王 瑋，靳賀超，耿秀超，于文濤,3△，王香婷△，李青敏，董文軍

(1. 北京市海淀區(qū)雙榆樹社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100086； 2. 河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200；3. 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實驗室，石家莊 050091)

建立合理、科學(xué)的動物模型是深入開展實驗研究的基礎(chǔ)，對探討疾病的發(fā)病機(jī)制、評估藥物干預(yù)療效具有重要意義。腎虛血瘀證是血管性癡呆(VD)患者常見的證候類型[1]，但目前尚缺乏理想的血管性癡呆腎虛血瘀證病證結(jié)合動物模型。本研究采用高齡大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法，試圖建立腎虛血瘀證VD病證結(jié)合動物模型，通過觀察動物表征及病理組織學(xué)、血清學(xué)等相關(guān)指標(biāo)的變化，對該模型進(jìn)行評價。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，其中40周齡30只(合格證號11400700220320)，體質(zhì)量(619±40) g，使用前飼養(yǎng)至52周齡；8周齡30只(合格證號11400700221664)，體質(zhì)量(263±7) g；SPF級雌性SD大鼠8周齡40只(合格證號11400700223106)，體質(zhì)量(264±8) g，實驗動物均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(動物許可證號SCXK(京)2016-0011)。本實驗已通過河北中醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審查。

1.2 主要試劑

一氧化氮(NO)測試盒(南京建成生物研究所,貨號A012-1)；內(nèi)皮素(ET-1)試劑盒(北京北方生物技術(shù)所,貨號D11PZA)；雌二醇(E2)放射免疫分析藥盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物公司,貨號RG61706)；睪酮(T)放射免疫分析試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物公司,貨號RG41706)；骨鈣素(BGP)放射免疫分析試劑盒(北方生物技術(shù)研究所,貨號 G02PZA)；鈣(Ca)檢測試劑盒(南京建成生物研究所,貨號 C004-2)；磷(P)試劑盒(長春匯力生物技術(shù)公司,貨號 B008)。

1.3 主要儀器

ZS-001型Moriss水迷宮,北京眾實迪創(chuàng)科技公司；HM-200型電子天平，日本AND公司；TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LBY-N7500B型全自動血流變儀，北京普利生儀器有限公司；DP73型數(shù)碼顯微鏡，日本Olympus 公司。

2 方法

2.1 動物分組

SD雄性52周齡大鼠隨機(jī)分為高齡模型組和高齡假手術(shù)組各8只；SD雄性8周齡大鼠隨機(jī)分為低齡模型組和低齡假手術(shù)組8只。造模過程中及造模后死亡大鼠及時補(bǔ)充，使各組大鼠數(shù)目維持在8只。

2.2 模型建立

低齡模型組和高齡模型組采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法造模[2]。大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛溶液按400 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉，待翻正反射消失后仰臥位固定于手術(shù)臺，頸前手術(shù)區(qū)域備皮、酒精消毒，行頸前正中切口，鈍性分離皮下結(jié)締組織及頸前肌群，避開迷走神經(jīng)分離雙側(cè)頸總動脈，用手術(shù)絲線結(jié)扎，逐層縫合皮膚，術(shù)后連續(xù)3 d肌注硫酸慶大霉素。低齡假手術(shù)組與高齡假手術(shù)組行頸前切口，分離雙側(cè)頸總動脈不予結(jié)扎。

2.3 大鼠表征觀察

各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，充足食水，每日觀察并記錄大鼠精神活動(喜動喜靜，活動靈活度，反應(yīng)靈敏度，應(yīng)激能力，攻擊行為，是否喜扎堆等)、體態(tài)(是否縮肩拱背、瞇眼等)、皮毛(光澤度，有無豎毛、枯疏、晦暗)、舌質(zhì)；尾色(顏色，有無褐斑)、采食量及飲水量、大便(正常/稀溏/干燥)和體質(zhì)量變化等情況。

2.4 雌鼠受孕數(shù)、產(chǎn)仔數(shù)觀察

術(shù)后3周每組大鼠隨機(jī)抽取5只雄鼠。每只雄鼠配2只8周齡雌鼠，每晚18∶00合籠喂養(yǎng)，第2天早晨8∶00觀察雌鼠陰栓，將發(fā)現(xiàn)陰道栓之日確定為妊娠第 1 天，并取出雌鼠單籠喂養(yǎng)，連續(xù)觀察1周，統(tǒng)計受孕雌鼠數(shù)目及每只雌鼠產(chǎn)仔數(shù)。

2.5 水迷宮行為學(xué)檢測

術(shù)后4周進(jìn)行Morris水迷宮實驗。測試時間為6 d，1～5 d進(jìn)行定位航行試驗，將大鼠從東西南北4 個象限放入水中，分析系統(tǒng)自動記錄2 min內(nèi)大鼠找到平臺位置時間，即逃避潛伏期。第6天進(jìn)行空間探索實驗，移除實驗平臺將大鼠放入水中任選一入水點(diǎn)，記錄大鼠2 min內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)及停留時間，以測試大鼠空間探索能力。

2.6 雄鼠睪丸重量指數(shù)檢測

水迷宮結(jié)束后各組大鼠麻醉，下腹部行V字型切口暴露腹腔，找出睪丸組織剝離輸精管及附睪，剪下左側(cè)睪丸稱重，按公式[睪丸指數(shù)=睪丸濕重(g)/大鼠體質(zhì)量(kg)]計算睪丸指數(shù)。

2.7 海馬病理形態(tài)觀察

各組大鼠斷頭取血10 ml，用于血清學(xué)指標(biāo)檢測。冰盤上迅速剝離出腦組織，4%多聚甲醛中固定，乙醇逐級脫水，浸臘包埋、切片，尼氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腦海馬病理形態(tài)變化。

2.8 血液流變學(xué)檢測

取血2 ml肝素鈉抗凝，用全自動血流變儀測定全血還原黏度(低、中、高切)、血漿還原黏度(低、中、高切)和聚集指數(shù)等指標(biāo)。

2.9 血清NO、ET-1、T、E2、Ca、P、BGP水平檢測

取血5 ml分離血清，采用硝酸還原酶法檢測NO水平，采用放免法檢測ET-1、T、E2、BGP水平，采用化學(xué)法檢測Ca水平，采用紫外比色法檢測P水平。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠表征變化

圖1示，低齡假手術(shù)組大鼠喜動，反應(yīng)靈活，體毛有光澤，無瞇眼，抗激能力強(qiáng)，舌質(zhì)鮮紅潤澤、較短，采食量及飲水量正常，大便正常;低齡模型組大鼠活動不靈活，反應(yīng)遲鈍，體毛不光澤，單側(cè)瞇眼，弓背，尾巴有黃褐色斑，舌質(zhì)暗紅，飲食量減少，體質(zhì)量增加緩慢，大便或干或稀有惡臭；高齡假手術(shù)組大鼠喜靜，反應(yīng)遲緩，攻擊行為減少，喜扎堆，體毛發(fā)黃晦暗無光澤，無瞇眼，抗激能力弱，尾巴黃褐色斑顏色較低齡假手術(shù)組加深，舌質(zhì)暗紅，舌根處明顯，飲食量及飲水量減少，大便干燥；高齡模型組大鼠瞇眼，自主活動減少，喜臥，行動遲緩，反應(yīng)遲鈍，攻擊性行為減少，腰背蜷縮，喜扎堆，體毛枯疏、晦暗或發(fā)黃無光澤，尾巴有不同程度紫或黃褐色的斑，舌質(zhì)紫暗，飲食量減少，體質(zhì)量增加緩慢，半數(shù)以上大鼠糞便干燥，少數(shù)大鼠呈稀便且有惡臭。

圖1 各組大鼠表征變化比較

3.2 空間記憶學(xué)習(xí)能力變化

表1示，與低齡假手術(shù)組比較，低齡模型組大鼠與高齡模型組逃避潛伏期延長，穿越原平臺次數(shù)及在原平臺停留時間均顯著縮短(P<0.05或P<0.01)，高齡假手術(shù)組大鼠穿越原平臺次數(shù)及在原平臺停留時間均減少(P<0.05)；與高齡假手術(shù)組比較，高齡模型組逃避潛伏期顯著延長，穿越原平臺次數(shù)及在原平臺停留時間顯著縮短(P<0.01)；與低齡模型組比較，高齡模型組逃避潛伏期顯著延長，穿越原平臺次數(shù)及在原平臺停留時間顯著縮短(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力比較

3.3 生殖功能變化

表2示，與低齡假手術(shù)組比較，低齡模型組產(chǎn)仔數(shù)顯著降低(P<0.01)，高齡假手術(shù)組睪丸指數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)顯著降低(P<0.01)，高齡模型組受孕雌鼠數(shù)、睪丸指數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與低齡模型組比較，高齡模型組睪丸指數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)均顯著降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠生殖功能比較

3.4 腦海馬病理形態(tài)觀察

圖2示，低齡假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)可見，椎體細(xì)胞排列致密，層次分明有序，細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰，胞漿內(nèi)Nissl小體體積大，數(shù)量多，神經(jīng)纖維密集，排列整齊，深染；低齡模型組大鼠海馬CA1區(qū)可見椎體細(xì)胞層次減少，排列無序，細(xì)胞間隙增大，部分脫失，胞漿內(nèi)Nissl小體數(shù)量顯著減少，細(xì)胞核體積變小，結(jié)構(gòu)不清，呈核固縮表現(xiàn)，形狀不規(guī)則，染色變淺，神經(jīng)纖維排列雜亂；高齡假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)可見椎體細(xì)胞較低齡假手術(shù)組數(shù)量減少，細(xì)胞間隙增大，胞漿內(nèi)Nissl小體數(shù)量明顯減少，神經(jīng)纖維排列較整齊，部分細(xì)胞核有固縮現(xiàn)象；高齡假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)可見椎體細(xì)胞減少甚至消失，排列稀疏，明顯脫失，胞漿內(nèi)Nissl小體消失，神經(jīng)纖維紊亂排列，細(xì)胞核縮小，形狀呈三角或多角形。

3.5 血液流變學(xué)指標(biāo)變化

表3示，與低齡假手術(shù)組比較，低齡模型組與高齡模型組全血還原黏度(低切、中切)、血漿還原黏度(低切、中切)、聚集指數(shù)水平均顯著上升(P<0.05或P<0.01)，高齡模型組全血還原黏度(高切)和血漿還原黏度(高切)水平顯著上升(P<0.05)；與高齡假手術(shù)組比較，高齡模型組全血還原黏度(低切、中切、高切)、血漿還原黏度(低切、中切、高切)水平和聚集指數(shù)水平均顯著升高(P<0.01)。

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較

3.6 各組大鼠血清NO、ET-1、E2、T水平變化

表4示，與低齡假手術(shù)組比較，低齡模型組、高齡假手術(shù)組與高齡模型組NO和T水平顯著降低，ET-1水平顯著升高(P<0.05 或P<0.01)，高齡模型組E2水平顯著下降(P<0.05 或P<0.01)；與高齡假手術(shù)組比較，高齡模型組NO水平降低，ET-1水平升高(P<0.05)；與低齡模型組比較，高齡模型組NO和T水平降低，ET-1水平升高(P<0.05或P<0.01)。

注：A.低齡假手術(shù)組；B.低齡模型組；C.高齡假手術(shù)組；D.高齡模型組圖2 各組大鼠海馬病理形態(tài)比較(NISSL×200)

表4 各組大鼠血清NO、ET-1、E2、T水平比較

3.7 各組大鼠血清Ca、P和BGP水平的變化

表5示，與低齡假手術(shù)組比較，高齡模型組Ca和BGP水平顯著下降，P水平顯著升高(P<0.05)；與高齡假手術(shù)組比較，高齡模型組Ca和BGP水平顯著降低，P水平顯著升高(P<0.05)。

表5 各組大鼠血清Ca, P和BGP水平比較

4 討論

國內(nèi)外有多種VD動物模型的制備方法，其中雙側(cè)頸總動脈阻斷法(2-VO)是一種常見的造模方法，腦組織缺血導(dǎo)致神經(jīng)元損害為VD病理機(jī)制，其中腦海馬對缺血缺氧尤為敏感，為導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的重要原因[3]。該方法通過結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈造成大鼠全腦持續(xù)性血供減少，慢性腦灌注不足，腦皮質(zhì)及腦海馬區(qū)域?qū)θ毖該p傷尤為敏感，從而導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。該方法手術(shù)操作簡單，創(chuàng)傷較小且大鼠術(shù)后死亡率低，與臨床腦缺血導(dǎo)致VD機(jī)制一致[2]。疾病模型雖能較好地模擬疾病發(fā)生的病理過程，但無法反映中醫(yī)證候特點(diǎn)和中醫(yī)藥治療優(yōu)勢，因此制備病證結(jié)合模型，對于評估中藥干預(yù)療效、探討中藥作用機(jī)制具有重要意義。課題組前期的研究表明[4], 腎精虧虛證和瘀血阻絡(luò)證是VD患者中常見的證候類型，而腎精虧虛證和瘀血阻絡(luò)證(即腎虛血瘀證)是常見的證候組合形式。目前腎虛血瘀證候模型的制備，多采用血瘀證動物模型疊加腎虛證動物模型的方法，如郭爾楚等[5]采用腹腔注射氫化可的松與腎上腺素的方法，復(fù)制腎虛血瘀證樹鼩動物模型，但該模型形成機(jī)制與人類證候的形成機(jī)制差異較大。

本研究采用52周高齡大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎，試圖建立VD腎虛血瘀證病證結(jié)合模型。高齡大鼠與VD中老年人患病率較高的臨床特點(diǎn)相一致，雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎，可造成慢性全腦缺血，符合VD的病因?qū)W特點(diǎn)。動物表征顯示，低齡模型組和高齡模型組均可出現(xiàn)活動不靈活、反應(yīng)遲鈍、大便異常等表現(xiàn)，高齡模型大鼠具有體毛晦暗、舌質(zhì)紫暗、尾巴有不同程度紫或黃褐色斑等瘀血阻絡(luò)特點(diǎn)，同時具有體質(zhì)量增長緩慢、自主活動減少、喜臥、腰背蜷縮、體毛枯疏等腎精虧虛特點(diǎn)。

中醫(yī)認(rèn)為腎藏精，精生髓充腦，主生殖和生長發(fā)育，腎精虧虛可出現(xiàn)生殖功能低下、生長發(fā)育遲緩等表現(xiàn)?！端貑枴ど瞎盘煺嬲撈氛摷澳凶游灏恕澳I氣衰，發(fā)墜齒槁”，年齡增長而伴隨的腎精不足是導(dǎo)致腦衰老的重要原因。俞征宇等調(diào)查了878例中老年人，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎虛證候發(fā)生率隨著年齡增長而顯著升高[6]。研究表明，腎虛與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(HPAT)的功能失調(diào)有密切聯(lián)系，HPAT軸功能紊亂、骨代謝異常是腎虛的兩個主要方面[7]，受孕雌鼠數(shù)[8]、睪丸指數(shù)、產(chǎn)仔數(shù)均可反映大鼠生殖能力。E2、T為反映性腺軸功能的指標(biāo)，E2可增加腦血流量，促進(jìn)損傷的腦細(xì)胞修復(fù)，增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)元功能進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶能力[9]。T與認(rèn)知能力關(guān)系密切，有利于提高記憶力和空間認(rèn)知力，并可改善短期及長期健忘癥的記憶功能[10]。老年人普遍存在“生理性腎虛”狀態(tài)，E2、T較青壯年降低，而VD患者下降更加明顯，且與癡呆嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。BGP是由成骨細(xì)胞合成并分泌的能結(jié)合鈣離子的非膠原蛋白，為反映骨代謝的特異性指標(biāo)，血清中BGP水平與骨組織中BGP含量呈正相關(guān)[12]，是骨質(zhì)礦化的特殊標(biāo)志物。Ca是骨質(zhì)礦化的基本物質(zhì)，P可促進(jìn)骨礦物質(zhì)沉積和骨基質(zhì)的合成，改變骨細(xì)胞對Ca的攝入，體內(nèi)Ca與P受內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié)，從而在一定范圍內(nèi)保持平衡[13]。本研究表明，與低齡假手術(shù)組比較，低齡模型組和高齡模型組大鼠均表現(xiàn)產(chǎn)仔數(shù)顯著減少，T水平顯著降低，體質(zhì)量增加緩慢，但高齡模型組大鼠同時表現(xiàn)為受孕雌鼠數(shù)顯著減少，睪丸指數(shù)顯著降低，E2、Ca及BGP水平均顯著降低，同時與腎精虧虛證所表現(xiàn)的生長發(fā)育遲緩、生殖功能低下、腎主骨功能低下的證候特點(diǎn)一致，說明高齡模型組大鼠腎虛表現(xiàn)更為顯著。這也與中醫(yī)“年過四十，而陰氣自半”，腎精隨著年齡而自然衰減的認(rèn)識相一致。

本研究中，2-VO手術(shù)本身可使實驗大鼠出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為高凝狀態(tài)及高黏滯狀態(tài)[6]。血瘀證時血行不暢，脈道擁塞，機(jī)體血液動力學(xué)發(fā)生改變，血液流變學(xué)相應(yīng)表現(xiàn)出“黏”“凝”“濃”“聚”等特點(diǎn)[14]。NO和ET-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一對血管舒縮因子，當(dāng)血管內(nèi)皮損傷時，NO生成與釋放減少，導(dǎo)致血管舒張功能障礙，加速血小板的聚集與黏附，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞生成釋放過多的ET-1。ET-1是一種具有收縮血管作用的多肽，NO與ET-1之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致血管舒縮功能異常，血小板聚集，內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增加，炎癥因子生成，最終導(dǎo)致血液高凝狀態(tài)[15]。本研究表明，低齡模型組和高齡模型組大鼠均存在血液流變學(xué)指標(biāo)異常、NO水平降低、ET-1水平升高，說明這兩種模型均符合中醫(yī)瘀血阻絡(luò)證所表現(xiàn)的證候特點(diǎn)。

綜合上述，高齡模型組大鼠在動物表征、微觀指標(biāo)變化上，與腎虛血瘀絡(luò)證候特點(diǎn)相一致。但該模型也存在不足，如采用高齡大鼠造模會導(dǎo)致動物死亡率升高，可能限制該模型的推廣應(yīng)用。另外在評價指標(biāo)上，未對各組大鼠骨密質(zhì)情況進(jìn)行比較，也未對該模型進(jìn)行補(bǔ)腎活血方藥的干預(yù)反證，今后尚需對該模型開展深入評價。