李榮科，顏春魯,2△，安方玉,2，劉永琦,2，劉雪松，趙文坤，楊曉蓉

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000； 2. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

泌尿系結(jié)石是泌尿外科的常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重威脅患者的生活質(zhì)量[1]。 研究表明，草酸鈣引起的腎結(jié)石在泌尿系結(jié)石中約占80%左右[2]，其中，自由基堆積引起的氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致草酸鈣結(jié)石發(fā)生的重要原因[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)，腎結(jié)石形成過程中會(huì)發(fā)生超氧化物歧化酶(SOD)活性明顯下降，丙二醛(MDA)含量明顯升高[4]，說明腎結(jié)石形成過程中伴隨著自由基的代謝紊亂。但這種損傷是通過何種信號通路調(diào)控的機(jī)制仍無法解釋。為此，本研究以乙二醇聯(lián)合氯化銨連續(xù)灌胃28 d制作大鼠草酸鈣結(jié)石模型，并用敦煌醫(yī)方瞿麥湯對腎結(jié)石大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察敦煌醫(yī)方瞿麥湯對腎結(jié)石模型鼠Nrf2-NQO1信號通路中Nrf2和NQO1基因表達(dá)的影響，初步揭示敦煌醫(yī)方瞿麥湯的干預(yù)機(jī)制，為敦煌醫(yī)方瞿麥湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物飼養(yǎng)室(合格證號 SCXK(甘)2011-0001)。本實(shí)驗(yàn)已通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 試劑

鈣(Ca2+)試劑盒、磷(P)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為 20171023、20171023、20171105、20171021)；Trizol Reagent 試劑(美國，批號 47123)；GoScript TM Reverse Transcription System 試劑盒和 GoTaq qPCR Master Mix 試劑盒(Promega，批號分別為0000073135和 0000121531)；GAPDH、Nrf2和NQO1引物(均由 TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)并合成)，其序列如下：GAPDH上游引物 5′-TGAAG GTCGCTGTCAACGGA-3′，下游引物 5′-GATGGC ATGGA CTGTGGTCAT-3′；核轉(zhuǎn)錄因子2(Nrf2)：上游引物 5′-TTGGCAGAGACATTCCC ATTTGTA-3'，下游引物 5′-GAGCTATCGAGTGA CTGAGCCTGA-3′′； NAD (P) H 醌氧化還原酶 1(NQO1)上游引物 5′-TGGAAGCTGCAGACCTG GTG-3′，下游引物 5′-CCCTTGTCATACATGGT GGCATAC -3′。

1.3 儀器

FA2004 N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；V1500型可見分光光度計(jì)(上海美析儀器有限公司)；ZY12306型微量加樣器(Scien TiFic公司)；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(jī)(湖南平凡科技有限公司)； Q5000 超微量紫外可見分光光度計(jì)(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；S1000TM Thermal Cycler(BIO-RAD)；7500 Real Time PCR System(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)。

1.4 藥物

瞿麥湯組成：瞿麥15 g，石韋30 g，滑石30 g，石膏30 g等。具體換算方法可以參考文獻(xiàn)[5]，瞿麥湯人常用劑量是105 g/d，換算成標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量大鼠的劑量：105×0.018=1.89 g/鼠，按照大鼠的標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量為200 g，則大鼠的劑量1.89 g×5≈9.45 g/kg。換算成大鼠中劑量：105×0.018×5≈10 g/kg，敦煌醫(yī)方瞿麥湯高、中、低劑量分別為20、10、5 g/kg。腎石通顆粒(修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z22021933，批號Z720382)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

將60只SPF級SD雌性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、腎石通顆粒組、敦煌醫(yī)方瞿麥湯高、中、低劑量組每組各10只。參照文獻(xiàn)[6]，結(jié)石組及干預(yù)組采用1%乙二醇+2%氯化銨的混合液每日2 mL灌胃，連續(xù)28 d；造模同時(shí)給予藥物干預(yù)，腎石通顆粒組給予腎石通顆粒(2.7 g/kg)灌胃治療，敦煌醫(yī)方瞿麥湯組按高、中、低劑量(20、10、5 g/kg)灌胃治療，假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)4周。末次給藥24 h后稱量各組動(dòng)物體質(zhì)量，股動(dòng)脈處死動(dòng)物摘取動(dòng)物的腎臟備用。

2.2 指標(biāo)測定

2.2.1 動(dòng)物體質(zhì)量及腎指數(shù)測定 稱量各組大鼠體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量并計(jì)算腎指數(shù)。腎指數(shù)(mg/g)=腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

2.2.2 血清生化指標(biāo)測定 末次給藥后，股動(dòng)脈采血靜置2～3 h，1500 r/min離心10 min，分離血清。比色分析法檢測血清Ca2+、P含量，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2.3 腎組織SOD活性和MDA含量測定 稱取腎臟200 mg，用1.8 mL生理鹽水研磨組織，制備10%的勻漿液，取上清備用。比色分析法檢測腎組織SOD活性和MDA含量，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2.4 腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達(dá)測定 用RNA抽提試劑提取腎組織RNA，Q5000測定 RNA 含量。按Promega 試劑盒說明書步驟合成 cDNA 第一鏈，按Promega實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒操作說明書進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃、2 min， 變性 95 ℃、15 s，退火 58 ℃、45 s，延伸 60 ℃、 1 min，共 45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品各重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)經(jīng) 2-ΔΔCt處理后進(jìn)行Nrf2和NQO1基因相對表達(dá)量分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠體質(zhì)量及腎指數(shù)的影響

表1示，與空白對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低，腎指數(shù)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，敦煌醫(yī)方瞿麥湯各干預(yù)組大鼠體質(zhì)量明顯升高，腎指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

表1 敦煌醫(yī)方瞿麥湯對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠體質(zhì)量及腎指數(shù)的影響

3.2 對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠血清Ca2+、P含量和腎組織SOD活性、MDA含量的影響

表2示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清Ca2+含量和腎組織MDA含量均顯著升高，SOD活性明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，敦煌醫(yī)方瞿麥湯各干預(yù)組大鼠血清Ca2+含量和腎組織MDA含量均顯著降低，SOD活性均明顯升高(P<0.05)。

表2 敦煌醫(yī)方瞿麥湯對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠血清Ca2+、P含量和腎組織SOD活性、MDA含量的影響

3.3 對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達(dá)的影響

表3示，與空白對照組比較，模型組腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，敦煌醫(yī)方瞿麥湯中、高劑量組大鼠腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

表3 敦煌醫(yī)方瞿麥湯對腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎組織Nrf2和NQO1mRNA表達(dá)的影響

4 討論

泌尿系統(tǒng)結(jié)石是一種發(fā)病機(jī)制未明的多因素疾病，其中尿液中高濃度的草酸鹽和鈣離子結(jié)合形成的草酸鈣是形成尿石癥的重要原因。乙二醇和氯化銨兩類化學(xué)試劑通過不同的作用機(jī)制誘發(fā)腎結(jié)石形成，乙二醇主要通過自身代謝產(chǎn)生的草酸經(jīng)腎小管排泌作用造成腎小管及腎間質(zhì)損害，誘發(fā)腎結(jié)石，氯化銨則是通過酸化尿液促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶的析出而誘發(fā)腎結(jié)石[7]。本實(shí)驗(yàn)采用1%乙二醇+ 2%氯化銨對大鼠進(jìn)行灌胃造模，經(jīng)造模28 d 后可致大鼠血清中Ca2 +含量明顯升高。而經(jīng)敦煌醫(yī)方瞿麥湯治療后不同程度地降低血清中 Ca2 +濃度，抑制大鼠腎草酸鈣結(jié)石。

當(dāng)腎形成草酸鈣結(jié)石以后，會(huì)損傷腎小管上皮細(xì)胞，促使體內(nèi)自由基的產(chǎn)生增加，減弱機(jī)體對自由基的清除能力，從而造成組織結(jié)構(gòu)的損傷。超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶系，主要通過清除機(jī)體的自由基而維持機(jī)體氧化和抗氧化之間的動(dòng)態(tài)平衡，丙二醛(MDA)則是機(jī)體脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物。因此， SOD和MDA是檢測機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性指標(biāo)[4]。在氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控信號通路中，Nrf2/ARE信號通路發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。Nrf2是一種發(fā)揮細(xì)胞自我保護(hù)作用的重要轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2既是生理?xiàng)l件下細(xì)胞自我保護(hù)的轉(zhuǎn)錄因子，還是機(jī)體在病理狀態(tài)下發(fā)揮重要的抗氧化應(yīng)激和防御外源性有毒物質(zhì)入侵的感受器[9]。ARE作為機(jī)體重要的抗氧化反應(yīng)元件發(fā)揮作用。研究證實(shí)，Nrf2與ARE結(jié)合通過啟動(dòng)Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶基因表達(dá)來保護(hù)機(jī)體組織細(xì)胞的正常功能[10]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體 Nrf2 激活A(yù)RE的基因序列，上調(diào)其下游相關(guān)因子NQO1、HO-1、 γ-GCS等表達(dá)，從而發(fā)揮自身抗氧化應(yīng)激的作用[11]。在實(shí)驗(yàn)中，1%乙二醇+ 2% 氯化銨可顯著降低模型組大鼠腎組織SOD活性，Nrf2和NQO1 mRNA的相對表達(dá)，升高其MDA的含量，證明造模劑可造成大鼠腎組織抗氧化功能及自主防御功能的破壞。而給予敦煌醫(yī)方瞿麥湯干預(yù)治療，可提高大鼠腎組織SOD 活性、Nrf2和NQO1 mRNA 的相對表達(dá)，降低其MDA含量，從而減少氧化產(chǎn)物的堆積，提高機(jī)體抗氧化水平，減輕大鼠腎小管的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善腎臟的生理功能。

腎結(jié)石屬于中醫(yī)學(xué)“石淋” “砂淋”等范疇[12]，其病機(jī)主要為濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣滯血瘀等[13]。本研究采用的敦煌醫(yī)方瞿麥湯，主要由瞿麥、石韋、滑石、石膏組成。方中瞿麥具有破血通經(jīng)、清熱利水的功效；石韋具有清肺止咳、涼血止血、利尿通淋之功效；滑石具有清解暑熱、利水通淋的功效；石膏具有清熱瀉火、止血收濕之功效，諸方合用共奏清熱利濕、活血散瘀、通石排淋之功效。上述一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，瞿麥湯對治療腎結(jié)石有效。

綜上所述，敦煌醫(yī)方瞿麥湯可通過降低大鼠血

清Ca2+濃度和上調(diào)Nrf2/NQO1通路相關(guān)功能蛋白表達(dá)，改善腎臟氧化應(yīng)激損傷，抑制草酸鈣結(jié)石的形成，從而發(fā)揮腎損傷的保護(hù)作用。