王林佳 于晶晶 張纓

1 北京體育大學運動人體科學學院（北京 100084）

2 北京體育大學中國運動與健康學院（北京 100084）

核因子E2 相關因子2 （nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一種廣泛存在于哺乳動物細胞內(nèi)的轉錄因子[1]，正常生理條件下，Nrf2 是與細胞質(zhì)中的 Kelch 樣 ECH 相關蛋白 1（Kelch-like ECH-as?sociated protein 1，Keap1）蛋白相互結合的。被結合的Nrf2 無法從細胞質(zhì)移位進入細胞核，阻止了Nrf2 在核內(nèi)識別并結合靶基因中特異的DNA 啟動子序列－－抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE），從而抑制了Nrf2 對下游的過氧化氫酶（（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）-1 等一系列抗氧化酶基因轉錄的啟動[2-4]（圖1）。Nrf2-ARE 所調(diào)控的抗氧化信號轉導通路被認為是細胞抗氧化防御系統(tǒng)的核心部分[5]。然而，近些年來越來越多的證據(jù)表明Nrf2-ARE還對線粒體生物發(fā)生及呼吸功能相關基因的表達發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[6-8]。

圖1 Nrf2-ARE轉錄調(diào)控作用[2-4]

研究發(fā)現(xiàn)，通過對比衰老的（20～24 月齡）Nrf2 敲除（KO）與野生型（WT）鼠發(fā)現(xiàn)，老年Nrf2 KO鼠的運動能力和肌肉質(zhì)量下降，骨骼肌線粒體形態(tài)受損，線粒體含量（線粒體DNA 拷貝數(shù)）減少，以及調(diào)節(jié)線粒體功能的相關蛋白——核呼吸因子1（NRF1）、線粒體轉錄因子（mTFA）、過氧化物酶體增值物激活受體γ共激活因子（PGC-1α）、線粒體融合蛋白1（Mfn1）、線粒體動力相關蛋白1（Drp1）等的表達水平降低[9]。以上結果表明，Nrf2對線粒體數(shù)量、結構和功能均具有一定的調(diào)節(jié)作用。

1 運動對Nrf2表達和Nrf2-ARE結合活性的影響

運動影響Nrf2表達或活性已在許多研究中得到證實。Horie 等對C2C12 細胞采用電脈沖刺激（EPS）以模擬急性運動，結果表明EPS 可誘導C2C12 細胞中Nrf2蛋白表達增加，且增加幅度與刺激強度和持續(xù)時間有關[10]。Muthusamy 等研究發(fā)現(xiàn)，急性運動（60min/天，共2 天）導致WT 鼠心肌組織中Nrf2 核積累和Nrf2-ARE結合活性顯著增加，而在Nrf2 KO 鼠中未觀察到這些變化[11]。在人體試驗中，受試者進行持續(xù)90 分鐘的急性運動后，股外側肌中Nrf2 mRNA 表達顯著增加[12]。雄性 ICR/CD-1 小鼠經(jīng)過不同時間（45、90、120 或 150 min）的運動后，小鼠腓腸肌和股四頭肌中Nrf2 表達及下游抗氧化酶SOD、GSH（glutathione）表達增加[13]。此外，長期運動訓練對Nrf2 也有一定的影響。有研究報道，8 周有氧運動后，WT 鼠骨骼肌中 Nrf2 mRNA 表達顯著增加，但Nrf2 蛋白表達未出現(xiàn)顯著變化[14]。另有文獻表明，6 周跑臺訓練后WT 鼠骨骼肌Nrf2 轉錄活性提高，細胞色素C氧化酶（cytochromec oxidase，COX）活性增加可達到20%，但這種運動訓練產(chǎn)生的積極適應在Nrf2 KO鼠的骨骼肌中并未出現(xiàn)[15]。以上表明，急性運動或長期運動訓練均可能影響Nrf2 表達和/或Nrf2-ARE結合活性。

2 運動激活Nrf2調(diào)控骨骼肌線粒體

目前，Nrf2 對線粒體內(nèi)結構和功能的調(diào)節(jié)已經(jīng)得到證實，而運動在此過程中發(fā)揮的作用也越來越多地引起人們的關注。運動激活Nrf2可能通過促進線粒體生物發(fā)生、改善線粒體呼吸功能和調(diào)節(jié)線粒體自噬等多個方面對骨骼肌線粒體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

2.1 運動激活NNrrff2促進骨骼肌線粒體生物發(fā)生

線粒體生物發(fā)生是線粒體自我更新和損傷修復的機制之一，與線粒體功能及能量代謝密切相關。骨骼肌收縮[16]、低溫刺激[17]、熱量限制[18]等應激因素均能影響線粒體生物發(fā)生。

線粒體生物發(fā)生和功能運作是由一組相關的核轉錄因子和調(diào)控因子網(wǎng)所控制。核呼吸因子（nuclear re?spiratory factors，NRFs）包括 NRF1 和 NRF2，是一類由核基因編碼的能調(diào)控線粒體呼吸鏈亞基表達的轉錄因子。研究發(fā)現(xiàn)在NRF1 啟動子中包含多個AREs，Nrf2可與之結合并促進NRF1 的表達[19]。進而，NRFs 在調(diào)控核基因和線粒體基因編碼的呼吸鏈亞基表達中發(fā)揮直接或間接的作用[20]。例如，線粒體復合體Ⅱ（Com?plex Ⅱ）中的琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH），由 SDHa、SDHb、SDHc、SDHd 構成。其中在SDHa 和SDHd 基因的啟動子上發(fā)現(xiàn)有NRF1 的結合位點[21]。COX 是線粒體電子傳遞鏈的末端組分。由13個亞基組成，在10個核編碼的COX亞基的DNA啟動子上都有NRF1 的功能性結合位點[22]。NRF1 也可以通過結合靶基因mTFA 的啟動子，介導mTFA 調(diào)節(jié)線粒體DNA（mtDNA）的轉錄與復制。研究證實，人類mTFA 基因的啟動子活性高度依賴于NRF1 和NRF2 的識別和結合位點，并且NRF1與mTFA啟動子結合起決定作用[23]。

PGC-1α是轉錄共激活因子，可與轉錄因子協(xié)同作用以增加對其靶基因轉錄[24;20;25;26]。PGC-1α的表達水平直接影響骨骼肌線粒體增值效率[27]。研究表明，PGC-1α過表達小鼠與WT 鼠相比，骨骼肌內(nèi)mTFA 蛋白表達顯著性增加[28]。PGC-1α通過與NRF1 轉錄因子結合，增加對靶基因mTFA 的轉錄活性，提高mTFA 的mRNA水平[29]。已有細胞和動物實驗表明，采用Nrf2激活劑SFN 孵育人成纖維細胞可導致PGC-1α 和1β mRNA 表達 增 加[30]，也可 導 致 Keap1-knockdown 小 鼠（Nrf2活性高）肝臟PGC-1α mRNA 表達顯著升高[31]，表明Nrf2 激活可促進PGC-1α表達（圖2）。但目前仍缺乏采用Nrf2 敲除小鼠驗證Nrf2 可影響骨骼肌中PGC-1α表達的直接證據(jù)。

線粒體的含量和密度是評價線粒體生物發(fā)生的重要指標[32]。與WT鼠相比，Nrf2KO小鼠肝臟線粒體含量較低，若24 小時禁食可進一步降低這一水平。而Ke?ap1-knockdown 小鼠，雖然與WT 鼠相比其肝臟線粒體含量沒有顯著差異，但24 小時禁食并不影響其線粒體含量[33]。Nrf2 激活劑SFN 提高人成纖維細胞中線粒體含量[30]，也可提高3T3-L1脂肪細胞線粒體的含量，促進線粒體生物發(fā)生[34]。

有氧運動訓練造成骨骼肌適應的主要表征之一是線粒體含量和密度增加[35]。已有文獻報道，7 周的有氧訓練可顯著增加人體骨骼肌線粒體體積和密度[36]，8 周有氧運動后，大鼠腓腸肌 mtDNA（Atp6）/核 DNA（Tert）比值顯著增加[37]。通過Nrf2KO 和WT 小鼠進行一次力竭性運動發(fā)現(xiàn)，WT 鼠骨骼肌Nrf2 的mRNA 和蛋白、以及線粒體生物發(fā)生標志物——NRF1和mTFA 的mRNA表達顯著性增加；而Nrf2 KO 鼠由于Nrf2 的缺失，阻止了運動誘導的骨骼肌NRF1 和mTFA mRNA 表達增強[38]。另外，采用 3 月齡 WT 和 Nrf2 KO 鼠進行 6 周跑臺運動，也發(fā)現(xiàn)此運動訓練可激活WT鼠骨骼肌Nrf2轉錄活性，增加線粒體ComplexⅠ和mTFA 蛋白表達，而同齡的Nrf2 KO 鼠骨骼肌并未出現(xiàn)這些變化[15]。以上表明Nrf2可能在有氧運動促進骨骼肌線粒體的生物發(fā)生和增加線粒體含量的過程中發(fā)揮著重要的作用（圖2）。

圖2 有氧運動介導Nrf2促進骨骼肌線粒體生物發(fā)生

2.2 運動激活NNrrff2改善骨骼肌線粒體呼吸功能

線粒體呼吸作用是供能物質(zhì)在線粒體內(nèi)經(jīng)過一系列的氧化分解（主要包括三羧酸循環(huán)及氧化磷酸化），最終生成二氧化碳和水，并產(chǎn)生ATP 的過程。線粒體膜電位是線粒體進行呼吸作用的基礎[39;40]。

Nrf2 影響線粒體呼吸、氧化磷酸化效率和膜電位[7]。采用不同的細胞實驗發(fā)現(xiàn)：在人結腸癌細胞中通過shRNA 沉默Nrf2 后，ATP 水平和耗氧量顯著低于未沉默組[8]。正常神經(jīng)元細胞中加入寡霉素（氧化磷酸化抑制劑）導致ATP 水平顯著下降，但加入碘乙酸（糖酵解抑制劑）卻沒有這樣的效果。而在沉默Nrf2 的神經(jīng)元細胞中，加入寡霉素并未造成ATP 水平下降，加入碘乙酸則ATP 水平降低。這表明正常神經(jīng)元細胞中ATP 主要依賴于氧化磷酸化產(chǎn)生，而糖酵解和非氧化磷酸化是Nrf2 缺乏的神經(jīng)元細胞產(chǎn)生ATP 的主要通路[7]。另外，采用測定新鮮活體線粒體在ADP 存在（Ⅲ態(tài)呼吸）與否（Ⅳ態(tài)呼吸）的情況下溶解氧的消耗差異，即呼吸控制率（RCR），以評價線粒體結構和功能完整性以及氧化磷酸化效率，結果顯示Nrf2 缺失小鼠腦和肝臟中線粒體RCR降低[7]。

運動訓練提高運動能力可能與運動激活Nrf2提高骨骼肌線粒體呼吸和氧化磷酸化效率有關。已有研究報道注射6-羥基多巴胺（6-OHDA）可造成C57BL/6 小鼠偏側震顫麻痹。偏側震顫麻痹小鼠骨骼肌Nrf2 表達、ComplexⅠ和檸檬酸合成酶（CS）活性下降，而6 周跑臺運動可顯著激活骨骼肌Nrf2，改善線粒體呼吸功能，并提高偏側震顫麻痹鼠的運動能力[41]。另有研究發(fā)現(xiàn)，10 周齡大鼠采用70%VO2max 強度運動訓練14周后，其骨骼肌Nrf2、ComplexⅣ和COXⅣ蛋白表達以及CS 活性均出現(xiàn)顯著性增加[35]。進一步通過Nrf2 KO鼠和WT 小鼠研究發(fā)現(xiàn)，5 周運動訓練顯著提高WT 鼠骨骼肌CS 活性及運動能力，Nrf2 KO 鼠與WT 鼠相比，運動能力和全身能量消耗降低[38]。

2.3 運動激活NNrrff2可能調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體自噬

線粒體自噬是指細胞通過自噬的機制選擇性地清除功能失調(diào)或衰老的線粒體的過程[42]，對整個線粒體功能完整性和細胞生存至關重要[43]。

Nrf2 可能通過調(diào)節(jié)線粒體自噬而在線粒體質(zhì)量控制中起重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，誘導線粒體自噬的一個小分子化合物－－P62 介導的線粒體自噬誘導物（P62-mediated mitophagy inducer，PMI），是最初被用作Nrf2 的激活劑，它可解離Nrf2 與Keap1 的相互作用。在正常細胞中加入PMI 后，可定位觀察到線粒體中自噬體標志物－－微管結合蛋白輕鏈3（microtu?bule associated protein 1 light chain 3，LC3）增加，Nrf2沉默細胞中則未觀察到此變化[44]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在感染金黃色葡萄球菌造成的小鼠敗血癥模型中，感染24 小時后小鼠肺組織線粒體LC3-Ⅱ蛋白表達顯著增加，而Nrf2 KO 鼠沒有出現(xiàn)LC3-Ⅱ表達的變化[45]。對高脂飼養(yǎng)24周的Nrf2 KO小鼠肝臟切片的超微結構分析顯示，其線粒體存在腫脹，并伴隨著嵴排列減少和膜破壞；但WT 鼠未出現(xiàn)這些變化[46]。以上結果表明Nrf2 對線粒體自噬具有調(diào)節(jié)作用。運動可促進骨骼肌Nrf2表達及其轉錄活性[47]，因此我們推測運動激活Nrf2可進一步調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體自噬，盡管目前尚缺乏進一步證據(jù)。

3 小結

運動與骨骼肌線粒體的結構和功能密切相關，Nrf2 在骨骼肌線粒體生物發(fā)生、線粒體呼吸作用及線粒體自噬等方面發(fā)揮著重要作用。運動可能通過促進骨骼肌Nrf2表達和轉錄活性、提高線粒體數(shù)量、增加線粒體功能、維持線粒體穩(wěn)態(tài)，從而對運動能力的增強具有積極作用。長期適當?shù)捏w育鍛煉可激活骨骼肌內(nèi)一系列的信號通路，提高其代謝適應。作為信號通路之一，Nrf2-ARE 對骨骼肌線粒體結構和功能調(diào)控的分子機制仍有待于進一步深入研究。