林海生，廖 津，章超樺，秦小明，曹文紅，高加龍，羅凱耀

華貴櫛孔扇貝酶法制備-葡萄糖苷酶抑制肽工藝優(yōu)化

林海生1,2,3，廖 津1，章超樺1,2,3，秦小明1,2,3，曹文紅1,2,3，高加龍1,2,3，羅凱耀1

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院//國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江）//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室//廣東省海洋生物制品工程實驗室//水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108；3. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心（大連工業(yè)大學(xué)），遼寧 大連 116034）

【】為了進一步挖掘海洋貝類潛在的降血糖功能。選用華貴櫛孔扇貝閉殼肌為原料，以抑制-葡萄糖苷酶活性為評價指標，采用正交試驗法和響應(yīng)面分析法優(yōu)化-葡萄糖苷酶抑制肽的制備工藝。華貴櫛孔扇貝（）、馬氏珠母貝（）和櫛江珧（）等三種海洋貝類的閉殼肌酶解產(chǎn)物均對-葡萄糖苷酶、-淀粉酶和脂肪酶具有抑制活性；正交試驗和響應(yīng)面綜合分析結(jié)果表明，華貴櫛孔扇貝閉殼肌制備-葡萄糖苷酶抑制肽的最佳工藝：復(fù)合蛋白酶酶添加量5 500 U/g，酶解溫度57 ℃，酶解pH = 7，酶解時間4 h，其酶解液中小肽含量21.64 mg/mL，-葡萄糖苷酶的抑制率達到31.53%。利用響應(yīng)面法可優(yōu)化制備-葡萄糖苷酶抑制肽的工藝。

酶解；生物活性肽；-葡萄糖苷酶抑制率；響應(yīng)面法

糖尿病是危害人類健康的重大疾病之一[1]，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2017年全球糖尿病患者已超4.2億，預(yù)測2045年全球患病人數(shù)將突破6.9億大關(guān)[2]，其中Ⅱ型糖尿病人數(shù)約占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%，其主要發(fā)病機制特征為胰島素抵抗、胰島分泌缺陷[3]。通過抑制-葡萄糖苷酶的活性可以有效地降低餐后高血糖的發(fā)生，在臨床上-葡萄糖苷酶抑制劑是常見的一線藥物，如阿卡波糖和伏格列波糖等。但傳統(tǒng)藥物普遍價格昂貴，往往有副作用，并且容易產(chǎn)生耐藥性，嚴重的還會損傷肝腎[4-5]。因而，尋找新型、副作用少、經(jīng)濟的天然降血糖物質(zhì)成為該領(lǐng)域的研究熱點[6-7]。

生物活性肽具有多種生物學(xué)功能，可以與機體內(nèi)相關(guān)調(diào)節(jié)酶的作用位點相互作用，產(chǎn)生抑制效果，如抑制-葡萄糖苷酶、-淀粉酶、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、抑制二肽基肽酶IV等，從而發(fā)揮其降血糖、降血壓等功能[8-10]。因而，生物活性肽備受科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注[11]。選用食品優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)源和恰當?shù)鞍酌?，結(jié)合可控酶解技術(shù)，能夠制備具有特殊生理活性的肽段。目前已經(jīng)報道的具有降血糖活性的植物蛋白來源的水解肽主要有銀杏多肽[12]、麥胚降血糖肽[13]、花生蛋白肽[14]、大豆/綠豆降血糖肽[15]、玉米降血糖肽[16]、糙米肽[17]等；而動物蛋白來源的水解肽主要有馬鹿茸降血糖肽[3]、蠶蛹蛋白肽等[18]。近年來，隨著水產(chǎn)蛋白高值化利用研究的開展，水產(chǎn)蛋白酶解物被發(fā)現(xiàn)是一種潛在的可用于開發(fā)降血糖功能食品的原料，如條斑紫菜蛋白肽[19]、南極磷蝦酶解物[20]、貝類酶解物[21-23]等。

華貴櫛孔扇貝（），俗稱紅貝、干貝蛤，一種熱帶或亞熱帶暖水性貝類，主產(chǎn)于日本、韓國、中國大陸、臺灣沿海等地。我國主要養(yǎng)殖產(chǎn)地集中在廣東、廣西和海南等地。2019年漁業(yè)統(tǒng)計年鑒公布的數(shù)據(jù)顯示，廣東省扇貝海水養(yǎng)殖產(chǎn)量為113 511 t，而華貴櫛孔扇貝是貝類養(yǎng)殖中的一個重要品種，養(yǎng)殖產(chǎn)量極大。扇貝閉殼肌是主要的可食用部分，目前除了鮮食外，主要用于加工成干貝、即食貝柱、速凍貝柱、扇貝柱罐頭[24]等方便食品，精深加工利用程度較低。目前，尚未報道其在降血糖領(lǐng)域的應(yīng)用。

為了進一步挖掘海洋貝類潛在的降血糖功能，本研究主要選用華貴櫛孔扇貝閉殼肌為原料，以抑制-葡萄糖苷酶活性為主要評價指標，采用正交試驗法和響應(yīng)面分析法進一步優(yōu)化酶解工藝。以期為扇貝資源高值化利用提供新思路，同時也為其在降血糖功能的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

華貴櫛孔扇貝（）、馬氏珠母貝（），采自雷州市流沙灣養(yǎng)殖場；櫛江珧（）購于湛江市東風(fēng)市場。

復(fù)合蛋白酶（62 784 U/g），諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；-葡萄糖苷酶、對硝基苯基---吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl---glucopyranoside，pNPG）、4-硝基苯丁酸酯（p-Nitrophenyl butyrate，pNPB），上海源葉生物科技有限公司；-淀粉酶、脂肪酶，美國Sigma公司；可溶性淀粉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS），廣東光華科技股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris），北京亞米生物科技有限公司；Folin-酚蛋白定量試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UNIVERSAL 320R臺式高速冷凍離心機，德國Hettich科學(xué)儀器公司；VARIOSKAN FLASH全波長掃描式多功能酶標儀，賽默飛世爾科技公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器，上海博訊醫(yī)療儀器股份有限公司；HHS數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-2F pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 貝類酶解液制備 鮮活貝類洗凈開殼，分別取其外套膜和閉殼肌，100 ℃沸水漂燙1~2 min后瀝干，取相同質(zhì)量的貝組織，按照質(zhì)量（g）∶體積（mL）= 1∶3的比例加入蒸餾水，均漿，調(diào)節(jié)pH = 7，按照酶添加量[E/S]為3 000 U/g加入蛋白酶，于50 ℃水浴恒溫振蕩器（100 r/min）中酶解4 h，100 ℃水浴滅酶，8 000 r/min條件下，離心10 min，取上清液，分別得到華貴櫛孔扇貝閉殼肌酶解物（EHCh-am）和外套膜酶解物（EHCh-m）、馬氏珠母貝閉殼肌酶解物（EHPf-am）和外套膜酶解物（EHPf-m）及櫛江珧閉殼肌酶解物（EHAp-am）和外套膜酶解物（EHAp-m），分別測定其對-葡萄糖苷酶、-淀粉酶和脂肪酶的抑制活性。

1.3.2-葡萄糖苷酶抑制率的測定 采用pNPG法測定-葡萄糖苷酶抑制活性，參考Zhang等[25]的方法稍作修改。移取110 μL磷酸鹽緩沖液（PB，0.1 mmol/L；pH = 6.8）于96孔板微孔，分別加入20 μL樣品溶液和20 μL-葡萄糖苷酶溶液（2.5 U/mL），混勻后于37 ℃孵育10 min后，加入20 μL 底物pNPG（1.25 mmol/L），體系于37 ℃反應(yīng)20 min后，加入80 μL碳酸鈉（0.1 mol/L）終止反應(yīng)。采用酶標儀在405 nm處測定其吸光值，實驗設(shè)置樣品組、樣品空白組、對照組、空白組，并按式（1）計算-葡萄糖苷酶抑制率：

抑制率（%）＝1－（樣品－樣品空白）/（對照－空白）， （1）

式中，樣品：樣品組吸光度值，樣品+酶+ pNPG；樣品空白：樣品空白組吸光度值，樣品+ PB + pNPG；對照：對照組吸光度值，PB + 酶+ pNPG；空白：空白組吸光度值，PB + pNPG。

1.3.3-淀粉酶抑制率的測定-淀粉酶的抑制活性采用DNS比色法，參考王斯慧等[26]的方法略作修改。1.5 mL離心管中，加入50 μL樣液和50 μL 淀粉酶溶液（0.1 U/mL），37 ℃水浴20 min，加入100 μL可溶性淀粉（體積分數(shù)為0.5%），37 ℃環(huán)境中反應(yīng)3 min后，90 ℃水浴1 min，加入100 μL DNS保持90 ℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)10 min，冰浴冷卻后加入900 μL蒸餾水，混勻后取200 μL在96孔板檢測其在540 nm處吸光值，實驗設(shè)置樣品組、樣品空白組、對照組、空白組，并根據(jù)式（2）計算-淀粉酶抑制率：

抑制率（%）＝1－（樣品－樣品空白）/（對照－空白）， （2）

式中，樣品：樣品組吸光度值，樣品+ 酶+ 淀粉+ DNS；樣品空白：樣品空白組吸光度值，樣品+ 蒸餾水+ 淀粉+ DNS；對照：對照組吸光度值，蒸餾水+ 酶+ 淀粉+ DNS；空白：空白組吸光度值，蒸餾水+ 淀粉+ DNS。

1.3.4 脂肪酶抑制率的測定 參考王雪等[27]方法稍加改進，分別取樣品溶液50 μL和50 μL脂肪酶溶液（25 U/mL）于96孔板中混勻后，于37 ℃環(huán)境中孵育10 min，再加入1 mg/mL 4-硝基苯丁脂酸溶液，混勻后繼續(xù)反應(yīng)20 min，采用酶標儀在405 nm處測定其吸光度值，實驗設(shè)置樣品組、樣品空白組、對照組、空白組，根據(jù)式（3）計算脂肪酶抑制率：

抑制率（%）＝1－（樣品－樣品空白）/（對照－空白）， （3）

式中，樣品：樣品組吸光度值，樣品+ 酶+ pNPB；樣品空白：樣品空白組吸光度值，樣品+ 蒸餾水+ pNPB；對照：對照組吸光度值，蒸餾水+ 酶+ pNPB；空白：空白組吸光度值，蒸餾水+ pNPB。

1.3.5 單因素試驗及正交試驗 以華貴櫛孔扇貝閉殼肌作為研究對象，參照1.3.1所述酶解方法，分別考察酶解時間（0 ~ 6 h，酶添加量3 000 U/g、溫度50 ℃，pH = 7）、酶解溫度（45 ~ 65 ℃，酶添加量3 000 U/g，pH = 7，酶解時間4 h）、酶解pH值（pH = 6 ~ 8，酶添加量3 000 U/g，55 ℃，酶解時間4 h）和酶添加量（酶添加量2 000 ~ 6 000 U/g，pH = 7，55 ℃，酶解時間4 h）四個因素對酶解液中小肽含量和-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。

基于單因素試驗結(jié)果，實驗采用三水平三因素L9(33)正交試驗，優(yōu)化復(fù)合蛋白酶水解華貴櫛孔扇貝閉殼肌的最佳工藝條件。

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計 結(jié)合單因素和正交試驗結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計軟件的Box-Behnken的實驗設(shè)計方法，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗。以-葡萄糖苷酶抑制率為優(yōu)化指標，確定最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用Design-Expert 8.0.6 響應(yīng)面優(yōu)化軟件進行數(shù)據(jù)優(yōu)化分析[29]。根據(jù)方差結(jié)果進行顯著性分析：> 0.05表示差異性不顯著，< 0.05表示差異性顯著，< 0.01表示差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貝類酶解產(chǎn)物對三種酶的抑制作用

選用合適蛋白酶能夠?qū)⑹称穪碓吹牡鞍踪|(zhì)水解獲得活性肽，不同蛋白酶酶解位點不同，酶解產(chǎn)物活性也具有差異[11]。三種海洋貝類復(fù)合酶酶解物對三種酶的抑制結(jié)果如圖1所示，華貴櫛孔扇貝、馬氏珠母貝和櫛江珧的外套膜和閉殼肌的酶解產(chǎn)物對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶均具有較強的抑制活性?？傮w上看，閉殼肌酶解物的抑制活性高于外套膜酶解物。其中，華貴櫛孔扇貝閉殼肌酶解物（EHCn-am）和櫛江珧閉殼肌酶解物（EHAp-am）對-葡萄糖苷酶的抑制活性比馬氏珠母貝酶解物（EHPf-am）強，而EHCn-am對-淀粉酶（51.07% ± 1.01%）和-葡萄糖苷酶（35.99% ± 1.97%）的抑制活性最強；另外，EHPf-am對脂肪酶表現(xiàn)出較強的抑制作用。

本研究是基于前期的實驗基礎(chǔ)上，采用經(jīng)過加熱前處理后的原料，選用的復(fù)合蛋白酶包含內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶，能從多肽鏈內(nèi)部和末端水解肽鍵，釋放出較多結(jié)構(gòu)特異的肽段[28]。黃欽欽等[19]、胡春芹等[30]采用內(nèi)切與外切蛋白酶的復(fù)合酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、氨肽酶）酶解制備-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽；延?，摰萚23]用復(fù)合蛋白酶酶解扇貝裙邊制備活性肽具有降血糖功能；本研究結(jié)果與其具有一致性，可見，復(fù)合蛋白酶或復(fù)合酶解法適合制備降血糖肽。

使糖耐量恢復(fù)到正常水平是評價降糖藥物療效的一個重要方面，也是治療糖尿病藥物的主要機制之一[31]。-葡萄糖苷酶和-淀粉酶是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，調(diào)控碳水化合物降解為單糖的反應(yīng)[19]。因此，通過抑制腸胃道的-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的活性，延緩人體內(nèi)碳水化合物的吸收，維持餐后血糖降低到正常水平[23-26]。從圖1可以看出，三種貝的酶解產(chǎn)物均對-淀粉酶和-葡萄糖苷酶具有較強的抑制活性，是潛在開發(fā)降血糖功能食品的原料。通過對比發(fā)現(xiàn)，華貴櫛孔扇貝閉殼肌作為酶解原料，經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解得到的酶解液對a-葡萄糖苷酶抑制率效果突出，且對a-淀粉酶抑制率為最高。因此，選擇華貴櫛孔扇貝閉殼肌作為原料制備生物活性肽，并對其工藝進行優(yōu)化。

EHCn-am：扇貝閉殼肌酶解物；EHCn-m：扇貝外套膜酶解物；EHPf-am：珍珠貝閉殼肌酶解物；EHPf-m：珍珠貝外套膜酶解物；EHAp-am：江珧貝閉殼肌酶解物；EHAp-m：江珧貝外套膜酶解物

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解時間對酶解效果的影響 不同酶解時間對-葡萄糖苷酶抑制率和小肽含量如圖2所示。酶解1 h后，酶解液中小肽含量迅速增加，同時酶解物對-葡萄糖苷酶抑制率也顯著提升；隨著酶解時間的增加，酶解液小肽含量和活性均相對增長較為緩慢，酶解3 ~ 4 h，活性不再增加，因而選用4 h進行下一步試驗的酶解時間。

2.2.2 其他因素對酶解效果的影響 由圖3可知，以酶解產(chǎn)物對-葡萄糖苷酶的抑制率作為評價指標，單因素試驗中，最佳酶解pH = 7（圖3A），酶解溫度為55 ℃（圖3B）；而隨著加酶量的增加，酶解液對-葡萄糖苷酶抑制率也隨之增高，但當加酶量達到5 000 U/g時，抑制率隨著加酶量的增加沒有顯著的變化（圖3C）。綜上結(jié)果，采用三水平三因素L9(33)設(shè)計正交實驗（表1）。

圖2 酶解時間對酶解效果的影響

表1 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 正交實驗結(jié)果

正交實驗設(shè)計及方差分析結(jié)果分別如表1和表2所示。由表1的值分析結(jié)果可知，以-葡萄糖苷酶抑制率為指標的因素影響程度為：（加酶量）>（溫度）>（pH），最佳組合為322。根據(jù)表2方差分析結(jié)果，加酶量為顯著性因素，溫度和pH均為非顯著因素。最佳組合322（加酶量為5 000 U/g，溫度為55 ℃，酶解pH = 7）的驗證實驗結(jié)果表明，該條件下酶解物的-葡萄糖苷酶抑制率達到29.51%，優(yōu)于正交試驗中的其他組合。

表2 正交實驗方差分析結(jié)果

注:F(2, 2) = 19.00,F(2, 2) = 99.00; *,< 0.05

2.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果

因在正交實驗中，-葡萄糖苷酶抑制率隨加酶量的增加呈明顯增加，故根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)定各因素水平編碼（表3），根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理[28]，設(shè)置15組試驗，實驗設(shè)計以及結(jié)果見表4。用Design-Expert 8.0.6對表中數(shù)據(jù)進行分析，得到-葡萄糖苷酶抑制率回歸模型方程：= 28.86 + 2.71+ 0.76+ 0.14- 0.42- 0.08- 0.73- 0.792- 0.432- 0.732，方差分析見表5。

表3 響應(yīng)面實驗的因素和水平編碼

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

表5 方差分析

注: *,< 0.05; **,< 0.01

由表5可看出，該模型< 0.05，表明該響應(yīng)面模型是顯著的，能較好擬合本次實驗數(shù)據(jù)，說明試驗誤差小，可以用此模型對活性肽酶解工藝進行分析和預(yù)測。（加酶量）為極顯著性因素，（溫度）、和2均為顯著性因素；而（pH）為非顯著因素，對酶解液的-葡萄糖苷酶抑制活性影響不顯著，三個因素對抑制活性影響的主次順序為：（加酶量）>（溫度）>（pH），與正交試驗一致；交互作用的影響為>>。

圖4 pH和加酶量的交互作用對a-葡萄糖苷酶抑制率影響

圖5 溫度和加酶量的交互作用對a-葡萄糖苷酶抑制率影響

圖6 溫度和pH的交互作用對a-葡萄糖苷酶抑制率影響

兩因素間的交互效應(yīng)分析結(jié)果如圖4、圖5和圖6所示。響應(yīng)曲面圖可以直觀反映出模型中任何兩個因素交互作用對活性肽（-葡萄糖苷酶抑制率）的影響程度，曲線走勢越陡，表明該因素影響越顯著；曲線走勢越平滑，則表明該因素影響較小[28]。由圖4可知，3個響應(yīng)面均為凸型曲面，其中，pH（）和溫度（）響應(yīng)面圖曲面較陡（圖6），說明兩者之間交互作用對-葡萄糖苷酶抑制率的影響顯著。

為了使-葡萄糖苷酶抑制率達到最大，通過軟件分析，得到最佳酶解條件為：加酶量為5 500 U/g，酶解溫度為57.26 ℃和pH = 6.96，-葡萄糖苷酶抑制率達30.85%?？紤]到實際可行性的問題，將最佳酶解條件調(diào)整為加酶量5 500 U/g、酶解溫度57 ℃和pH = 7，在此條件下進行驗證實驗，得到-葡萄糖苷酶抑制率為31.53%，與理論值基本一致。

3 結(jié)論

華貴櫛孔扇貝、馬氏珠母貝和櫛江珧等三種海洋貝類的閉殼肌酶解產(chǎn)物均具有抑制-葡萄糖苷酶、-淀粉酶和脂肪酶的活性；以抑制-葡萄糖苷酶活性為主要評價指標，通過單因素試驗、正交試驗和響應(yīng)面綜合分析，得到華貴櫛孔扇貝閉殼肌制備-葡萄糖苷酶抑制肽的最佳工藝為：復(fù)合蛋白酶加酶量為5 500 U/g，酶解溫度為57 ℃，酶解pH = 7，酶解時間4 h，其酶解液小肽含量為21.64 mg/mL，-葡萄糖苷酶的抑制率達到31.53%。本研究為華貴櫛孔扇貝在降血糖功能的深入研究提供依據(jù)，同時也為資源高值化利用提供新思路。

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Optimization of Enzymatic Preparation of-Glucosidase Inhibitory Peptides from

LIN Hai-sheng1,2,3, LIAO Jin1, ZHANG Chao-hua1,2,3, QIN Xiao-ming1,2,3, CAO Wen-hong1,2,3, GAO Jia-long1,2,3, LUO Kai-yao1

（1.,(),,,,524088,; 2.,518108,; 3.(),116034,）

【】In order to further explore the potential antihyperglycemic substances from marine shellfish. 【】Based on-glucosidase inhibition rate, orthogonal design and response surface analysis method were used for optimization the preparation process of-glucosidase inhibitory peptides from adductor muscle of.【】All three adductor muscle hydrolysates, from,andpossessed inhibitory activity against-glucosidase,-amylase and lipase. The optimum technology conditions for preparation of-glucosidase inhibitory peptides were as follows: enzyme dosage (complex protease) of 5 500 U/g, temperature of 57 ℃, pH = 7, and hydrolysis time of 4 hours. Under this condition, the hydrolysate was with an oligopeptides concentration of 21.64 mg/mL and the-glucosidase inhibition rate was 31.53 %.【】Response surface methodology could be used for optimization the preparation of-glucosidase inhibitory peptides from the adductor muscle of.

enzymatic hydrolysis; bioactive peptide;-glucosidase inhibition rate; response surface methodology

TS254.9

A

1673-9159（2020）05-0097-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.012

2020-03-17

廣東海洋大學(xué)博士啟動項目(R17082)；廣東海洋大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（CXXL2019160）；國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-49）；廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品高值化加工與利用創(chuàng)新團隊項目（GDOU2016030503）；廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強校工程重大科研成果培育計劃（GDOU2017052606）

林海生（1985－），男，博士，講師，研究方向為水產(chǎn)品加工、海洋活性物質(zhì)開發(fā)。E-mail: haishenglin@163.com

林海生，廖津，章超樺，等. 華貴櫛孔扇貝酶法制備α-葡萄糖苷酶抑制肽的工藝優(yōu)化[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（5）：97-104.