劉曉莉 趙剛 王弘 王宗兵 張丹昱

北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動學(xué)院（北京100875）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種以進(jìn)行性運(yùn)動功能障礙為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性缺失、紋狀體多巴胺（dopamine，DA）水平顯著減少，誘發(fā)基底神經(jīng)節(jié)直接與間接通路功能紊亂是導(dǎo)致PD 運(yùn)動障礙發(fā)生的主要原因[2]。體力活動或身體運(yùn)動能夠改善PD 患者的自主活動能力，提高DA 藥物的療效，延緩PD 的病理進(jìn)程[3]，其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制備受關(guān)注。近年來，本實驗室利用PD 動物模型證實，跑臺運(yùn)動通過調(diào)節(jié)基底神經(jīng)節(jié)功能失衡改善了PD 大鼠的行為功能障礙[18]，但其作用的分子靶點尚不明確。腺苷（adenosine，A）作為一種神經(jīng)調(diào)質(zhì)參與多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放或突觸后神經(jīng)元電活動的調(diào)節(jié)。腺苷2A 型受體（adenosine A2Arecep?tor，A2AR）和多巴胺Ⅱ型受體（dopamine D2receptor，D2DR）共存于紋狀體中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs）突觸后膜，通過變構(gòu)與配體結(jié)合或與其它受體相互作用形成多聚體聚合物，調(diào)節(jié)突觸后神經(jīng)元的功能。A2AR 拮抗D2DR 表達(dá)是導(dǎo)致間接通路過度激活的重要原因，這與PD 狀態(tài)下運(yùn)動障礙發(fā)生密切相關(guān)[4]。運(yùn)動可能通過抑制A2AR 或激活D2DR 糾正PD 狀態(tài)下紋狀體-蒼白球通路γ-氨基丁酸（γ-amino butyr?ic acid，GABA）神經(jīng)元的過度激活，抑制間接通路過度興奮，緩解基底神經(jīng)節(jié)直接與間接通路的失衡，從而達(dá)到改善病人行為功能障礙的治療效果[5]，但目前尚缺失直接的實驗證據(jù)。為此，本研究從A2AR、D2DR 入手，進(jìn)一步揭示跑臺運(yùn)動干預(yù)改善PD 大鼠行為障礙的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，為運(yùn)動康復(fù)在PD 臨床治療中的推廣與應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

實驗選取雄性清潔級SD 大鼠，6 周齡，體重230～250 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[生產(chǎn)許可號：SCXK（京）2009-0007]。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，自然光照，動物房室內(nèi)溫度控制在20℃～25℃，相對濕度為 45%～50%。大鼠進(jìn)入實驗室后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天，期間進(jìn)行為期3 天的跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練，剔除無法完成預(yù)設(shè)跑臺訓(xùn)練的大鼠。被選取的所有實驗大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)組（Control組）、假手術(shù)運(yùn)動組（Control+Ex 組）、帕金森模型組（PD 組）和帕金森模型運(yùn)動組（PD+ Ex 組）；模型組（PD 組和PD+ Ex 組）造模術(shù)后根據(jù)第7天旋轉(zhuǎn)行為結(jié)果剔除不符合PD模型標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，各組大鼠樣本量為：Control 組22 只，Control+Ex 組 22 只，PD 組 38 只，PD+ Ex 組 38 只。4 組大鼠分別進(jìn)行酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）染色（n=6）、A2AR 及D2DR mRNA 表達(dá)（n=8）和蛋白表達(dá)檢測（n=8）。PD 組和 PD+Ex 組大鼠還分別進(jìn)行 D2DR 激動劑QUIN 和A2AR 拮抗劑SCH+QUIN 聯(lián)合藥物干預(yù)實驗（QUIN 組、SCH+QUIN 組、Ex+QUIN 組、Ex+SCH+QUIN，每組均n=8）。

1.2 PPDD大鼠模型制備與評價

1.2.1 PPDD大鼠模型的制備

采用向右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束（medial forebrain bun?dle，MFB）單側(cè)注射 6 羥基多巴胺（6-Hydroxydopa?mine，6-OHDA）的方法制備PD模型。大鼠造模前禁食24 h，10%水合氯醛（0.35 mL/kg）腹腔注射麻醉。剪去頭頂毛發(fā)，皮膚消毒后沿正中線切開約1 cm 開口，剝離骨膜，充分暴露前、后囟。PD 和PD+Ex 組大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀，參照Paxinos 與Watson 大鼠腦立體定位圖譜[6]，定位右側(cè)MFB（AP：－4.3 mm；R：1.5 mm；V：7.6 mm），顱骨鉆垂直鉆透顱骨，微量注射器吸取4 μL 6-OHDA 溶液，緩慢進(jìn)針后以1 μL/min 速度注射，注射完后留針5 min，以1 mm/min 速度緩慢退針，縫合傷口并涂抹青霉素防止感染。Control 組與Control+Ex 組大鼠采用同樣方法注射同等劑量含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。術(shù)后注意禁食與保暖，待動物清醒后放回籠中飼養(yǎng)。

1.2.2 PPDD大鼠模型的評價

阿撲嗎啡（apomorphine，APO）誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為實驗：在造模手術(shù)后第7、14、28 天，按照 0.5 mg/kg 劑量于頸背部皮下注射非特異性DA受體激動劑APO溶液，誘發(fā)大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，計數(shù)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。根據(jù)第7 天旋轉(zhuǎn)行為結(jié)果，以向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與損毀側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)差值＞100 r/30 min作為判定PD造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[6]，剔除不符合標(biāo)準(zhǔn)的模型組大鼠。

酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)檢測：全部實驗結(jié)束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，經(jīng)左心室-升主動脈插管灌流（30 mL生理鹽水和30 mL 4%多聚甲醛溶液），灌流結(jié)束后迅速取出腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。將腦組織取出后置于30%蔗糖溶液中脫水后修塊、包埋、修整，并連續(xù)冠狀切片（片厚10 μm），每只6張。免疫組織化學(xué)染色、脫水、透明、封片，所用一抗：兔多克隆抗體（1∶1000，Abcam 公司，美國），二抗：過氧化物標(biāo)記的抗兔IgG（H + L）抗體（1∶200，KPL 公司，美國）；利用熒光顯微鏡（DP72，奧林巴斯公司，美國）對黑質(zhì)致密部區(qū)域拍照，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxy?lase，TH）免疫陽性纖維光密度（optical density，OD）進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 跑臺訓(xùn)練方案

造模手術(shù)后24 h，參照Tajiri 等[7]運(yùn)動方案（11 m/min ，30 min/day，5 day/week）對 Control+Ex 組和 PD+Ex 組大鼠進(jìn)行4 周跑臺運(yùn)動干預(yù)，并根據(jù)第7 天APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為測試結(jié)果，剔除不符合PD 模型標(biāo)準(zhǔn)的PD+Ex 組大鼠。訓(xùn)練期間將Control 組與PD 組大鼠置于跑臺旁側(cè)，排除設(shè)備和環(huán)境對大鼠的干擾。

1.4 主要實驗儀器

MF-5362 型顱骨鉆（Silite Corporation，加拿大），68002 型標(biāo)準(zhǔn)型雙臂腦立體定位儀（瑞沃德，深圳），微量注射器（Hamilton，瑞士），DSPT-202 型動物跑臺（段氏，杭州），Detect 凝膠成像系統(tǒng)（百泰克生物，北京），CFX96 Real-Time PCR 儀（Bio-Rad，美國），Rota-Count-8 旋轉(zhuǎn)計數(shù)器（Columbus，美國），冰凍切片機(jī)（Thermo ，Microm International GmbH ，德國），奧林巴斯熒光顯微鏡（BX53，Olympus，日本）。

1.5 主要實驗試劑與配制

主要實驗試劑：6 羥基多巴（6-OHDA，Sigma，美國），L-抗壞血酸（Sigma，美國）阿樸嗎啡（APO ，Sig?ma，美國），冷凍切片包埋劑（SAKURA，日本），Triton X-100 ：（中杉金橋，北京），鼠抗A2AR單克隆抗體（San?ta Cruz Biotechnology，美國），兔抗D2DR、TH 多克隆抗體（Abcam，香港），熒光素化山羊抗鼠/抗兔二次抗體（Molecular Probes，美國），SCH58261（Abcam，香港），Quinpirole（QUIN，Sigma，美國），總RNA 快速提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR 試劑盒（百泰克生物，北京）。

主要試劑配制方法：6-OHDA 試劑配制：2 mg 6-OHDA 與0.2 mg 抗壞血酸溶解于1 mL 生理鹽水（0.9 %）中，EP 管分裝，錫紙包裹-80℃保存；APO 誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試劑配制：2.5 mgAPO 加入0.01g 抗壞血酸溶于10 mL 生理鹽水（0.9 %）后混勻，全程避光、冰上配制；10 %水合氯醛：將10 g 水合氯醛溶于100 mL 蒸餾水中。

1.6 A2ARR//DD2DDRR實時熒光定量PPCCRR檢測

檢索Genbank 獲得目的基因A2AR、D2DR 與內(nèi)參βactin 基因real-time PCR 檢測的引物序列（見表1），上述引物由北京奧科鼎盛生物公司合成。4 周運(yùn)動干預(yù)結(jié)束后24 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 g/100 g）麻醉大鼠，開顱取腦，迅速分離右側(cè)紋狀體背外側(cè)部，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR 分析。根據(jù)PCR反應(yīng)信號強(qiáng)度Ct值計算目的基因相對表達(dá)量，用2-△△Ct法計算目的基因相對于內(nèi)參基因的mRNA 相對表達(dá)量，單個樣本△Ct=三個復(fù)孔平均基因Ct－內(nèi)參Ct，△△Ct=單個樣本△Ct-假手術(shù)組△Ct 均值。

表1 基因引物序列（5’- 3’）

1.7 A2ARR//DD2DDRR蛋白表達(dá)水平的免疫熒光檢測

4 周運(yùn)動干預(yù)后24 h，10%水合氯醛（0.35 g/100 g）麻醉大鼠，固定、灌流、取腦、置于4%多聚甲醛中固定。將腦組織切片（40 μm）按順序分為6 組，分置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，漂浮于0.1 mol/L PB（pH=7.4）中，3%山羊血清、0.5%Triton X-100和0.1 mol/L PB（pH=7.4）封閉液中孵育 1 h，加入 A2AR 抗體（1∶50）、D2DR 抗體（1∶300）置4℃冷藏過夜。次日，PB 清洗3 次后，移入含Al?exa 488 熒光素化的山羊抗鼠二抗（1∶500）和Alexa 594 熒光素化的山羊抗兔二抗（1∶500）溶液中，室溫條件下孵育 1 h，再用 0.1 mol/L PB 清洗 3 次，貼片，暗處風(fēng)干，滴加50%甘油，加蓋玻片完成標(biāo)本制作。用熒光顯微鏡觀察圖片，從各組紋狀體背外側(cè)部區(qū)域和黑質(zhì)致密部的相同層面選取5 張切片，統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)量，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計。

1.8 A2AR拮抗劑和D2DDRR激動劑干預(yù)行為測試

造模手術(shù)后第 14、28 天對 PD 組和 PD+Ex 組大鼠進(jìn)行藥物誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為測試，方法如下：A2AR 拮抗劑SCH 和D2DR 激動劑QUIN 分別溶于二甲基亞砜（DMSO）中備用。QUIN 組和Ex+QUIN 組腹腔注射生理鹽水（2 mL/kg），15 min 后腹腔注射QUIN（0.1 mg/kg）；SCH+QUIN 組和 Ex+SCH+QUIN 組腹腔注射 SCH（2 mg/kg），15 min后腹腔注射QUIN（0.1 mg/kg）；藥物注射完畢后用旋轉(zhuǎn)儀記錄大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以（±s）表示。采用雙因素重復(fù)測量分析藥物誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為測試結(jié)果；采用Person 相關(guān)性檢驗分析紋狀體A2AR-D2DR 表達(dá)量與藥物誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的相關(guān)性；采用方差分析（One-Way ANOVA）與Duncan 檢驗對RT-PCR、免疫組化、免疫熒光實驗各組間均值進(jìn)行比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 PPDD大鼠模型鑒定及行為學(xué)評價

APO 誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第 7、14、28 天Control 組與Control+Ex 組大鼠均無明顯旋轉(zhuǎn)行為；注射6-OHDA 大鼠（n=116）中向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與損毀側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)差值＞100 r/30 min 共 76 只，PD 成模率約為65.5%，剔除其余未達(dá)標(biāo)大鼠。第 7，14，28 天，PD 與PD+Ex 組大鼠凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均顯著高于Control 組（P＜0.001），第7、14天PD+Ex 組凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較PD 組有所下降但不具有顯著性（P＞0.05），第28 天PD+Ex 組凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較PD組明顯減少（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠術(shù)后APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)變化（r/30 min）

TH 為DA 合成限速酶，存在于DA 神經(jīng)元胞漿內(nèi)，本研究采用免疫組化染色標(biāo)記TH 的方法判定黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)量和存活率。6-OHDA 損毀側(cè)黑質(zhì)致密部TH 染色如圖1A～D 所示。Control組黑質(zhì) DA 神經(jīng)元胞體染色深，數(shù)目多，纖維豐富，細(xì)胞邊界清晰，形態(tài)規(guī)則（圖1A）；Control+Ex 組黑質(zhì)DA 神經(jīng)元數(shù)目較多，染色也略比Control 加深（圖1B）；PD 組黑質(zhì)DA 神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，胞體和纖維稀少（圖1C）；PD+Ex 組DA 神經(jīng)元數(shù)目也較稀少，但部分著色較深，突起稍多（圖1D）。各組損毀側(cè)與健側(cè)黑質(zhì)TH 陽性表達(dá)如圖1E 所示。PD 組和 PD+Ex 組較 Control 組明顯減少（P＜0.001），PD+Ex組較PD組明顯增多（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠黑質(zhì)雙側(cè)TH陽性表達(dá)（n=6）

2.2 紋狀體A2AR mmRRNNAA和D2DR mmRRNNAA表達(dá)水平的檢測結(jié)果

各組大鼠紋狀體背外側(cè)部A2AR mRNA 檢測結(jié)果顯示，與Control 組比較，Control+Ex 組表達(dá)未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05），PD 組和 PD+Ex 組表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.01），但PD+Ex 組卻較PD 組顯著下調(diào)（P＜0.05），如圖2A 所示。紋狀體D2DR mRNA 檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，Control+Ex 組表達(dá)量有上調(diào)趨勢，但未出現(xiàn)顯著性變化（P＞0.05），PD 組和PD+Ex 組出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.01），但PD+Ex 組卻較PD 組出現(xiàn)上調(diào)，差異具有顯著性（P＜0.05），如圖2B所示。

圖2 大鼠紋狀體A2AR和D2DR mRNA相對表達(dá)量的比較（n=8）

2.3 紋狀體A2AR/D2DR蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果

各組大鼠紋狀體背外側(cè)部A2AR 及D2DR 蛋白表達(dá)水平如圖3 所示，C 圖中綠色熒光代表A2AR 蛋白表達(dá)（a），紅色熒光代表D2DR 蛋白表達(dá)（b），黃色熒光代表A2AR 與 D2DR 共表達(dá)（c）。各組大鼠紋狀體 A2AR 及D2DR 蛋白陽性細(xì)胞個數(shù)統(tǒng)計結(jié)果表明，與Control 組相比，PD 組紋狀體A2AR 陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01），PD+Ex 組較PD 組有所下降（P＜0.05），但仍顯著高于Control 組（P＜0.01）；PD 組紋狀體 D2DR 陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01），PD+Ex 組有所回升（P＜0.05），但仍然低于Control 組（P＜0.01）；與Control 組比較，PD組紋狀體A2AR-D2DR 共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01），PD+Ex組較PD組下降（P＜0.05，圖3D-F）。

圖3 大鼠紋狀體A2AR及D2DR蛋白表達(dá)水平比較（n=8）

2.4 A2AR拮抗劑和D2DR激動劑誘導(dǎo)PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為檢測結(jié)果

造模手術(shù)后第14、28 天，藥物誘導(dǎo)PD 大鼠旋轉(zhuǎn)行為檢測結(jié)果如圖4 所示。造模手術(shù)后第14 天，與QUIN組相比，SCH+QUIN 組大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著增多（P＜0.01），Ex+ QUIN 組大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無明顯變化（P＞0.05）。與Ex+QUIN 組相比，Ex+SCH+QUIN 組大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著增多（P＜0.01）；與SCH+QUIN 組相比，Ex+SCH+QUIN 組大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著降低（P＜0.01）。造模手術(shù)后第28 天，EX+QUIN組大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著低于QUIN 組（P＜0.05，圖4B）。各組大鼠28天旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較14天均有增加的趨勢（圖4C）。

圖4 大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的比較（n=8）

2.5 紋狀體A2ARR--DD2DDRR 表達(dá)量與藥物誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的相關(guān)性分析

為評價紋狀體A2AR-D2DR 表達(dá)水平與PD 大鼠行為障礙之間的關(guān)聯(lián)性，本研究將PD 大鼠紋狀體A2ARD2DR 陽性細(xì)胞數(shù)與藥物誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)進(jìn)行Person 相關(guān)性檢驗，結(jié)果顯示，PD 與PD+Ex 組大鼠注射SCH58261 和Quinpirole 后向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)與A2ARD2DR陽性細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)（P＜0.01），如圖5所示。

圖5 PD大鼠紋狀體A2AR-D2DR表達(dá)與藥物誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為的相關(guān)性

3 討論

3.1 6--OOHHDDAA 藥物對大鼠黑質(zhì)DDAA 能神經(jīng)元的毒性損傷作用

PD 是以運(yùn)動功能障礙為主要臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為運(yùn)動不能、遲緩、肌強(qiáng)直、姿勢步態(tài)不穩(wěn)、靜止性震顫及不同動作協(xié)調(diào)模式之間轉(zhuǎn)換能力降低等[8]。PD 發(fā)病比較隱匿，當(dāng)上述癥狀出現(xiàn)時黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元丟失已達(dá)60%，因此，臨床上將運(yùn)動功能評分作為判斷PD 患者DA 能神經(jīng)元存活率的參考依據(jù)[9]。6-OHDA 為選擇性兒茶酚胺類神經(jīng)化學(xué)損毀劑，進(jìn)入體內(nèi)后易氧化生成羥自由基和醌類等神經(jīng)毒物，特異性地?fù)p毀黑質(zhì)DA能神經(jīng)元，引起DA生成減少，黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)功能退變，產(chǎn)生與PD患者相類似的一系列運(yùn)動功能障礙，如損毀側(cè)運(yùn)動減少、身體向損毀側(cè)偏斜、四肢平衡及協(xié)調(diào)性降低等[10]。因此，6-OHDA大鼠是目前公認(rèn)的一種用于PD 病理學(xué)和藥理學(xué)研究的理想PD動物模型。

已有研究證實，6-OHDA 注射后24 h出現(xiàn)黑質(zhì)DA神經(jīng)元變性，2～3 天后出現(xiàn)紋狀體DA 含量減少，成模后 14 天 DA 含量約減少 80%～90%[11]。6-OHDA 染毒導(dǎo)致PD 大鼠紋狀體中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs）突觸后膜上 D2DR 超敏，此時若給予D2DR 激動劑或促DA 釋放劑等藥物可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)異常向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為[12]。鑒于此，本研究在注射6-OH?DA 藥物7 天后，采用APO 誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)行為，并以30 min 內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于100 r 作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，成功復(fù)制PD 大鼠模型，成模率約為65.5%。TH 免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)，PD 組和PD+Ex 組大鼠黑質(zhì)致密度DA 能神經(jīng)元著色較深，數(shù)量明顯減少，胞體和纖維稀少，說明6-OHDA藥物造成了DA能神經(jīng)元不同程度損傷。

3.2 運(yùn)動對PPDD模型大鼠黑質(zhì)DDAA能神經(jīng)元的保護(hù)作用

長期從事規(guī)律的體育活動能夠有效降低PD 發(fā)病率[13]。太極拳、拳擊、探戈、抗阻力練習(xí)等運(yùn)動康復(fù)手段對PD 患者行為功能異常產(chǎn)生積極影響[14，15]。自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動、強(qiáng)迫跑臺運(yùn)動、游泳及綜合運(yùn)動訓(xùn)練等方法在改善嚙齒類PD 動物行為功能障礙方面也積累了一些有效數(shù)據(jù)[16，17]。本實驗室前期研究證實，4 周運(yùn)動干預(yù)顯著改善了PD 大鼠前肢運(yùn)動不對稱性[18]、四肢協(xié)調(diào)性和自主活動能力[19]。本研究采取Tajiri 等[7]跑臺運(yùn)動干預(yù)方案，運(yùn)動干預(yù)介入時間選擇在6-OHDA 注射后24 h，證實早期運(yùn)動干預(yù)達(dá)到緩解6-OHDA 藥物對黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元毒性損傷的效果。另有研究證實，運(yùn)動可降低PD 模型大鼠黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元的死亡率，上調(diào)紋狀體TH 陽性表達(dá)[20]，與本研究結(jié)果一致。本實驗室前期研究還發(fā)現(xiàn)，4 周跑臺運(yùn)動干預(yù)通過上調(diào)PD 大鼠紋狀體D2DR 表達(dá)，抑制黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元放電頻率和爆發(fā)式放電活動，改善黑質(zhì)-紋狀體DA 神經(jīng)通路的功能[21，22]；其原因與運(yùn)動的神經(jīng)保護(hù)作用減輕了 6-OHDA 藥物對黑質(zhì)-紋狀體通路DA 能神經(jīng)元的毒性損傷，增加了DA合成與分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)了黑質(zhì)-紋狀體DA能神經(jīng)傳遞過程有關(guān)[23]。

3.3 運(yùn)動調(diào)節(jié)紋狀體A2ARR//DD2DDRR 表達(dá)改善PPDD 大鼠的行為功能障礙

紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)直接與間接運(yùn)動調(diào)節(jié)通路的起始部位，其神經(jīng)元構(gòu)筑約95%為GABA 能MSNs，分兩類亞型：即表達(dá)D1DR 的GABA 能強(qiáng)啡肽神經(jīng)元和表達(dá) D2DR 的 GABA 能腦啡 肽神經(jīng) 元[24]。 A2AR/D2DR 共表達(dá)于紋狀體D2-MSNs 突觸后膜[25]，均屬G 蛋白偶聯(lián)受體，對腺苷酸環(huán)化酶（AC）產(chǎn)生互為拮抗作用；激活A(yù)2AR 興奮紋狀體-蒼白球通路GABA 能神經(jīng)元、激活間接通路，起到抑制運(yùn)動的作用[26]；相反，激活D2DR 抑制紋狀體-蒼白球通路GABA 能神經(jīng)元、抑制間接通路，起到易化運(yùn)動的作用[27]。

Katia 等[28]發(fā)現(xiàn)PD 患者血漿中腺苷及其代謝物濃度高達(dá)5.1 ± 0.4 μM，而健康人僅為2.0 ± 0.2 μM；腺苷濃度大幅度增高易使A2AR活性增強(qiáng)、密度增加，可刺激下游cAMP 生成增多，興奮紋狀體-蒼白球通路GA?BA 能神經(jīng)元、過度激活間接通路，是引起PD 患者運(yùn)動障礙的腦內(nèi)分子機(jī)制之一。PD 動物紋狀體D2DR 表達(dá)下調(diào)，易感性增強(qiáng)[29]；A2AR 激動劑可顯著削弱6-OHDA大鼠紋狀體MSNs突觸后膜上超敏的D2DR 與其激動劑的親和力，抑制D2DR 活性[30]。由此推測，PD 大鼠紋狀體D2DR 信號減弱與A2AR 過度激活有關(guān)，紋狀體A2AR與D2DR 表達(dá)異常是導(dǎo)致直接與間接通路調(diào)節(jié)失衡，引起PD大鼠運(yùn)動功能障礙出現(xiàn)的主要原因之一。

本研究結(jié)果顯示，4 周運(yùn)動干預(yù)下調(diào)了PD 大鼠紋狀體A2AR mRNA 和蛋白表達(dá)，上調(diào)了D2DR mRNA 和蛋白表達(dá)，并下調(diào)A2AR-D2DR 表達(dá)。Costa 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，1 次/周、3 次/周和 7 次/周跑臺運(yùn)動均可下調(diào)老年大鼠海馬A2AR 蛋白表達(dá)。上述研究結(jié)果說明，運(yùn)動干預(yù)起到類似A2AR 拮抗劑的作用?？Х纫螂`屬于非特異性A2AR 拮抗劑，作用于紋狀體D2-MSNs 突觸后膜調(diào)節(jié)A2AR 表達(dá)，抑制AC 和cAMP 生成及紋狀體-蒼白球通路GABA 能神經(jīng)元的興奮性，改善了PD 大鼠的行為功能[32]。近些年來A2AR 拮抗劑已作為PD 病人藥物治療的新靶點[33]。流行病學(xué)研究顯示，人群原發(fā)性PD 發(fā)病率與咖啡因攝取量呈負(fù)相關(guān)，6-OHDA大鼠給予2周低劑量咖啡因干預(yù)后自主活動能力明顯改善[34]。本研究采用A2AR拮抗劑和D2DR激動劑藥物干預(yù)進(jìn)一步證實，運(yùn)動通過抑制紋狀體A2AR對D2DR的拮抗作用，減弱胞內(nèi)AC-cAMP-PKA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，抑制D2-MSNs過度激活，促進(jìn)黑質(zhì)-紋狀體DA能突觸傳遞的可塑性，進(jìn)而調(diào)節(jié)直接/間接通路失衡狀態(tài)，達(dá)到改善PD 行為功能障礙的治療效果。

4 總結(jié)

早期運(yùn)動干預(yù)可減輕6-OHDA 藥物對大鼠黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元的毒性損傷，調(diào)節(jié)PD 模型大鼠紋狀體A2AR 及D2DR 基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，改善PD 模型大鼠的行為功能障礙。本研究初步證實紋狀體A2AR/D2DR是運(yùn)動糾正PD 大鼠基底神經(jīng)節(jié)直接與間接通路失衡的重要細(xì)胞分子靶點，其機(jī)制可能與運(yùn)動的神經(jīng)保護(hù)作用改善了PD 大鼠黑質(zhì)-紋狀體DA 能通路的突觸可塑性有關(guān)。采用全細(xì)胞膜片鉗與光遺傳技術(shù)實現(xiàn)對細(xì)胞膜分子的精準(zhǔn)操控，進(jìn)一步闡明紋狀體A2AR/D2DR在運(yùn)動糾正PD 基底神經(jīng)節(jié)直接與間接通路失衡中的作用機(jī)制將是本研究團(tuán)隊今后的工作重點。