薛 帆，宋晶珠，裴凌鵬△

(1. 中央民族大學藥學院，北京 100081； 2. 民族醫(yī)藥教育部重點實驗室,北京 100081)

在一定時間內(nèi)大劑量D-半乳糖攝入可導致機體衰老，而伴隨衰老過程常會誘發(fā)骨質(zhì)的變化，對于研究致衰老繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制具有一定的理論意義與臨床價值[1-2]。 水族源于古代“百越”族系，由秦漢時期“西甌”族的“駱越”一支發(fā)展演變而來[3]。其先民在長期與惡劣自然環(huán)境和疾病的斗爭中，積累了防病治病的豐富經(jīng)驗，形成了獨特的水族醫(yī)藥，是結合中醫(yī)、苗醫(yī)、壯醫(yī)、瑤醫(yī)以及布依醫(yī)的具有云貴高原藥物學特點和民族特色的醫(yī)藥體系[4]。風流草又稱壯陽草、接骨草[5]，為豆科植物舞草Desmodiumgyrans(L.)DC.，屬水族習用藥材，其水藥名為“罵都領”。野生落葉小灌木，高約1.5 m，莖圓柱狀有縱溝、無毛。葉互生，羽狀復葉，小葉1～3枚，頂生小葉矩形至線形，葉柄長1.1～2 cm。頂生花序圓錐狀，花紫紅色，莢果鐮形或直，節(jié)5～9個，花期秋季。據(jù)《水族骨傷醫(yī)藥》記載，其性味苦平，歸肝腎經(jīng)，具有祛瘀生新、舒筋活絡作用，主治強壯筋骨、風濕骨痛、骨折等[6]。 本實驗旨在通過風流草總醇提物對D-半乳糖致衰老大鼠骨質(zhì)相關指標(如骨密度、骨生物力學參數(shù)、血清鈣磷含量、骨羥脯氨酸含量、骨堿性磷酸酶活性等)的研究，初步評價其對上述模型的效果，進而探索這一傳統(tǒng)水族草藥可能的藥效學作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

雙能X線骨密度測定儀、島津萬能實驗機、火焰原子吸收分光光度計、全自動生化儀(日本島津公司)；HPLC(美國Waters公司)；752分光光度計(中國伯樂公司)； D-半乳糖、大孔吸附樹脂(北京化學試劑公司)；鈣黃綠素、鹽酸四環(huán)素、Goldners染料、乙醇； 風流草(采自貴州黔南三都水族自治縣都柳江畔)。

1.2 風流草植物鑒定

所采樣本經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥學院生藥系楊瑤珺教授鑒定為豆科植物舞草Desmodiumgyrans(L.)DC.，俗稱為風流草。

1.3 風流草總醇提物制備

1000 g風流草枝葉曬干、粉碎，60目篩備用，70%乙醇5000 mL回流提取2次，每次2 h，離心過濾，合并清液冰凍真空干燥制成干粉。

1.4 造模與給藥方法

6周齡SD大鼠(雌雄各半)36只，購自中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物養(yǎng)殖中心(批號ZKYX-201703010)。36只大鼠隨機分為3組，即模型組、幼齡對照組和風流草總醇提物組(即藥物組)每組各12只。另購16月齡同品系大鼠(雌雄各半)12只作為老齡對照組。模型組和藥物組用D-半乳糖頸背部皮下注射，每天1次，每次20 mg/kg，其中藥物組用風流草總醇提物每天灌胃1次，每次20 mg/kg(依據(jù)臨床習用量人/鼠折算)。其他各組均以等量生理鹽水注射，每天1次，連續(xù)飼養(yǎng)5個月。實驗結束后所有動物麻醉處死，收取雙側(cè)股骨，測定骨長度、骨質(zhì)量、骨密度、骨結構力學與生物力學指標、骨羥脯氨酸含量、骨堿性磷酸酶(ALP)活性以及對骨組織構成進行分析，采血分離血清進行鈣磷含量測定。本實驗已通過中央民族大學實驗動物倫理委員會審查。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 骨結構力學與生物力學的測定 按之前的方法進行骨結構力學與生物力學的測定[7]。取大鼠股骨,用千分尺測量右側(cè)股骨長度，用分析天平稱量兩側(cè)股骨的重量， 將左股骨標本進行 3 點彎曲實驗, 得到載荷-撓度曲線。 由此，曲線可直接得出大鼠骨的結構力學參數(shù)(最大載荷、最大撓度、彈性載荷、彈性撓度)。測定參數(shù):下壓速度 10 mm/min，下壓幅度 4 mm，保持時間 5 s，跨度 22 mm。 將股骨斷開后, 取股骨中部做徑向切片, 在顯微鏡下用顯微尺測量股骨的最大外徑 A、最小外徑 B、最大內(nèi)徑 a、最小內(nèi)徑 b， 計算出大鼠股骨的各項生物力學指標。

1.5.2 骨密度測定 按之前的方法進行骨密度測定[8]。取出股骨解凍后于Lunar- XR型雙能X線骨密度測定儀測骨密度,分骨近段、中段、遠段三部分測其骨密度。測定位置為前后位,測試標本置于塑料盤內(nèi),內(nèi)盛適量生理鹽水浸沒標本,掃描整個標本后選定測定區(qū)域得出各骨密度值。近段和遠段代表松質(zhì)骨骨密度,骨中段代表皮質(zhì)骨骨密度。測定參數(shù):掃描寬度 20 nm,掃描速度 7 mm· s-1。

1.5.3 血清鈣磷含量的測定 血清中Ca、P含量根據(jù)試劑盒說明由全自動生化儀進行分析。

1.5.4 骨組織構成觀察 按之前的方法進行骨組織構成觀察[9]。采用圖像分析儀測定大鼠股骨上段不脫鈣骨的骨髓腔中脂肪細胞、血竇和紅骨髓面積比，其中將脂肪組織和血竇面積視為白骨髓面積，而剩余面積為紅骨髓面積，紅骨髓面積與白骨髓面積之和即為骨髓腔面積。

1.5.5 骨羥脯氨酸含量、ALP活性測定 方法詳見[10]。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 骨長度、質(zhì)量變化

表1示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組股骨長度與質(zhì)量均有所升高(P<0.05)，模型組與老齡對照組比較有所降低(P<0.05)；與模型組比較，藥物組骨長與質(zhì)量均有所升高(P<0.05)。

表1 不同處理組間股骨骨長度、質(zhì)量比較

2.2 骨結構力學與生物力學指標測定結果

表2、3示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組股骨結構力學與生物力學指標均有所降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，藥物組股骨結構力學與生物力學參數(shù)指標有所升高(P<0.05)。

表2 股骨結構力學指標比較

2.3 骨密度指標測定結果

表4示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組股骨不同部位骨密度均有所降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，藥物組股骨不同部位骨密度有所升高(P<0.05)。

表4 股骨各部位骨密度測量比較

2.4 血清鈣磷含量測定結果

表5示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組血清鈣磷含量均有所升高(P<0.01)；與模型組比較，藥物組血清鈣磷含量均有所降低(P<0.05或P<0.01)。

表5 血清鈣、磷含量比較

2.5 骨組織構成觀測

表6示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組骨髓面積增加而紅骨髓面積減少(P<0.05或P<0.01)，白骨髓中脂肪組織增多(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，藥物組骨髓腔中白骨髓面積減少(P<0.01)，而紅骨髓面積增加，脂肪組織減少，血竇組織增加(P<0.05或P<0.01)。

表3 股骨生物力學指標比較

表6 骨髓組織構成觀測比較

2.6 骨羥脯氨酸含量、ALP活性測定結果

表7示，與幼齡對照組比較，模型組、老齡對照組骨羥脯氨酸含量、ALP活性均有所降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，藥物組骨羥脯氨酸含量、ALP活性均有所升高(P<0.05)。

表7 骨羥脯氨酸含量、ALP活性

3 討論

水族藥用植物大多有活血通絡、增強機體耐缺氧的能力。云貴高原生長的水藥材如五爪金龍等，在治療骨傷慢性疾病、自身免疫性疾病和老年病等常見病方面有顯著作用，且毒副作用小[6]。水族醫(yī)生認為，傷后疼痛大多是因為瘀血、邪毒以及血液缺失等原因?qū)е卵毫魉贉p慢，或者是血管堵塞，進而造成血液無法通過血脈導致疼痛。風流草具有祛瘀生新、舒筋活絡作用，對骨傷疾病有一定的治療作用。

在一定時間內(nèi)大量進食D-半乳糖造成細胞外積累效應，可誘發(fā)大量自由基的產(chǎn)生，從而影響機體正常自由基代謝過程。而多余的自由基極易攻擊細胞質(zhì)膜、內(nèi)膜系統(tǒng)以及核膜，尤其是對膜脂雙分子結構及質(zhì)膜上的離子通道影響較大。此外，對于線粒體內(nèi)裸露的mtDNA同樣具有破壞作用，進而影響細胞呼吸鏈的正常功能，造成細胞形態(tài)結構改變與功能的喪失，誘發(fā)機體的衰老。隨著機體衰老程度的加劇，過剩的自由基從整體、細胞和基因不同水平層次影響骨代謝,使繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率也逐步升高[11-12]。在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病類型中，繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率占主導地位，主要特征包括骨礦密度減低、骨微結構破壞以致骨的力學能力下降、骨脆性增強等。在骨重建過程中，一方面自由基可以通過多種途徑破壞膠原蛋白形成，如減少羥脯氨酸的合成，影響骨膠原的生成，而膠原不僅為骨礦化提供重要場所，同時還與骨細胞的發(fā)育、生長和活性調(diào)節(jié)有主要關系，其含量、結構和穩(wěn)定性直接影響到骨微結構和骨力學特性。因此其一旦發(fā)生變化，則會導致骨脆性增強,也可使骨中礦物質(zhì)沉積減少，從而加速骨礦物質(zhì)的溶出，影響骨密度，抑制骨的形成[13-16]。由于骨基質(zhì)結構建成受阻，同時礦物質(zhì)含量下降，從而使骨的生物力學受到影響，大大降低骨的抗變性能力，提高了發(fā)生骨折的幾率[17]。另一方面，D-半乳糖也可與體內(nèi)蛋白生成晚期糖化終末產(chǎn)物AGEs，隨其濃度增加，直接或間接影響成骨細胞、破骨細胞的活性，造成血清鈣磷含量、ALP活性的變化，打破骨形成-骨吸收的動態(tài)平衡狀態(tài)，影響骨重建[18]。與此同時，骨質(zhì)疏松還會引發(fā)體內(nèi)脂代謝紊亂，造成骨髓脂肪細胞增多，引起骨髓腔內(nèi)壓增高而使血流減慢，從而影響骨內(nèi)血供不足，進而加劇骨代謝的抑制作用[19]。與幼齡對照組比較，模型組各項骨質(zhì)指標均存在統(tǒng)計學差異，其變化雖與老齡對照組存在一定差距，但呈現(xiàn)的病程趨勢類似。而經(jīng)過一定時間風流草總醇提物的適量攝入，其模型組的上述指標均有一定的改善。

風流草總醇提物對D-半乳糖導致的衰老模型大鼠血清鈣磷含量有所提高，改善大鼠因D-半乳糖致衰老所誘發(fā)的骨質(zhì)變化。但是流草總醇提物對D-半乳糖導致的衰老模型大鼠起作用的具體機制尚需進一步的深入探討。