低密度脂蛋白造模條件確定

圖6顯示，在造模12 h時(shí)，相比于空白組，各濃度組的細(xì)胞生長(zhǎng)均受到極顯著抑制（< 0.01），HMVEC存活率從最高濃度組（100.00 μg/mL）至最低濃度組（6.25 μg/mL）依次為17.17%、27.94%、39.88%、49.66%、58.41%。本研究選用質(zhì)量濃度50 μg/mL，作用時(shí)間12 h為造模條件。

2.8 馬尾藻巖藻聚糖對(duì)HMVEC存活率的影響

馬尾藻巖藻聚糖對(duì)HMVEC存活率的影響，結(jié)果如圖7和圖8。

與空白組比較，**表示有極顯著差異，< 0.01。

Compared with the control group, ** indicates a very significant difference,< 0.01.

圖6 不同濃度氧化型低密度脂蛋白對(duì)HMVEC存活率的影響

Fig. 6 Effects of different concentrations of oxidized low-density lipoprotein on HMVEC proliferation rate

圖7-a可知，和空白組相比，24 h時(shí)各濃度組的存活率均在80%以上，即組分F在24 h對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。圖7-b可看出，隨著組分濃度的增大，3個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞存活率呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴效應(yīng)。24 h和48 h低濃度組對(duì)HMVEC的存活率影響不顯著（> 0.05）。圖7-c可以看出，24 h和48 h，F(xiàn)S1對(duì)HMVEC存活率沒(méi)有影響。綜合以上分析，最終選用巖藻聚糖質(zhì)量濃度500 μg/mL和1 000 μg/mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，給藥培養(yǎng)時(shí)間控制在24 h之內(nèi)。

圖8可知，中濃度（500 μg/mL）對(duì)細(xì)胞影響最小，低濃度（50 μg/mL）和高濃度（5 000 μg/mL）在3個(gè)時(shí)間段里均不同程度的制約細(xì)胞增殖。500 μg/mL中濃度組對(duì)細(xì)胞存活率的影響不顯著（＞0.05）。結(jié)合上述馬尾藻巖藻聚糖對(duì)HMVEC增值的影響分析，決定選擇加藥培養(yǎng)時(shí)間24 h，質(zhì)量濃度為500 μg/mL，肝素鈉的濃度確定與廖敏[27]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

與空白組比較，*表示有顯著差異，P < 0.05; **表示有極顯著差異，P < 0.01。

與空白組比較，*表示差異顯著，< 0.05; **表示差異極顯著，< 0.01。

Compared with the control group, *indicates a significant difference,< 0.05, ** indicates a very significant difference,< 0.01.

圖8 不同濃度的肝素鈉對(duì)HMVEC存活率的影響

Fig. 8 Effects of different concentrations of sodium heparin on the survival rate of HMVEC

2.9 馬尾藻巖藻聚糖對(duì)受氧化型低密度脂蛋白損傷的HMVEC增殖影響

馬尾藻巖藻聚糖對(duì)受氧化型低密度脂蛋白損傷的HMVEC增殖的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 馬尾藻巖藻聚糖對(duì)氧化型低密度脂蛋白損傷的HMVEC增殖影響

注：與空白組比較，*表示差異顯著，< 0.05；**表示差異極顯著，< 0.01；與造模組比較，#表示差異顯著，< 0.05；##表示差異極顯著，< 0.01

Note: Compared with the control group, *indicates a significant difference,< 0.05 ** indicates a very significant difference,< 0.01.Compared with the model group,#indicates a significant difference,< 0.05##indicates a very significant difference,< 0.01.

表3可得，與空白組相比，造模組增殖率最小（< 0.01），500 μg/mL FS11對(duì)HMVEC的保護(hù)作用最強(qiáng)（< 0.01），其次是1 000 μg/mLFS1（< 0.05）。與造模組比較，其他組分增殖率均顯著性提高（< 0.01），說(shuō)明馬尾藻巖藻聚糖對(duì)HMVEC有保護(hù)作用。當(dāng)4種組分質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，保護(hù)能力從強(qiáng)到弱依次是FS11、FS1、FD1、F。當(dāng)巖藻聚糖濃度較低時(shí)，其相對(duì)分子質(zhì)量分布會(huì)影響對(duì)HMVEC的保護(hù)作用。Lu等[28]發(fā)現(xiàn)低相對(duì)分子質(zhì)量分布對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于高相對(duì)分子質(zhì)量。Huang等[29]發(fā)現(xiàn)硫酸基含量高的巖藻聚糖比含量低的清除自由基的能力更強(qiáng)。硫酸基和巖藻糖的高含量，可能會(huì)產(chǎn)生高密度負(fù)電荷的特定序列，這會(huì)增強(qiáng)巖藻聚糖的抗凝血和抗血栓形成活性[30]。Ben等[31]研究發(fā)現(xiàn)，巖藻糖殘基的高硫酸化含量賦予該多糖重要抗凝血作用，F(xiàn)S11硫酸基團(tuán)高達(dá)30%，這可能與其對(duì)損傷的HMVEC保護(hù)作用強(qiáng)有關(guān)。與肝素鈉組比較，1 000 μg/mL FD1、500和1 000 μg/mL FS1、500 μg/mLFS11對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組Hep。

3 討論

本研究采用Sepharose Cl-6B瓊脂糖凝膠對(duì)FD1進(jìn)一步純化，得到組分FS11。FS11是一種復(fù)雜的硫酸多糖，包含有阿拉伯糖，含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖，硫酸基團(tuán)和糖醛酸。分離純化后FS11多糖含量高達(dá)80.276%，高于課題組前期提取的巖藻聚糖（F、FD1、FS1）[16]。F、FD1、FS1、FS11的主要差異表現(xiàn)在化學(xué)組成、分子質(zhì)量分布和單糖組成。單糖組成、I-KI和剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，亨氏馬尾藻巖藻聚糖含有6種單糖，具有復(fù)雜的支鏈結(jié)構(gòu)和多股螺旋構(gòu)象。紅外光譜表明，除多糖的特征性官能團(tuán)O—H、C—H外，巖藻聚糖還含有諸如S==O、次甲基等活性官能團(tuán)，主要糖鍵的鍵型為β糖苷鍵和α糖苷鍵。

在正常生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制血栓形成的功能，一旦內(nèi)皮細(xì)胞受損或者被激活，其正常功能出現(xiàn)異常，這是導(dǎo)致血栓形成的首位因素[32]。潘君枝[33]研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酚可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子的分泌，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而抑制血栓形成。氧化型低密度脂蛋白是一種對(duì)人體有害的膽固醇，可以導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[34]，從而激發(fā)血栓的形成。因此，本研究選擇HMVEC作為研究對(duì)象，采用氧化型低密度脂蛋白來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。肝素鈉是傳統(tǒng)的抗凝藥物，它是通過(guò)抑制Xa因子活性，從而抑制凝血和血栓形成[35]，本研究采用它作為陽(yáng)性對(duì)照。本研究發(fā)現(xiàn)F、FD1、FS1、FS11四種巖藻聚糖均對(duì)HMVEC有保護(hù)作用，其中質(zhì)量濃度500 μg/mL的FS11和1 000 μg/mL的FS1保護(hù)作用最強(qiáng)。FS1與FS11的相對(duì)分子質(zhì)量分布相差很小，但FS1的巖藻糖含量高于FS11 ，F(xiàn)S11的硫酸基團(tuán)含量高于FS1。有報(bào)道稱巖藻聚糖的活性可能與巖藻糖和硫酸基團(tuán)的比例相關(guān)[16]，巖藻聚糖的濃度可能也與其保護(hù)作用有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖具有保護(hù)損傷的HMVEC，但其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

F、FD1 、FS1和FS11這4種巖藻聚糖組分中，F(xiàn)S11純度最高，其巖藻糖含量和多糖含量最高。亨氏馬尾藻巖藻聚糖的結(jié)構(gòu)特征為具有多股螺旋構(gòu)象且含有較長(zhǎng)側(cè)鏈和樹(shù)狀分支的復(fù)雜多糖。通過(guò)比較 F、FD1、FS1和FS11的化學(xué)組成、單糖組成、分子量分布、紅外光譜和糖鏈構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖對(duì)損傷的HMVEC保護(hù)作用與其多糖含量、巖藻糖含量、硫酸基含量、單糖組成、相對(duì)分子質(zhì)量有密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果表明巖藻聚糖能夠有效保護(hù)氧化型低密度脂蛋白損傷的HMVEC，且純度最高的組分FS11在濃度為500 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用最強(qiáng)。

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Structural Identification of. Agardh Fucoidan and Its Protective Effect on HMVEC Damage Induced by Oxidized Low Density Lipoprotein

LIN Pei-chun1,2, CHEN Su-hua2,3, WANG Wei-min2, LIU Hai-yun2, HUANG Dan-si2, YANG Zhi-qiang2

（1.，524088，；2.,,524088,; 3.,518108,）

【】To investigate the structure of four fucoidans fromC. Agardhand its protective effect on oxidized low-density lipoprotein-induced HMVEC damage.【】UsingC. Agardh fucoidan (FD1) as raw material, FD1 was subjected to Sepharose Cl-6B agarose gel column chromatography to obtain the component FS11. Chemical composition and monosaccharide analysis of FS11 were performed. Four fucoidans（i.e. F, FD1, FS1，F(xiàn)S11）were implemented by molecular weight determination, sugar chain conformation and infrared spectroscopy. The MTT method was used to determine the effect of three fucoidan treatments of HMVEC on cell viability and to study the protective effect of 4 fucoidans on oxidized low density lipoprotein-induced HMVEC damage. 【】FS11 had the highest sulfate and polysaccharide contents as compared with F, F, FD1. In the monosaccharide composition of FS11, the fucose content is as high as 52.7%. The estimated molecular weight of F, FD1, FS1, and FS11 are 474 576, 459 032, 201 285, and 190 049, respectively. Fucoidans have complex dendritic branches and multiple spiral structures as confirmed by I-KI UV scanning and Congo red experiment. Infrared spectroscopy results show that each component has O—H, C—H polysaccharide characteristic functional groups, S==O active characteristic functional groups. After 24 hours of treatment, the four components (i.e. F, FD1, FS1, FS11) at a concentration of 500 μg/mL and 1 000 μg/mL can significantly reduce the proliferation inhibition of HMVEC damaged by oxidized low-density lipoprotein (< 0.01).【】C. Agardh fucoidan has a protective effect on HMVEC damage induced by oxidized low density lipoprotein.

C. Agardhfucoidan; structure identification; induced damage; HMVEC

TS254.1

A

1673-9159（2020）05-0072-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.009

2020-05-08

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：2018A0303130020）; 國(guó)家級(jí)廣東海洋大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（CXXL2018005）

林沛純（1997－），女，碩士研究生。E-mail：pclin1997@163.com

諶素華（1973－），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品科學(xué)的研究。E-mail：cshh1111@126.com

林沛純，諶素華，王維民，等. 亨氏馬尾藻巖藻聚糖結(jié)構(gòu)鑒定及其對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)HMVEC損傷的保護(hù)作用[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（5）：72-80.

（責(zé)任編輯：劉朏）