張子怡 舒田 薄海，2 張勇

1 天津體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)與健康研究院天津市運(yùn)動(dòng)生理學(xué)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津 310617）

2 武警后勤學(xué)院衛(wèi)生勤務(wù)系（天津 300309）

低氧（hypoxia）在許多生理或病理狀態(tài)下均會(huì)發(fā)生，如高原環(huán)境暴露、阻塞性肺疾病、心臟泵血功能障礙、貧血、外周組織灌注不良等。骨骼肌作為機(jī)體最大的耗氧器官，主要依賴于線粒體氧化磷酸化供能，對低氧較為敏感。研究表明，低氧導(dǎo)致骨骼肌線粒體功能障礙，泛素-蛋白酶途徑及細(xì)胞凋亡通路活化，肌肉質(zhì)量和力量降低，嚴(yán)重影響人體工作能力和生活質(zhì)量[1]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊及修飾的重要細(xì)胞器。內(nèi)外環(huán)境改變會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS 可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），阻止蛋白合成進(jìn)程，促進(jìn)異常折疊蛋白的降解，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)態(tài)[2]。短時(shí)間ERS會(huì)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，而持續(xù)過度的ERS 導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路。衰老、肥胖等病理狀態(tài)均伴隨骨骼肌ERS的異常激活[3]。研究也表明，ERS 參與了心肌、肝臟、腦等組織缺血/缺氧造成的損傷[4]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體在結(jié)構(gòu)上存在連接區(qū)域，在功能上交互調(diào)控，因而線粒體對ERS 十分敏感。ERS 早期，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入線粒體的鈣離子增加，提高三羧酸循環(huán)中檸檬酸脫氫酶等活性，促進(jìn)線粒體呼吸和能量輸出。但持續(xù)性ERS 導(dǎo)致線粒體鈣超載，線粒體趨于分裂，線粒體凋亡通路活化[5]。Mostafa等[6]利用ERS誘導(dǎo)劑衣霉素孵育細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位降低，活性氧（reactive oxygen specises，ROS）產(chǎn)量和細(xì)胞凋亡百分率顯著升高。提示線粒體穩(wěn)態(tài)異常是ERS損傷途徑之一。

我們前期證明，低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)可改善低氧大鼠骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)，包括促進(jìn)線粒體自噬，改善線粒體融合-分裂平衡，提高線粒體DNA 修復(fù)酶活性，增加線粒體復(fù)合體活性，是一種抑制低氧損傷的有效方式[7，8]。研究表明，耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可抑制骨骼肌ERS相關(guān)蛋白表達(dá)[9]。提示調(diào)控ERS可能是運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)健康效應(yīng)的途徑之一。線粒體數(shù)量是決定骨骼肌有氧供能的關(guān)鍵因素，受到線粒體生物合成（mitochondrial biogenesis）的調(diào)控。運(yùn)動(dòng)是否可通過ERS 調(diào)控線粒體生物合成尚不清楚。本研究擬觀察低氧及低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)對骨骼肌ERS的影響，并探討ERS調(diào)控線粒體生物合成的潛在機(jī)制。

1 研究對象與方法

1.1 動(dòng)物分組與造模

選取健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠 30 只，2 月齡，體重203±15 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～25℃，相對濕度45%～65%，人工照明，保持12 h/12 h 明暗環(huán)境切換。大鼠隨機(jī)分為3 組，常氧對照組（NC組）、低氧對照組（HC 組）和低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)組（HT 組），每組10 只。低氧與運(yùn)動(dòng)模型與我們前期工作一致[10]。HC 和HT 組大鼠放置于低氧帳篷（Hypoxic System）內(nèi)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，常壓，氧濃度11.3%（模擬海拔5000 m），持續(xù)低氧暴露6 周。HT 組大鼠于低氧帳篷內(nèi)的小動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練（5°，15 m/min），60 min/次，每日 1 次，6 次/周，第 7 日休息，共 6 周。NC 組大鼠于常氧環(huán)境常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 檢測方法與指標(biāo)

1.2.1 樣品處理

低氧暴露結(jié)束后各組動(dòng)物即刻斷頭處死，冰面分離雙側(cè)股四頭肌。部分股四頭肌置于液氮速凍，后保存于－80℃低溫冰箱，以備熒光定量PCR 和Western blot法檢測使用。剩余部分在冰浴0.9%生理鹽水中剪碎，剔除筋膜和脂肪，用玻璃勻漿器研磨制備股四頭肌勻漿。

1.2.2 骨骼肌蛋白質(zhì)氧化標(biāo)志物羰基化蛋白含量

采用羰基化蛋白含量檢測試劑盒（南京建成生物有限公司），檢測羰基與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)產(chǎn)物。操作嚴(yán)格按照說明書，將股四頭肌勻漿經(jīng)2.5 M 鹽酸處理后，置于工作液中，充分反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)在370 nm 波長檢測吸光度，計(jì)算羰基化蛋白含量，單位為nmol/mg protein。

1.2.3 骨骼肌抗氧化酶谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（gluttaatthhii?one S-transferase ，GGSSTT）活性檢測

采用谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），檢測谷胱甘肽與2，4-二硝基氯苯反應(yīng)產(chǎn)物，反映GST 催化能力。操作嚴(yán)格按照說明書，將股四頭肌勻漿置于工作液中，充分反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)在340 nm 波長檢測吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GST活性，單位為U/mg protein。

1.2.4 MicrooRRNNAA--220088b（mmiiRR--220088b）表達(dá)檢測

用Trizol Reagent試劑盒（Invitrogen）抽提股四頭肌總 RNA，總 RNA 定性定量后，參照 TaqMan miRNA 檢測試劑盒（ThermoFisher）說明書操作，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和TaqMan 探針標(biāo)記的實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)。miR-208b 和內(nèi)參基因U6 引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成。miR-208b：上游 5′-ACA CTC CAG CTG GGA TAA GAC GAA CA-3′；下游：5′-TGG TGT CGT GGA GTC G-3′。U6：上游 5′-CTCGCTTCGGCAGCA?CA-3′；下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。獲得 miR-208b 和 U6 的 Ct 值后，計(jì)算 miR-208b 對 U6 的相對表達(dá)量，即2^ [（Ct（miR-208b）－Ct（U6）]。

1.2.5 骨骼肌相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測

Western-blot 法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào) 節(jié) 蛋 白 78（78- kDa glucose- regulated protein，GRP78）、蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase ，PERK）總蛋白及其磷酸化水平（p- PERK）、真核起始因子2α（eukaryot?ic initiation factor 2α，eIF2α）總蛋白及其磷酸化水平（p-eIF2α）、線粒體生物合成相關(guān)蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子- 1α（peroxisome prolifera?tor-activated receptor gamma coactivator 1α， PGC-1α）和細(xì)胞色素 c 氧化酶 IV 亞型（cytochrome C oxi?dase subunits IV，COXIV）蛋白表達(dá)量。，以β-tubulin作為內(nèi)參蛋白。SDS-PAGE 電泳分離樣品蛋白，對應(yīng)一抗孵育標(biāo)記，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗結(jié)合對應(yīng)一抗，ECL發(fā)光顯色液顯影，X射線膠片記錄，掃描各蛋白印跡灰度值。NC 組條帶灰度值定義為100%，HC 組和HT組灰度值表示為與NC組比較的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析比較各組數(shù)據(jù)差異性。

2 結(jié)果

2.1 低氧及低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)對股四頭肌蛋白質(zhì)氧化和抗氧化酶GGSSTT活性的影響

與NC 組比較，HC 組股四頭肌羰基化蛋白含量顯著升高（P＜0.01），GST 活性顯著降低（P＜0.05）；HT 組羰基化蛋白含量和GST 活性均顯著升高（P＜0.05）。HT組與HC 組比較，股四頭肌羰基化蛋白含量顯著降低（P＜0.01），GST活性顯著升高（P＜0.01）（表1）。

表1 大鼠股四頭肌羰基化蛋白含量和GST活性

2.2 低氧及低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)對股四頭肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與 NC 組比較，HC 組股四頭肌 GRP78、p-PERK/PERK 和 p-eIF2α/eIF2α 顯 著 升 高（P＜0.01）；HT 組GRP78 顯著 降低（P＜0.05）。HT 組 與 HC 組 比 較 ，GRP78、p-PERK/PERK 和p-eIF2α/eIF2α顯著降低（P＜0.01）（圖1）。

2.3 低氧及低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)對股四頭肌mmiiRR--220088b 及線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與NC 組比較，HC 組股四頭肌miR-208b、PGC-1α和 COXIV 顯著降低（P＜0.05～0.01），HT 組miR-208b 和PGC-1α顯著升高（P＜0.05～0.01）。HT 組與 HC 組比較，miR-208b、PGC-1α和 COXIV 顯著升高（P＜0.01）（圖2）。

圖1 各組大鼠股四頭肌GRP78、p-PERK/PERK 和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達(dá)變化

圖2 各組大鼠股四頭肌miR-208b、PGC-1α和COXIV表達(dá)變化

3 討論

氧化應(yīng)激是低氧損傷的重要病理機(jī)制。低氧時(shí)線粒體是ROS 產(chǎn)生的主要場所，電子傳遞鏈末端作為電子受體的氧減少，導(dǎo)致電子漏增加，氧自由基產(chǎn)生增多[11]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，低氧導(dǎo)致線粒體DNA 突變，后者編碼的復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ部分亞基表達(dá)異常，導(dǎo)致線粒體ROS 產(chǎn)生增加[10]。此外，低氧還可活化黃嘌呤氧化酶、環(huán)氧合酶等ROS 的重要來源[11]。本研究中，6 周低氧暴露顯著增加骨骼肌蛋白質(zhì)羰基化水平，而低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)部分抑制了蛋白質(zhì)氧化。

適宜水平的ROS 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊、成熟的必要條件，參與調(diào)控二硫鍵形成、糖基化修飾等；而過量ROS 則引起氧化蛋白質(zhì)增多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理氧化蛋白質(zhì)主要依賴于谷胱甘肽的抗氧化功能，同時(shí)還原型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽[12]。因此，我們檢測了GST活性。GST是定位于細(xì)胞質(zhì)的Ⅱ相代謝酶，可促進(jìn)谷胱甘肽形成更多反應(yīng)性巰基，以催化其與親電子/親脂底物的軛合反應(yīng)，發(fā)揮其抗氧化效應(yīng)[13]。研究表明，GST抑制劑依他尼酸明顯降低細(xì)胞低氧耐受性，表現(xiàn)為線粒體膜電位降低，細(xì)胞凋亡百分率顯著高于單純低氧組[3]。本研究中，低氧導(dǎo)致GST 活性降低，低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)將GST 活性提升甚至高于正常組水平。提示，低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)可通過上調(diào)GST降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化蛋白質(zhì)含量。

氧化應(yīng)激是ERS 誘導(dǎo)因素之一，其造成的錯(cuò)誤折疊蛋白激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR。GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性分子伴侶蛋白。低氧、高糖等應(yīng)激狀態(tài)下GRP78 表達(dá)迅速上調(diào)，協(xié)助蛋白折疊及降解錯(cuò)誤折疊蛋白，因而被作為ERS 激活標(biāo)志蛋白[14]。GRP78 敲除小鼠結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后，心肌梗死面積顯著高于野生型小鼠，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)氧化損傷蛋白積聚明顯[15]。本研究中低氧顯著上調(diào)GRP78 蛋白水平。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在三種未折疊蛋白感應(yīng)蛋白，包括蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶PERK，肌醇需要酶1α（inositol-requiring enzyme 1 alpha，IRE1α）和活 化 轉(zhuǎn)錄 因 子 6（activating transcription factor6，ATF6）。生理狀態(tài)下GRP78 與這三個(gè)蛋白結(jié)合并保持其處于失活狀態(tài)。ERS發(fā)生時(shí)，PERK與GRP78發(fā)生解離并自身聚合磷酸化，進(jìn)而催化底物eIF2α蛋白磷酸化。后者抑制蛋白翻譯，同時(shí)促進(jìn)GRP78 等維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的蛋白表達(dá)[16]。本研究中，低氧顯著上調(diào)PERK 和eIF2α磷酸化水平。以上提示，6 周低氧暴露激活了骨骼肌ERS 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR。研究表明，一次性力竭運(yùn)動(dòng)[9]和一次性下坡跑[17]均可顯著提高小鼠ERS標(biāo)志蛋白的表達(dá)。但4 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后再給予小鼠一次性力竭運(yùn)動(dòng)刺激，ERS 激活幅度明顯下降[9]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)可抑制低氧對骨骼肌ERS 的活化。

線粒體是低氧損傷的主要受累細(xì)胞器，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)低氧導(dǎo)致骨骼肌線粒體質(zhì)量控制體系異常，空間結(jié)構(gòu)趨于分裂，能量轉(zhuǎn)換效率降低[18]。本研究中低氧導(dǎo)致線粒體數(shù)量標(biāo)志蛋白COX Ⅳ及線粒體生物合成主控因子PGC-1α表達(dá)降低。低氧導(dǎo)致的線粒體生物合成異?？赡芘cERS 持續(xù)活化相關(guān)。Cui 等[19]證明，ERS 導(dǎo)致鈣離子大量進(jìn)入線粒體，增加ROS 產(chǎn)量并磷酸化線粒體分裂蛋白Drp1 絲氨酸616 位點(diǎn)，導(dǎo)致線粒體趨于分裂，線粒體自噬增加，可能是線粒體數(shù)量降低的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，ERS 導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)錄因子、COXⅡ、ATP合成酶亞基等核DNA 編碼線粒體蛋白以未成熟形式積累在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中[20]。Chen 等[21]發(fā)現(xiàn)ERS誘導(dǎo)CHOP蛋白表達(dá)升高，后者負(fù)性抑制轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與PGC-1α啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制PGC-1α表達(dá)。我們推測，本研究中運(yùn)動(dòng)上調(diào)PGC-1α及線粒體生物合成，可能與運(yùn)動(dòng)抑制ERS活化相關(guān)。

MicroRNA 是一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，通過和靶基因轉(zhuǎn)錄后mRNA 的3’UTR 區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA 降解或抑制其翻譯，發(fā)揮負(fù)調(diào)控效應(yīng)。miR-208b在骨骼肌和心肌中均有表達(dá)。Liu等[22]報(bào)道，miR-208b通過靶向抑制與AMPK 相互作用的Fnip1蛋白，從而活化AMPK/PGC-1α信號(hào)通路，促進(jìn)線粒體生物合成及氧化代謝功能，同時(shí)參與調(diào)控Ⅱ型肌纖維向Ⅰ型的轉(zhuǎn)化。在過氧化氫孵育成肌細(xì)胞誘導(dǎo)ERS 模型中，miR-208b 表達(dá)水平顯著降低[23]。ERS 誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR 是一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞核傳遞信號(hào)的過程。本研究中，低氧骨骼肌miR-208b 表達(dá)豐度降低。我們推測，低氧誘導(dǎo)的ERS可能通過下調(diào)miR-208b抑制PGC-1α表達(dá)。Mooren 等[24]報(bào)道，有氧耐力訓(xùn)練可上調(diào)青年男性血漿miR-208b 含量。本研究也發(fā)現(xiàn)，低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)可顯著上調(diào)miR-208b。這與運(yùn)動(dòng)抑制ERS 和上調(diào)PGC-1α的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，慢性低氧暴露導(dǎo)致氧化蛋白質(zhì)積累，激活GRP78/PERK/eIF2α介導(dǎo)的ERS，進(jìn)而通過抑制miR-208b 下調(diào)PGC-1α及其下游線粒體生物合成。低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)通過上調(diào)抗氧化酶抑制ERS，進(jìn)而通過miR-208b-PGC-1α通路上調(diào)骨骼肌線粒體生物合成，提高低氧耐受性。