王繼 楊中亞 張龍 周越

1 六盤水師范學院體育學院（貴州六盤水 553004）

2 北京體育大學運動人體科學學院（北京 100084）

許多2 型糖尿病患者在診斷過程中常發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)病變相關的亞臨床癥狀——肌萎縮[1]。骨骼肌是攝取和利用葡萄糖的重要組織，其質(zhì)量和功能的降低將導致外周組織處理葡萄糖的能力降低，進一步加劇2型糖尿病的發(fā)病進程。研究發(fā)現(xiàn)[2-4]，在2 型糖尿病肌萎縮的發(fā)生過程中，氧化型慢?。á裥停┹^酵解/氧化型快肌（Ⅱ型）的萎縮程度更明顯，同時伴隨骨骼肌中葡萄糖氧化酶活性的降低。而Ⅰ型肌纖維中胰島素受體和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter protein 4，GLUT 4）表達量更高，對胰島素和肌肉收縮等引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運作用的貢獻率也更高[5]。

體育鍛煉改善2 型糖尿病的原因之一是通過增加骨骼肌容量、增強骨骼肌對葡萄糖的吸收利用，從而降低血糖，進而改善糖代謝障礙[6]。研究發(fā)現(xiàn)，離心運動能有效刺激骨骼肌纖維增殖與肥大，并較好地恢復肌萎縮發(fā)生時的肌纖維類型構成改變，抑制肌纖維橫截面積降低[7]。此外，離心運動還能更好地節(jié)省體能，提示對于心肺耐力和肌肉耐力較差的2型糖尿病患者來說，下坡跑等離心運動可能是一種更合適的鍛煉方式[8]。

鑒于此，本研究通過高脂膳食聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（ streptozotocin，STZ）建立2 型糖尿病動物模型，觀察2 型糖尿病大鼠肌纖維類型構成的變化情況，并探究4 周離心運動對2 型糖尿病大鼠糖代謝和肌纖維類型的影響及相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及器材

STZ 購于 Sigma 公司（S0130）；大鼠胰島素酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒購于Mercodia 公司（10-1250-01）；ATP二鈉鹽、221（1.5M 2-amino-2-methyl-1-propanol）緩沖液購于Sigma公司（11）；甲苯胺藍溶液購于北京索萊寶科技有限公司（G3668），其余分析純均購于國藥集團化學試劑有限公司。酶標儀購于BIO-RAD 公司，血糖儀購于強生（上海）醫(yī)療器材有限公司（穩(wěn)擇易?血糖儀）。

1.2 動物建模與運動

6 周齡雄性 SD 大鼠 39 只，體重 214.1 ± 7.7 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供（許可證編號：SCXK/京2012-0001）。飼養(yǎng)、訓練均于北京體育大學實驗動物房內(nèi)完成。分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水。濕度相對值為45%～55%，環(huán)境溫度為20℃～24℃，采用12 h～12 h 循環(huán)晝夜照明，每周稱重，記錄大鼠體重。實驗通過北京體育大學運動科學實驗倫理委員會批準。

以普通飼料適應性喂養(yǎng)5 天后隨機取15 只大鼠為普通飼料組，給予普通飼料飼養(yǎng)9周；其余24只大鼠為高脂飼料組，給予高脂飼料飼養(yǎng)9 周（北京華阜康生物科技股份有限公司，H10045，能量比：脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白質(zhì)20%）。高脂飼料組于9 周飼養(yǎng)后間隔3 天連續(xù)注射2 次STZ（單次劑量為25 mg/kg bw），普通飼料組腹腔注射相應量枸櫞酸鈉緩沖液。STZ 注射在30 min 內(nèi)避光完成，之后恢復大鼠飲食。STZ 注射后1 周對高脂飼料組大鼠尾靜脈抽血測空腹血糖濃度。參考Srinivasan 等[9]將STZ 注射后3 天空腹血糖≥11.1 mmol/L 作為成模標準，剔除不成模大鼠。1 周后復查大鼠空腹血糖濃度觀察模型穩(wěn)定性并剔除不成模大鼠。最終得到2 型糖尿病模型大鼠20 只，建模率為83.3%。

將普通飼料組大鼠隨機分為普通對照組（C 組，n=6）和普通運動組（E 組，n=9）；將2型糖尿病模型組大鼠隨機分為糖尿病對照組（D 組，n=8）和糖尿病運動組（DE組，n=12）。

普通運動組和糖尿病運動組參照Armstrong 離心運動方案[10]進行4周離心運動干預，運動期間均恢復普通飼料飼養(yǎng)。大鼠在正式運動訓練前進行3 天適應性跑臺訓練：第1 天跑臺坡度 0°，時間5 min；第2 天跑臺坡度－5°，時間10 min；第3 天跑臺坡度－5°，時間30 min；跑速均為16 m/min。休息兩天后正式開始訓練。運動方案：坡度－5°，跑速16 m/min，每天訓練60 min，每周訓練5天，共4周。

1.3 樣本采集與測試

1.3.1 血樣采集與測試

在4 周訓練前后取所有大鼠禁食12 h 后尾血，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）水平，血糖儀測定空腹血糖濃度（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）。計算大鼠胰島素抵抗和敏感性指數(shù)。胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR=FINS（IU/L）×FBG（mmol/l）/22.5；胰島素敏感性指數(shù) ISI=1/FBG（mmol/L）×FINS（mIU/L）。

1.3.2 骨骼肌樣本采集

4 周訓練后，對所有大鼠稱重，腹腔注射水合氯醛（濃度10%，0.4 ml/100 g bw）麻醉，腹主動脈取血；分離比目魚肌，取肌腹位置肌肉切成0.5 cm×0.3 cm×0.3cm 左右的長塊狀，放入盛有OCT 包埋劑的方盒中，在液氮預冷的異戊烷中固定后包裹錫紙，存放至－80℃冰箱保存，用于制備切片。

1.3.3 ATPP--aassee異染肌纖維類型

參考王月麗、周越等[11]改良的ATP-ase染色方案區(qū)分肌纖維類型。制取冰凍切片樣品，切片厚度8 μm。室溫環(huán)境復溫5 min 后，預孵育液中室溫預孵育2 min。Tris 緩沖液洗2 min×3 次，去除殘余的預孵育液。甩干，孵育液中室溫孵育15 min。1% CaCl2·2H2O 水溶液中換洗 3 次，每次提拉切片 3～4 次，終止ATP-ase 反應。0.1%甲苯胺藍水溶液中染色90 s。流水沖洗切片10～20 s，去除多余染液。依次于95%酒精、無水酒精、無水酒精中快速脫水，每次將切片上下提拉3～5 次。二甲苯透明，中性樹膠封片。數(shù)碼體視顯微鏡拍片，采用ImageJ1.43 統(tǒng)計不同類型肌纖維數(shù)量，Image-Pro Plus 6.0 統(tǒng)計不同類型肌纖維平均橫截面積。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（±s）表示。采用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，則組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時用LSD方法進行組間多重比較，方差不齊性時采用Tamhane’s方法；若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則組間比較采用非參數(shù)檢驗的Mann-Whitney 檢驗。采用Pearson 相關分析肌纖維類型和胰島素敏感性的相關性。以P＜0.05為顯著水平，P＜0.01為非常顯著水平。

2 結果

2.1 2 型糖尿病和離心運動對大鼠體重、空腹血糖和血清胰島素的影響

與普通對照組相比，糖尿病對照組運動前的體重非常顯著降低（P＜0.01），空腹血糖水平非常顯著升高（P＜0.01），血清胰島素水平非常顯著降低（P＜0.01），提示9 周高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ 注射建立的2 型糖尿病大鼠模型糖代謝障礙特征明顯（表1）。

4 周離心運動后，與普通對照組相比，普通運動組大鼠體重非常顯著降低（P＜0.01），血清胰島素水平非常顯著降低（P＜0.01），空腹血糖有降低趨勢（P=0.210）。與糖尿病對照組相比，糖尿病運動組大鼠體重無顯著性差異（P=0.450），空腹血糖和血清胰島素水平均有降低趨勢（P=0.170，P=0.120）（表1）。這提示4周離心運動能有效降低正常大鼠的血糖和胰島素水平，但對糖尿病大鼠糖代謝指標無顯著影響。

表1 運動前后各組大鼠體重、空腹血糖和血清胰島素水平比較

2.2 2型糖尿病和離心運動對大鼠胰島素敏感性的影響

與普通對照組相比，糖尿病對照組運動前的胰島素抵抗指數(shù)非常顯著升高（P＜0.01），胰島素敏感性指數(shù)非常顯著降低（P＜0.01），提示9 周高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ注射建立的2 型糖尿病大鼠模型糖代謝障礙特征明顯（表2）。

4 周離心運動后，與普通對照組相比，普通運動組大鼠胰島素抵抗指數(shù)非常顯著降低（P＜0.01），胰島素敏感性指數(shù)顯著升高（P=0.030）。與糖尿病對照組相比，糖尿病運動組大鼠胰島素抵抗指數(shù)非常顯著降低（P＜0.01），胰島素敏感性指數(shù)有升高趨勢（P=0.105）（表2）。這提示4 周離心運動能較好地降低正常大鼠和糖尿病大鼠胰島素抵抗現(xiàn)象，提升外周組織胰島素敏感性。

表2 運動前后各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感性指數(shù)比較

2.3 2型糖尿病和離心運動對大鼠肌纖維類型的影響

ATP-ase 異染結果顯示，Ⅰ型肌纖維呈淺藍色，Ⅱ型肌纖維呈深藍色，為消除染片不同批次間色彩飽和度（純度）的差異，統(tǒng)一去色（轉(zhuǎn)換為灰度模式）。去色后灰色為Ⅰ型肌纖維，黑色為Ⅱ型肌纖維（圖1）。

在肌纖維平均橫截面積方面：與普通對照組相比，糖尿病對照組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維平均橫截面積均顯著減?。≒＜0.01，P=0.046），其中Ⅰ型肌纖維平均橫截面積減小幅度達到34.8%，Ⅱ型肌纖維為14.1%。與普通對照組相比，普通運動組大鼠Ⅰ型肌纖維平均橫截面積有增大趨勢（P=0.052），升高幅度達11.9%；而Ⅱ型肌纖維平均橫截面積無顯著變化（P=0.959）。與糖尿病對照組相比，糖尿病運動組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維平均橫截面積均顯著增大（P＜0.01，P=0.045），增大幅度分別為44.7%和13.6%。

在肌纖維數(shù)量分數(shù)方面：與普通對照組相比，糖尿病對照組大鼠Ⅰ型肌纖維數(shù)量分數(shù)有降低趨勢，Ⅱ型肌纖維數(shù)量分數(shù)有升高趨勢（P=0.087）。與普通對照組相比，普通運動組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維數(shù)量分數(shù)均無顯著變化（P=0.240）。與糖尿病對照組相比，糖尿病運動組大鼠Ⅰ型肌纖維數(shù)量分數(shù)有降低趨勢，Ⅱ型肌纖維數(shù)量分數(shù)有升高趨勢（P=0.074）。

在肌纖維面積分數(shù)方面：與普通對照組相比，糖尿病對照組大鼠Ⅰ型肌纖維面積分數(shù)顯著降低，Ⅱ型肌纖維面積分數(shù)顯著升高（P＜0.01）。與普通對照組相比，普通運動組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維面積分數(shù)均無顯著差異（P=0.805）；與糖尿病對照組相比，糖尿病運動組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維面積分數(shù)無顯著差異（P=0.654）。

圖1 比目魚肌ATP-ase異染肌纖維類型（10×20）

2.4 Ⅰ型肌纖維類型和胰島素敏感性的相關性分析

肌纖維面積分數(shù)綜合反映了骨骼肌中不同類型肌纖維構成情況。為闡明肌纖維類型改變在運動改善2型糖尿病代謝障礙中的作用，本研究進一步分析了Ⅰ型肌纖維面積分數(shù)與胰島素敏感性指數(shù)（ISI）的相關性（圖2）。結果顯示Ⅰ型肌纖維面積分數(shù)與胰島素敏感性指數(shù)呈正相關（r=0.485，P＜0.01），提示肌纖維面積分數(shù)的改變是胰島素敏感性改變以及運動提高胰島素敏感性的重要原因。

表3 運動后各組大鼠肌纖維平均橫截面積、數(shù)量分數(shù)和面積分數(shù)比較

圖2 Ⅰ型肌纖維面積分數(shù)與胰島素敏感性指數(shù)（ISI）散點圖

3 討論

3.1 2型糖尿病大鼠模型的建立與評價

2 型糖尿病發(fā)病常經(jīng)過3 個階段：肥胖導致胰島素敏感性降低→胰島B 細胞過度激活→基礎胰島素分泌增加和高胰島素血癥[12]。這種發(fā)生在2 型糖尿病早期的病理狀況如果未得到有效控制，胰島B 細胞功能將逐漸衰退，胰島素分泌開始下降，2 型糖尿病進一步惡化，最終將發(fā)展進入2型糖尿病后期。

高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）注射構建符合2型糖尿病代謝特征的模型具有建模時間短、癥狀典型和穩(wěn)定性好等特征，是最常見的糖尿病動物模型。本研究通過9 周高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ 注射建立2 型糖尿病模型，建模率達到83.3%。模型組大鼠血糖顯著升高，血清胰島素水平顯著降低，胰島素抵抗指數(shù)顯著升高，胰島素敏感性指數(shù)顯著降低。這表明9 周高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ 注射建立的2 型糖尿大鼠病模型具有典型的外周組織胰島素抵抗程度增加和胰島素敏感性下降特征。

3.2 離心運動對2型糖尿病大鼠胰島素敏感性的影響

通過4 周離心運動干預，正常大鼠血清胰島素水平、胰島素抵抗程度降低，胰島素敏感性提高；同時也在一定程度上降低2 型糖尿病大鼠空腹血糖水平，但對其血清胰島素水平無明顯影響，最終降低胰島素抵抗，提高胰島素敏感性。離心運動能顯著改善2 型糖尿病大鼠的糖代謝障礙和胰島素敏感性，這可能與離心運動提高2 型糖尿病大鼠骨骼肌容量和功能有關。研究[13]發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長與肥胖的發(fā)展，糖、脂代謝障礙使骨骼肌質(zhì)量和功能出現(xiàn)進行性下降。骨骼肌是負責外周葡萄糖攝取和利用的重要組織，其質(zhì)量和功能的降低將直接導致骨骼肌容量降低，胰島素敏感性下降。

不習慣的離心收縮會誘導損傷進而降低骨骼中GLUT4 的水平，這是導致一過性胰島素抵抗的重要原因[14]；但規(guī)律的離心運動能帶來更大的運動后肌肉肥大效應[15]，同樣也能對葡萄糖耐量產(chǎn)生積極作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律的離心運動能有效降低糖尿病前期患者的低密度脂蛋白和胰島素抵抗水平[17]，提示離心運動在有效刺激骨骼肌纖維增殖與肥大，提升骨骼肌功能和改善胰島素敏感性方面有廣泛的應用前景[7]。

研究還發(fā)現(xiàn)[8]，與下坡跑相比，3周中等強度上坡跑能更有效降低2 型糖尿病患者的甘油三酯、空腹血糖，升高血清胰島素并改善葡萄糖耐量。但是在調(diào)整能量消耗后發(fā)現(xiàn)，上坡跑和下坡跑所有的代謝參數(shù)差異消失。這表明在能量消耗相同的前提下，規(guī)律的向心耐力運動（上坡跑）和離心耐力運動（下坡跑）能達到相同的效果，提示上坡跑是一種更為高效的鍛煉方式。但是，對于有氧能力和肌肉耐力較差的2 型糖尿病患者來說，下坡跑能更好地節(jié)省體能，可能是更合適的鍛煉方式。

3.3 2 型糖尿病大鼠肌纖維類型改變及離心運動干預效果分析

根據(jù)肌纖維的ATP-ase 活性可以將肌纖維分為Ⅰ型肌纖維和Ⅱ型肌纖維。其中Ⅰ型肌纖維ATP-ase 活力較低，但由于毛細血管密度、肌紅蛋白和糖轉(zhuǎn)運蛋白含量以及有氧代謝酶活性都較強，其持續(xù)氧化供能的能力也較強，因此又稱為氧化型纖維；Ⅱ型肌纖維ATP-ase 活力較高，根據(jù)ATP-ase 活力由高到低又可以分為ⅡB 型、ⅡX 型和ⅡA 型，與Ⅰ型肌纖維不同的是其有氧代謝能力較差，但通過糖酵解和磷酸原系統(tǒng)短時間大量供能能力強[18]。

Gaster等[2]的研究表明，與健康受試者相比，肥胖受試者慢肌纖維比例降低至86%，而2型糖尿病患者慢肌比例降低至75%。本研究顯示，糖尿病對照組大鼠比目魚?、裥秃廷蛐图±w維平均橫截面積較普通對照組均顯著降低，其中Ⅰ型肌纖維平均橫截面積降低幅度達到34.8%，Ⅱ型肌纖維平均橫截面積降低幅度為14.1%。伴隨Ⅰ型肌纖維數(shù)量分數(shù)的降低和Ⅱ型肌纖維數(shù)量分數(shù)的提高，最終糖尿病對照組大鼠Ⅰ型肌纖維面積分數(shù)顯著降低，Ⅱ型肌纖維面積分數(shù)顯著提高。由于慢肌對葡萄糖的利用率更高，慢肌比例下降也將進一步加劇肥胖及2 型糖尿病的代謝障礙[5]。此外，研究[3]還發(fā)現(xiàn)，在2 型糖尿病患者中，慢肌纖維面積分數(shù)降低的同時還伴隨骨骼肌中琥珀酸脫氫酶（succi?nate dehydrogenase，SDH）活性的降低，氧化酶活性的降低將直接導致三羧酸循環(huán)受阻，加劇骨骼肌糖脂代謝障礙[19]。

4周離心運動后，糖尿病運動組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維平均橫截面積均顯著升高，升高幅度分別為44.7%和13.6%。離心運動導致2 型糖尿病大鼠比目魚?、裥图±w維橫截面積增加幅度更大，可能與比目魚肌中慢肌在低強度離心運動中選擇性募集和損傷再生有關。但伴隨肌纖維數(shù)量分數(shù)的反向變化，普通運動組和糖尿病運動組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維面積分數(shù)與對照組相比均無顯著差異。

Ⅰ型肌纖維的己糖激酶Ⅱ、糖原合成酶（GS）和丙酮酸脫氫酶-E1α（PDH-E1α）等糖代謝關鍵酶活性均較Ⅱ型肌纖維更高，葡萄糖代謝能力更強；此外，Ⅰ型肌纖維中胰島素受體和GLUT 4表達量也更高，CLUT4作為骨骼肌細胞轉(zhuǎn)運葡萄糖的重要載體，主要對胰島素和肌肉收縮等刺激因素引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運起作用[5]。離體實驗表明，胰島素刺激的葡萄糖攝取率與Ⅰ型纖維的比例呈正相關[20]。

本研究顯示，Ⅰ型肌纖維面積分數(shù)與胰島素敏感性指數(shù)呈中度正相關。在肥胖和2 型糖尿病患者中，慢肌中的GLUT4 密度比快肌更低[2]。慢肌比例的降低聯(lián)合慢肌中GLUT4 含量的降低，導致與胰島素相關的GLUT4 總含量降低，是2 型糖尿病患者骨骼肌胰島素抵抗增加，敏感性下降和葡萄糖代謝障礙的重要原因；而離心運動通過提高骨骼肌容量，改善肌纖維構成失衡，進而降低2 型糖尿病胰島素抵抗，提高胰島素敏感性，最終改善2型糖尿病代謝障礙。

4 總結

9周高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ注射成功構建符合2型糖尿病代謝特征的大鼠模型。2 型糖尿病大鼠骨骼肌容量降低，尤其是葡萄糖代謝能力強的Ⅰ型肌纖維容量降低，是導致2 型糖尿病糖代謝障礙的重要原因；而4 周離心運動能在一定程度上恢復失衡的肌纖維構成，這可能是離心運動降低2 型糖尿病胰島素抵抗，提高胰島素敏感性的重要原因。