王 瑋,靳賀超,耿秀超,于文濤,3△,王香婷△,李青敏,董文軍
(1. 北京市海淀區(qū)雙榆樹社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心,北京 100086; 2. 河北中醫(yī)學(xué)院,石家莊 050200;3. 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實驗室,石家莊 050091)
建立合理、科學(xué)的動物模型是深入開展實驗研究的基礎(chǔ),對探討疾病的發(fā)病機(jī)制、評估藥物干預(yù)療效具有重要意義。腎虛血瘀證是血管性癡呆(VD)患者常見的證候類型[1],但目前尚缺乏理想的血管性癡呆腎虛血瘀證病證結(jié)合動物模型。本研究采用高齡大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法,試圖建立腎虛血瘀證VD病證結(jié)合動物模型,通過觀察動物表征及病理組織學(xué)、血清學(xué)等相關(guān)指標(biāo)的變化,對該模型進(jìn)行評價。
SPF級雄性SD大鼠,其中40周齡30只(合格證號11400700220320),體質(zhì)量(619±40) g,使用前飼養(yǎng)至52周齡;8周齡30只(合格證號11400700221664),體質(zhì)量(263±7) g;SPF級雌性SD大鼠8周齡40只(合格證號11400700223106),體質(zhì)量(264±8) g,實驗動物均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(動物許可證號SCXK(京)2016-0011)。本實驗已通過河北中醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審查。
一氧化氮(NO)測試盒(南京建成生物研究所,貨號A012-1);內(nèi)皮素(ET-1)試劑盒(北京北方生物技術(shù)所,貨號D11PZA);雌二醇(E2)放射免疫分析藥盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物公司,貨號RG61706);睪酮(T)放射免疫分析試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物公司,貨號RG41706);骨鈣素(BGP)放射免疫分析試劑盒(北方生物技術(shù)研究所,貨號 G02PZA);鈣(Ca)檢測試劑盒(南京建成生物研究所,貨號 C004-2);磷(P)試劑盒(長春匯力生物技術(shù)公司,貨號 B008)。
ZS-001型Moriss水迷宮,北京眾實迪創(chuàng)科技公司;HM-200型電子天平,日本AND公司;TDL-5-A離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;LBY-N7500B型全自動血流變儀,北京普利生儀器有限公司;DP73型數(shù)碼顯微鏡,日本Olympus 公司。
SD雄性52周齡大鼠隨機(jī)分為高齡模型組和高齡假手術(shù)組各8只;SD雄性8周齡大鼠隨機(jī)分為低齡模型組和低齡假手術(shù)組8只。造模過程中及造模后死亡大鼠及時補(bǔ)充,使各組大鼠數(shù)目維持在8只。
低齡模型組和高齡模型組采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法造模[2]。大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水,10%水合氯醛溶液按400 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉,待翻正反射消失后仰臥位固定于手術(shù)臺,頸前手術(shù)區(qū)域備皮、酒精消毒,行頸前正中切口,鈍性分離皮下結(jié)締組織及頸前肌群,避開迷走神經(jīng)分離雙側(cè)頸總動脈,用手術(shù)絲線結(jié)扎,逐層縫合皮膚,術(shù)后連續(xù)3 d肌注硫酸慶大霉素。低齡假手術(shù)組與高齡假手術(shù)組行頸前切口,分離雙側(cè)頸總動脈不予結(jié)扎。
各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng),充足食水,每日觀察并記錄大鼠精神活動(喜動喜靜,活動靈活度,反應(yīng)靈敏度,應(yīng)激能力,攻擊行為,是否喜扎堆等)、體態(tài)(是否縮肩拱背、瞇眼等)、皮毛(光澤度,有無豎毛、枯疏、晦暗)、舌質(zhì);尾色(顏色,有無褐斑)、采食量及飲水量、大便(正常/稀溏/干燥)和體質(zhì)量變化等情況。
術(shù)后3周每組大鼠隨機(jī)抽取5只雄鼠。每只雄鼠配2只8周齡雌鼠,每晚18∶00合籠喂養(yǎng),第2天早晨8∶00觀察雌鼠陰栓,將發(fā)現(xiàn)陰道栓之日確定為妊娠第 1 天,并取出雌鼠單籠喂養(yǎng),連續(xù)觀察1周,統(tǒng)計受孕雌鼠數(shù)目及每只雌鼠產(chǎn)仔數(shù)。
術(shù)后4周進(jìn)行Morris水迷宮實驗。測試時間為6 d,1~5 d進(jìn)行定位航行試驗,將大鼠從東西南北4 個象限放入水中,分析系統(tǒng)自動記錄2 min內(nèi)大鼠找到平臺位置時間,即逃避潛伏期。第6天進(jìn)行空間探索實驗,移除實驗平臺將大鼠放入水中任選一入水點(diǎn),記錄大鼠2 min內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)及停留時間,以測試大鼠空間探索能力。
水迷宮結(jié)束后各組大鼠麻醉,下腹部行V字型切口暴露腹腔,找出睪丸組織剝離輸精管及附睪,剪下左側(cè)睪丸稱重,按公式[睪丸指數(shù)=睪丸濕重(g)/大鼠體質(zhì)量(kg)]計算睪丸指數(shù)。
各組大鼠斷頭取血10 ml,用于血清學(xué)指標(biāo)檢測。冰盤上迅速剝離出腦組織,4%多聚甲醛中固定,乙醇逐級脫水,浸臘包埋、切片,尼氏染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察腦海馬病理形態(tài)變化。
取血2 ml肝素鈉抗凝,用全自動血流變儀測定全血還原黏度(低、中、高切)、血漿還原黏度(低、中、高切)和聚集指數(shù)等指標(biāo)。
取血5 ml分離血清,采用硝酸還原酶法檢測NO水平,采用放免法檢測ET-1、T、E2、BGP水平,采用化學(xué)法檢測Ca水平,采用紫外比色法檢測P水平。
圖1示,低齡假手術(shù)組大鼠喜動,反應(yīng)靈活,體毛有光澤,無瞇眼,抗激能力強(qiáng),舌質(zhì)鮮紅潤澤、較短,采食量及飲水量正常,大便正常;低齡模型組大鼠活動不靈活,反應(yīng)遲鈍,體毛不光澤,單側(cè)瞇眼,弓背,尾巴有黃褐色斑,舌質(zhì)暗紅,飲食量減少,體質(zhì)量增加緩慢,大便或干或稀有惡臭;高齡假手術(shù)組大鼠喜靜,反應(yīng)遲緩,攻擊行為減少,喜扎堆,體毛發(fā)黃晦暗無光澤,無瞇眼,抗激能力弱,尾巴黃褐色斑顏色較低齡假手術(shù)組加深,舌質(zhì)暗紅,舌根處明顯,飲食量及飲水量減少,大便干燥;高齡模型組大鼠瞇眼,自主活動減少,喜臥,行動遲緩,反應(yīng)遲鈍,攻擊性行為減少,腰背蜷縮,喜扎堆,體毛枯疏、晦暗或發(fā)黃無光澤,尾巴有不同程度紫或黃褐色的斑,舌質(zhì)紫暗,飲食量減少,體質(zhì)量增加緩慢,半數(shù)以上大鼠糞便干燥,少數(shù)大鼠呈稀便且有惡臭。
圖1 各組大鼠表征變化比較
表1示,與低齡假手術(shù)組比較,低齡模型組大鼠與高齡模型組逃避潛伏期延長,穿越原平臺次數(shù)及在原平臺停留時間均顯著縮短(P<0.05或P<0.01),高齡假手術(shù)組大鼠穿越原平臺次數(shù)及在原平臺停留時間均減少(P<0.05);與高齡假手術(shù)組比較,高齡模型組逃避潛伏期顯著延長,穿越原平臺次數(shù)及在原平臺停留時間顯著縮短(P<0.01);與低齡模型組比較,高齡模型組逃避潛伏期顯著延長,穿越原平臺次數(shù)及在原平臺停留時間顯著縮短(P<0.05或P<0.01)。
表1 各組大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力比較
表2示,與低齡假手術(shù)組比較,低齡模型組產(chǎn)仔數(shù)顯著降低(P<0.01),高齡假手術(shù)組睪丸指數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)顯著降低(P<0.01),高齡模型組受孕雌鼠數(shù)、睪丸指數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)顯著降低(P<0.05或P<0.01);與低齡模型組比較,高齡模型組睪丸指數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)均顯著降低(P<0.01)。
表2 各組大鼠生殖功能比較
圖2示,低齡假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)可見,椎體細(xì)胞排列致密,層次分明有序,細(xì)胞形狀規(guī)則,細(xì)胞核圓而大,核仁清晰,胞漿內(nèi)Nissl小體體積大,數(shù)量多,神經(jīng)纖維密集,排列整齊,深染;低齡模型組大鼠海馬CA1區(qū)可見椎體細(xì)胞層次減少,排列無序,細(xì)胞間隙增大,部分脫失,胞漿內(nèi)Nissl小體數(shù)量顯著減少,細(xì)胞核體積變小,結(jié)構(gòu)不清,呈核固縮表現(xiàn),形狀不規(guī)則,染色變淺,神經(jīng)纖維排列雜亂;高齡假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)可見椎體細(xì)胞較低齡假手術(shù)組數(shù)量減少,細(xì)胞間隙增大,胞漿內(nèi)Nissl小體數(shù)量明顯減少,神經(jīng)纖維排列較整齊,部分細(xì)胞核有固縮現(xiàn)象;高齡假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)可見椎體細(xì)胞減少甚至消失,排列稀疏,明顯脫失,胞漿內(nèi)Nissl小體消失,神經(jīng)纖維紊亂排列,細(xì)胞核縮小,形狀呈三角或多角形。
表3示,與低齡假手術(shù)組比較,低齡模型組與高齡模型組全血還原黏度(低切、中切)、血漿還原黏度(低切、中切)、聚集指數(shù)水平均顯著上升(P<0.05或P<0.01),高齡模型組全血還原黏度(高切)和血漿還原黏度(高切)水平顯著上升(P<0.05);與高齡假手術(shù)組比較,高齡模型組全血還原黏度(低切、中切、高切)、血漿還原黏度(低切、中切、高切)水平和聚集指數(shù)水平均顯著升高(P<0.01)。
表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較
表4示,與低齡假手術(shù)組比較,低齡模型組、高齡假手術(shù)組與高齡模型組NO和T水平顯著降低,ET-1水平顯著升高(P<0.05 或P<0.01),高齡模型組E2水平顯著下降(P<0.05 或P<0.01);與高齡假手術(shù)組比較,高齡模型組NO水平降低,ET-1水平升高(P<0.05);與低齡模型組比較,高齡模型組NO和T水平降低,ET-1水平升高(P<0.05或P<0.01)。
注:A.低齡假手術(shù)組;B.低齡模型組;C.高齡假手術(shù)組;D.高齡模型組圖2 各組大鼠海馬病理形態(tài)比較(NISSL×200)
表4 各組大鼠血清NO、ET-1、E2、T水平比較
表5示,與低齡假手術(shù)組比較,高齡模型組Ca和BGP水平顯著下降,P水平顯著升高(P<0.05);與高齡假手術(shù)組比較,高齡模型組Ca和BGP水平顯著降低,P水平顯著升高(P<0.05)。
表5 各組大鼠血清Ca, P和BGP水平比較
國內(nèi)外有多種VD動物模型的制備方法,其中雙側(cè)頸總動脈阻斷法(2-VO)是一種常見的造模方法,腦組織缺血導(dǎo)致神經(jīng)元損害為VD病理機(jī)制,其中腦海馬對缺血缺氧尤為敏感,為導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的重要原因[3]。該方法通過結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈造成大鼠全腦持續(xù)性血供減少,慢性腦灌注不足,腦皮質(zhì)及腦海馬區(qū)域?qū)θ毖該p傷尤為敏感,從而導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。該方法手術(shù)操作簡單,創(chuàng)傷較小且大鼠術(shù)后死亡率低,與臨床腦缺血導(dǎo)致VD機(jī)制一致[2]。疾病模型雖能較好地模擬疾病發(fā)生的病理過程,但無法反映中醫(yī)證候特點(diǎn)和中醫(yī)藥治療優(yōu)勢,因此制備病證結(jié)合模型,對于評估中藥干預(yù)療效、探討中藥作用機(jī)制具有重要意義。課題組前期的研究表明[4], 腎精虧虛證和瘀血阻絡(luò)證是VD患者中常見的證候類型,而腎精虧虛證和瘀血阻絡(luò)證(即腎虛血瘀證)是常見的證候組合形式。目前腎虛血瘀證候模型的制備,多采用血瘀證動物模型疊加腎虛證動物模型的方法,如郭爾楚等[5]采用腹腔注射氫化可的松與腎上腺素的方法,復(fù)制腎虛血瘀證樹鼩動物模型,但該模型形成機(jī)制與人類證候的形成機(jī)制差異較大。
本研究采用52周高齡大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎,試圖建立VD腎虛血瘀證病證結(jié)合模型。高齡大鼠與VD中老年人患病率較高的臨床特點(diǎn)相一致,雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎,可造成慢性全腦缺血,符合VD的病因?qū)W特點(diǎn)。動物表征顯示,低齡模型組和高齡模型組均可出現(xiàn)活動不靈活、反應(yīng)遲鈍、大便異常等表現(xiàn),高齡模型大鼠具有體毛晦暗、舌質(zhì)紫暗、尾巴有不同程度紫或黃褐色斑等瘀血阻絡(luò)特點(diǎn),同時具有體質(zhì)量增長緩慢、自主活動減少、喜臥、腰背蜷縮、體毛枯疏等腎精虧虛特點(diǎn)。
中醫(yī)認(rèn)為腎藏精,精生髓充腦,主生殖和生長發(fā)育,腎精虧虛可出現(xiàn)生殖功能低下、生長發(fā)育遲緩等表現(xiàn)?!端貑枴ど瞎盘煺嬲撈氛摷澳凶游灏恕澳I氣衰,發(fā)墜齒槁”,年齡增長而伴隨的腎精不足是導(dǎo)致腦衰老的重要原因。俞征宇等調(diào)查了878例中老年人,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎虛證候發(fā)生率隨著年齡增長而顯著升高[6]。研究表明,腎虛與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(HPAT)的功能失調(diào)有密切聯(lián)系,HPAT軸功能紊亂、骨代謝異常是腎虛的兩個主要方面[7],受孕雌鼠數(shù)[8]、睪丸指數(shù)、產(chǎn)仔數(shù)均可反映大鼠生殖能力。E2、T為反映性腺軸功能的指標(biāo),E2可增加腦血流量,促進(jìn)損傷的腦細(xì)胞修復(fù),增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)元功能進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶能力[9]。T與認(rèn)知能力關(guān)系密切,有利于提高記憶力和空間認(rèn)知力,并可改善短期及長期健忘癥的記憶功能[10]。老年人普遍存在“生理性腎虛”狀態(tài),E2、T較青壯年降低,而VD患者下降更加明顯,且與癡呆嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。BGP是由成骨細(xì)胞合成并分泌的能結(jié)合鈣離子的非膠原蛋白,為反映骨代謝的特異性指標(biāo),血清中BGP水平與骨組織中BGP含量呈正相關(guān)[12],是骨質(zhì)礦化的特殊標(biāo)志物。Ca是骨質(zhì)礦化的基本物質(zhì),P可促進(jìn)骨礦物質(zhì)沉積和骨基質(zhì)的合成,改變骨細(xì)胞對Ca的攝入,體內(nèi)Ca與P受內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié),從而在一定范圍內(nèi)保持平衡[13]。本研究表明,與低齡假手術(shù)組比較,低齡模型組和高齡模型組大鼠均表現(xiàn)產(chǎn)仔數(shù)顯著減少,T水平顯著降低,體質(zhì)量增加緩慢,但高齡模型組大鼠同時表現(xiàn)為受孕雌鼠數(shù)顯著減少,睪丸指數(shù)顯著降低,E2、Ca及BGP水平均顯著降低,同時與腎精虧虛證所表現(xiàn)的生長發(fā)育遲緩、生殖功能低下、腎主骨功能低下的證候特點(diǎn)一致,說明高齡模型組大鼠腎虛表現(xiàn)更為顯著。這也與中醫(yī)“年過四十,而陰氣自半”,腎精隨著年齡而自然衰減的認(rèn)識相一致。
本研究中,2-VO手術(shù)本身可使實驗大鼠出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),表現(xiàn)為高凝狀態(tài)及高黏滯狀態(tài)[6]。血瘀證時血行不暢,脈道擁塞,機(jī)體血液動力學(xué)發(fā)生改變,血液流變學(xué)相應(yīng)表現(xiàn)出“黏”“凝”“濃”“聚”等特點(diǎn)[14]。NO和ET-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一對血管舒縮因子,當(dāng)血管內(nèi)皮損傷時,NO生成與釋放減少,導(dǎo)致血管舒張功能障礙,加速血小板的聚集與黏附,并刺激內(nèi)皮細(xì)胞生成釋放過多的ET-1。ET-1是一種具有收縮血管作用的多肽,NO與ET-1之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致血管舒縮功能異常,血小板聚集,內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增加,炎癥因子生成,最終導(dǎo)致血液高凝狀態(tài)[15]。本研究表明,低齡模型組和高齡模型組大鼠均存在血液流變學(xué)指標(biāo)異常、NO水平降低、ET-1水平升高,說明這兩種模型均符合中醫(yī)瘀血阻絡(luò)證所表現(xiàn)的證候特點(diǎn)。
綜合上述,高齡模型組大鼠在動物表征、微觀指標(biāo)變化上,與腎虛血瘀絡(luò)證候特點(diǎn)相一致。但該模型也存在不足,如采用高齡大鼠造模會導(dǎo)致動物死亡率升高,可能限制該模型的推廣應(yīng)用。另外在評價指標(biāo)上,未對各組大鼠骨密質(zhì)情況進(jìn)行比較,也未對該模型進(jìn)行補(bǔ)腎活血方藥的干預(yù)反證,今后尚需對該模型開展深入評價。