張超穎，苗紀(jì)飛，劉 霞，許 沁，葉 森，溫 泉，梅麗艷，葉 芃，李 春，黎 暉△

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006； 2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550025)

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是一種最常見的內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分，在人體內(nèi)革蘭氏陰性菌感染引起的細(xì)菌毒性反應(yīng)中，作為內(nèi)毒素可以刺激免疫炎癥反應(yīng)。LPS處理巨噬細(xì)胞系RAW264.7是一種常用的模擬內(nèi)毒素刺激免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)的細(xì)胞模型[1]。自噬是指細(xì)胞受到信號誘導(dǎo)后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生膜，膜包裹部分細(xì)胞質(zhì)與需要降解的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)融合形成自噬體(Autophagosome)，最后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體(Autolysosome)降解其所包含的內(nèi)容物的過程[2]，其與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等活動有關(guān)并影響細(xì)胞的生理功能。雷帕霉素可以刺激巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬流蛋白活性，加速巨噬細(xì)胞對病原體的清除。如果巨噬細(xì)胞活性降低則自噬活動降低，細(xì)菌不能很快地清除導(dǎo)致感染持續(xù)發(fā)生。炎癥細(xì)胞因子可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞活性增加，促進(jìn)自噬從而清除病原體，但過多的炎癥細(xì)胞因子導(dǎo)致炎癥風(fēng)暴則嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體，丹皮酚和雷帕霉素聯(lián)合使用則可以促進(jìn)自噬，清除病原體，同時減少炎癥風(fēng)暴的發(fā)生。LPS刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生的白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)等炎性因子，可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬活性，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[3]。

丹皮酚是從毛茛科芍藥屬植物芍藥、牡丹的根皮以及蘿藦科植物干燥根或全草中提取出的活性成分[4]。既往研究表明，丹皮酚能夠?qū)PS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生的炎性因子有廣泛的抑制作用[5-6]。本實驗以 LPS 刺激的 RAW264.7 細(xì)胞為主要模型，以自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素促進(jìn)自噬，研究丹皮酚對RAW264.7自噬與免疫功能的影響，探索丹皮等中藥調(diào)控固有免疫反應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑

丹皮酚購自廣州市藥檢所；雷帕霉素(553211)、LPS(L4391)均購自Sigma公司； Anti-GAPDH抗體(BM3896)購自武漢博士德生物公司；Anti-LC3B(abcam243506)、Anti-p62(abcam56416)、Anti-TNF-α(abcam9579)、Anti-IL-1β(abcam156791)、Anti-Beclin(abcam114071)、Anti-Cy3(abcam 97035)、熒光染料DAPI(abcam104139)等均購自美國abcam公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基(11965092)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，10270-106)均購自Gibco。

1.2 細(xì)胞株

小鼠單核巨噬細(xì)胞株 RAW264.7 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3 儀器

超凈臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(德國 Heraeus公司)；GL-16G型離心機(jī)(上海安亭公司)；XDS-1B 型倒置顯微鏡(重慶光電公司)；制冰機(jī)(Scotsman 思科特曼)；低溫離心機(jī) Labogene 低溫超速離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)；酶標(biāo)儀(瑞典TECAN公司)。電泳儀(BIO-RAD)；轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD)；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

表1示，RAW264.7細(xì)胞在含10%胎牛血清的新鮮高糖DMEM完全培養(yǎng)基，5% CO2，37 ℃恒溫，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長情況，2～3 d換液1次，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右按1∶3 傳代。取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，將細(xì)胞按1×105/孔接種于對應(yīng)容器中，培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基按分組更換為含藥物的無血清培養(yǎng)基，作用24 h后分別收集上清和細(xì)胞進(jìn)行檢測。

表1 實驗分組及加藥情況比較

2.2 蛋白免疫印跡法(western blot，WB)檢測自噬相關(guān)蛋白與炎癥因子表達(dá)

按照表1的分組進(jìn)行藥物處理24 h后，收集細(xì)胞提取總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。每組樣品總蛋白20μg 經(jīng) 12% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后分別加入一抗，LC3B(抗體濃度比為1∶1000)、Beclin(抗體濃度比為1∶1000)、P62(抗體濃度比為1∶1000)、TNF-α(抗體濃度比為1∶1000)、IL-1β(抗體濃度比為1∶1000)及內(nèi)參GAPDH(抗體濃度比為1∶1000)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(抗體濃度比為1∶1000)；使用ECL發(fā)光液顯影后，根據(jù)各組灰度值結(jié)果進(jìn)行分析。

2.3 激光共聚焦熒光共定位法(Immunofluo-rescence，IF)檢測自噬相關(guān)因子LC3B、P62的定位與表達(dá)

按照表1的分組進(jìn)行藥物處理24 h后取出細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，用0.5% Tritons透膜，PBS漂洗3次，5%BSA室溫封閉1 h后，同時加入2種一抗，LC3B(抗體濃度比為1∶500)和P62(抗體濃度為1∶1000)4 ℃ 孵育過夜。PBS洗掉多余一抗后，用熒光二抗cy3(抗體濃度比為1∶1000)、FITC(抗體濃度比為1∶1000)室溫避光孵育1 h，PBS洗掉多余熒光二抗后，DAPI(抗體濃度比為1∶1000)染核，室溫10 min，PBS洗掉多余DAPI后封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬相關(guān)蛋白LC3B與P62的定位表達(dá)。

2.4 酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linked immunosor-bent assay，ELISA)檢測炎癥因子TNF-α的分泌

按照表1的分組進(jìn)行藥物處理24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。設(shè)置7個標(biāo)準(zhǔn)品，將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和實驗樣本每孔100 μL加入到96孔板中，37 ℃孵育60 min，洗滌5次，每次震蕩或靜置40 s。每孔加入100 μL抗體工作液，37 ℃孵育30 min，洗滌5次。每孔再加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min，洗滌5次。最后每孔加入100 μL顯色底物工作液，37 ℃孵育15 min后加入 100 μL終止液混勻。使用酶標(biāo)儀測量吸光度，通過樣本的OD值計算炎癥因子濃度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 丹皮酚對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后自噬相關(guān)因子LC3B、Beclin、P62表達(dá)的影響

圖1示，WB實驗結(jié)果如圖1A、1B，統(tǒng)計分析結(jié)果如圖1C、1D、1E、1F。

與正常組比較，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激之后，LPS組LC3B和Beclin表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，LC3B-I向LC3B-II的轉(zhuǎn)化也沒有顯著性差異，LPS不能增強(qiáng)LC3B表達(dá)，提示LPS不影響細(xì)胞自噬；RAP組出現(xiàn)了顯著性差異，LC3B表達(dá)顯著增加，LC3B-l向LC3B-ll轉(zhuǎn)換率顯著增加，提示RAP可以增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性。

與LPS組比較，在L+R組 LC3B表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Beclin表達(dá)呈增強(qiáng)趨勢，P62表達(dá)呈減少趨勢，LC3B-l向LC3B-ll轉(zhuǎn)換增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；L+P組LC3B與Beclin表達(dá)呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢，提示雷帕霉素和丹皮酚均可以增強(qiáng)LPS刺激條件下的自噬活性。

與RAP組比較，R+P組LC3B、Beclin表達(dá)減少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但是我們依然可以看到表達(dá)減少的趨勢，提示丹皮酚能夠在自噬表達(dá)顯著增高時抑制自噬。

注：L 代表LPS，R 代表雷帕霉素，P 代表丹皮酚；A:WB結(jié)果；B:LC3B/GAPDH統(tǒng)計結(jié)果；C:LC3B-II/LC3B-I統(tǒng)計結(jié)果；D: Beclin/GAPDH統(tǒng)計結(jié)果；E.WB結(jié)果；F.P62/GAPDH統(tǒng)計結(jié)果與對照組比較：*P<0.05；與對照組比較：** P<0.01； 與L+R組比較：▲P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05圖1 LPS刺激RAW264.7細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin、P62的表達(dá)

3.2 丹皮酚對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞自噬相關(guān)因子LC3B、P62熒光表達(dá)與定位

圖2示，在正常對照組中， Cy3 標(biāo)記的 LC3B(紅色)主要定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，與 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核重疊，F(xiàn)ITC標(biāo)記的P62(綠色)主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。經(jīng)藥物刺激后，其定位并沒有改變。

圖2 LPS刺激的 RAW264.7 細(xì)胞中自噬相關(guān)因子LC3B和P62 的定位和表達(dá)(激光共聚焦×630倍)

3.3 丹皮酚對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

圖3、4示，WB實驗結(jié)果如圖3 A、3B，WB統(tǒng)計分析結(jié)果如圖3C、3D，Elisa統(tǒng)計分析結(jié)果如圖4。

與正常組比較，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激之后，LPS組TNF-α 總蛋白表達(dá)與細(xì)胞外分泌增多，IL-1β總蛋白表達(dá)增多，提示LPS激活RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Rap組和R+P組TNF-α總蛋白表達(dá)與細(xì)胞外分泌無明顯差異，IL-1β表達(dá)也無明顯差異，提示單純加入雷帕霉素對細(xì)胞并無影響。

與LPS組比較，L+R組、L+P組和 L+R+P組都呈現(xiàn)相同的作用趨勢，TNF-α 總蛋白表達(dá)減少，IL-1β總蛋白表達(dá)水平均下降，提示雷帕霉素與丹皮酚能夠抑制炎癥反應(yīng)。與L+R組比較，L+R+P組TNF-α細(xì)胞外分泌減少，IL-1β總蛋白表達(dá)減少，提示雷帕霉素與丹皮酚聯(lián)合作用，其抑制炎癥效果增強(qiáng)。

與Rap組比較，R+P組表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示在非炎癥的環(huán)境中，雷帕霉素與丹皮酚對細(xì)胞沒有影響。

注：L.LPS；R.雷帕霉素；P.丹皮酚；與對照組比較：*P<0.05；與LPS組比較：# P<0.05；與L+R組比較：▲▲▲ P<0.001圖3 LPS刺激RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β表達(dá)(Western blot)

注：L.LPS；R.雷帕霉素；P.丹皮酚；與對照組比較：*** P<0.001；與對照組比較：****P<0.0001；與LPS 組比較：#P<0.05；與LPS 組比較：##P<0.01；與LPS 組比較：#### P<0.0001；與L+R組比較：▲▲▲P<0.01圖4 LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞中 TNF-α 的分泌(Elisa)

4 討論

自噬是一種細(xì)胞的自我降解、轉(zhuǎn)化和供能機(jī)制[7]。LC3B是自噬的標(biāo)志性蛋白，在自噬發(fā)生時，LC3B-I在Atg5-Atg12-Atg16 復(fù)合物的幫助下連接上一個磷脂酰乙醇分子形成 LC3B-II。P62是自噬降解底物，對降解底物的識別和包裹起關(guān)鍵作用[8]。Beclin在哺乳動物細(xì)胞中過表達(dá)時促進(jìn)細(xì)胞自噬[9]，表達(dá)隨著自噬的增強(qiáng)而增多，因此LC3B、Beclin和P62可以作為自噬的檢測指標(biāo)。TNF-α 和IL-1β是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志性炎癥因子[10-11]。有研究表明，血漿中 TNF-α、IL-1β含量與膿毒癥患者的病情及預(yù)后密切相關(guān)[12-13]。

有研究表明，丹皮酚能夠阻斷p38、ERK和NF-κB信號通路[14-15]，對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)有廣泛的抑制作用[16-17]。還有研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚在HSE 模型中可抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，調(diào)節(jié) TNF-α 和 IL-6 的合成及分泌[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥環(huán)境條件中，丹皮酚與自噬激動劑雷帕霉素呈現(xiàn)相同的作用趨勢，兩者均能促進(jìn)自嗜并抑制炎癥；當(dāng)雷帕霉素與丹皮酚共同作用，使自噬增強(qiáng)，炎癥進(jìn)一步減弱，對炎癥的抑制作用顯著強(qiáng)于單獨使用丹皮酚或者雷帕霉素。據(jù)此推測，丹皮酚通過促進(jìn)自噬來抑制炎癥反應(yīng)。在LPS誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境中，丹皮酚激活自噬相關(guān)通路，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白和炎癥因子，影響炎癥細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮抗炎作用。

丹皮酚所調(diào)控自噬與炎癥的相互作用機(jī)制影響著細(xì)胞功能，與炎癥相關(guān)的腫瘤、自身免疫性疾病和代謝性疾病等有著密切關(guān)系，對于感染性疾病的臨床防治可能有較重要的應(yīng)用前景，為臨床的炎癥性疾病治療提供新思路，值得進(jìn)一步深入研究。