彭陳文，黃 璇，孫茗威，張家振，甄偉龍，王 森，文彥鈞，張 韌，黃雅麗△

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 廣州 510006)

目前，糖尿病已成為威脅人類健康最重要的疾病之一。最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，2015年全球糖尿病患者已有4.15億，其中發(fā)展中國家患者占據(jù)75%，預(yù)計2040年全球糖尿病患者數(shù)量將達到6.42億[1]。中國糖尿病的流行情況更為顯著，患病率高達11.6%，糖尿病患者總數(shù)達1.13億[2]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的臨床病理改變是以胰島素分泌相對不足和胰島素抵抗為主。T2DM會給各種臟器造成長期損害，尤其是眼、腎、神經(jīng)以及心血管進而嚴重影響患者的生命質(zhì)量[3-4]。

T2DM屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，廣州中醫(yī)藥大學(xué)熊曼琪教授認為，T2DM的基本病機為瘀熱互結(jié)、氣陰兩虛。據(jù)此，在具有瀉熱逐瘀功效桃核承氣湯基礎(chǔ)上，開創(chuàng)出加味桃核承氣湯(Jiawei Taohe Chengqi Decoction,JTCD)用于T2DM的臨床治療，取得了良好療效[5]。目前，JTCD治療T2DM的作用機制尚未得到系統(tǒng)闡釋。因此，研究JTCD治療T2DM多成分、多靶點、多通路的作用機制，對T2DM中醫(yī)藥治療具有非常重要的意義。

本研究將應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，系統(tǒng)地揭示JTCD治療T2DM的潛在作用機制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，并且為中醫(yī)藥經(jīng)典名方藥理機制的研究提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 JTCD化學(xué)成分的獲取與篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分別收集桃仁、芒硝、大黃、桂枝、玄參、生地黃、麥冬、黃芪、甘草化學(xué)成分，采用OB(Oral bioavailability)≥30%、DL(Drug-likeness)≥0.18對收集到的成分進行篩選。

1.2 JTCD化學(xué)成分的靶點預(yù)測

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，獲取化合物的標準Canonical SMILES 格式，將SMILES 格式文件輸入SwissTargetPrediction平臺(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)，設(shè)置屬性為“homo sapiens”，預(yù)測化合物的潛在靶點。該平臺設(shè)有參數(shù)“可能性”(Probability)評估預(yù)測靶點的準確性。為提高所得靶點的準確性，本文選取可能性大于0.5(最高值為1)的預(yù)測靶點。若某一化合物的預(yù)測靶點可能性均小于0.5，則選取可能性排列前5的靶點，至少保證每一化合物獲得5個預(yù)測靶點。

1.3 JTCD治療T2DM的相關(guān)作用靶點收集

以關(guān)鍵詞“type 2 diabetes mellitus”，通過TTD(http:∥bidd.nus.edu.sg/BIDDDatabases/TTD/TTD.asp)、OMIM (http:∥www.omim.org/)、DiGSeE (http:∥210.107.182.61/geneSearch/)、Drug Bank(https:∥www.drugbank.ca/)及Human Phenotype Ontology(HPO、https:∥hpo.jax.org/app/)5個疾病靶點數(shù)據(jù)庫，收集T2DM的相關(guān)疾病靶點基因，去除重復(fù)基因，與上一步得到的靶點進行比對，最后獲得JTCD治療T2DM的潛在作用靶點。

1.4 JTCD治療T2DM的靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Sring數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org/)檢索JTCD治療T2DM潛在靶標的蛋白相互作用數(shù)據(jù)，物種設(shè)為“Homo sapiens”(人類)，最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度“medium confidence”0.4，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，使用Cytoscape3.2.1軟件繪制靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 作用靶點的KEGG通路分析

將JTCD治療T2DM的45個作用靶點導(dǎo)入Metascape 平臺[6]，輸入物種和分析物種均選擇“H.sapiens”，設(shè)置P value<0.01，對輸入靶點進行KEGG分析并保存結(jié)果，根據(jù)每個條目的P value從小至大進行排序，篩選前15條目，通過OmicShare網(wǎng)站(http:∥www.omicshare.com/)對結(jié)果進行可視化。

1.6 JTCD治療T2DM “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將JTCD治療T2DM的作用靶點和代謝通路數(shù)據(jù)輸入Cytoscape3.2.1軟件，構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 JTCD化學(xué)成分的篩選

表1示，根據(jù)OB>30%、DL>0.18，篩選出95個主要活性成分。其中桃仁13個，包括香豆?？鼘幩?、α1-抗谷甾醇7等；大黃10個，包括蘆薈大黃素、葉黃素等；桂枝4個，包括表兒茶素、β谷甾醇等；生地黃2個，包括β-谷甾醇、豆甾醇；玄參3個，包括β谷甾醇、柳杉酚；黃芪18個，包括常春藤、槲皮素等；麥冬2個，包括多孔甾醇、N-對香豆酰酪胺；甘草72個，包括樺木酸、毛蕊異黃酮等；TCMSP數(shù)據(jù)庫無芒硝化學(xué)成分。

表1 JTCD化學(xué)成分基本信息比較

HerbsNo.Molecule NameOB/%DLM38Formononetin69.67 0.21 M40Calycosin47.75 0.24 M41Kaempferol41.88 0.24 M47(-)-Medicarpin-3-O-glucoside40.99 0.95 M481-Methoxyphaseollidin69.98 0.64 M493-(2,4-Dihydroxyphenyl)-5-methoxy-7-hydroxycoumarin83.71 0.27 M503,3'-DI-O-Methylquercetin46.45 0.33 M513'-Hydroxy-4'-O-Methylglabridin43.71 0.57 M523'-Methoxyglabridin46.16 0.57 M535-Prenylbutein46.27 0.31 M549-Eicosenoic acid30.70 0.20 M55AC1LCTJ160.25 0.63 M56AC1LIUG442.56 0.20 M57AC1NSWUJ39.71 0.33 M58Euchrenone A730.29 0.57 M59Eurycarpin A43.28 0.37 M60Gancaonin A51.08 0.40 M61Gancaonin B48.79 0.45 M62Gancaonin G60.44 0.39 M63Gancaonin H50.10 0.78 M64Glabranin52.90 0.31 M65Glabrene46.27 0.44 M66Glabridin53.25 0.47 M67Glabrone52.51 0.50 M68Glepidotin A44.72 0.35 M69Glepidotin B64.46 0.34 M70Glyasperin B65.22 0.44 M71Glyasperin C45.56 0.40 M72Glyasperin F75.84 0.54 M73Glycyrol90.78 0.67 M74Glycyroside37.25 0.79 M75Glycyrrhiza flavonol A41.28 0.60 M76Glypallichalcone61.60 0.19 M77Glyuranolide34.32 0.55 M78Glyzaglabrin61.07 0.35 M79Icos-5-enoic acid30.70 0.20 M80Isoformononetin38.37 0.21 M81Isoglycyrol44.70 0.84 M82Isolicoflavonol45.17 0.42 M83Isotrifoliol31.94 0.42 M84Jaranol50.83 0.29 M85Kanzonol B39.62 0.35 M86Kanzonol F32.47 0.89 M87Licoagrocarpin58.81 0.58 M88Licoagroisoflavone57.28 0.49 M89Licochalcone A40.79 0.29 M90Licochalcone B76.76 0.19 M91Licochalcone G49.25 0.32 M92Licocoumarone33.21 0.36 M93Licoisoflavone A41.61 0.42 M94Licoisoflavone B38.93 0.55 M95Licorice glycoside E32.89 0.27 M96Licoricone63.58 0.47 M97Liquiritigenin32.76 0.18 M98Liquiritin65.69 0.74 M99Lupiwighteone51.64 0.37

HerbsNo.Molecule NameOB/%DLM100Maackiain75.18 0.54 M101Medicarpin49.22 0.34 M102Naringenin59.29 0.21 M103Odoratin49.95 0.30 M104Phaseol78.77 0.58 M105Phaseollinisoflavan32.01 0.45 M106Semilicoisoflavone B48.78 0.55 M107Shinflavanone31.79 0.72 M108Shinpterocarpin80.30 0.73 M109Sigmoidin-B34.88 0.41 M110Vestitol74.66 0.21 M111Xambioona54.85 0.87

2.2 靶點預(yù)測

表2示，通過SwissTargetPrediction 平臺，基于參數(shù)“可能性”預(yù)測JTCD化合物的潛在靶點，共獲得1138個基因靶點，刪除重復(fù)項，共得到232個潛在靶點，并且將這些靶點和通過OMIM、 TTD、DiGSeE、Drug Bank以及HPO疾病數(shù)據(jù)庫搜集到的T2DM相關(guān)基因進行比對，得到JTCD成分潛在靶點與疾病靶點的交集，最終獲得45個可能與JTCD治療T2DM相關(guān)的靶點。

表2 JTCD治療T2DM的45個潛在作用靶點

2.3 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖1示，將JTCD治療T2DM相關(guān)的45個靶蛋白導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫獲取相互作用關(guān)系，使用Cytoscape3.2.1 繪制靶蛋白 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖(圖中英文縮寫為靶基因名稱，如AR表示雄激素受體)。

圖1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究JTCD治療T2DM技術(shù)路線

圖2示，此網(wǎng)絡(luò)共包括 40個節(jié)點208個邊(若兩蛋白以邊相連，則表明兩蛋白間存在相互作用關(guān)系)，圖中 degree值越大則節(jié)點越大，結(jié)果提示TCT治療T2DM靶點中Degree值排名前 5的靶蛋白為AKT1、SRC、EGFR、CASP3、NOS3。

圖2 JTCD治療T2DM靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 KEGG通路富集分析

使用Metascape平臺對45個JTCD治療T2DM的潛在作用靶點進行KEGG通路分析。根據(jù)每個條目的P value從小至大進行排序，篩選前15條目，并采用OmicShare網(wǎng)站對結(jié)果進行可視化。

圖4示，KEGG分析篩選出15條通路，主要是癌癥中的蛋白聚糖、胰島素抵抗、雌激素信號通路、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑抵抗、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等。

圖3示，氣泡面積大小代表屬于這個條目的基因數(shù)量，氣泡越大表明基因數(shù)目越多；氣泡顏色代表P value從紅色至綠色、P value由小變大；RichFoctor為輸入基因?qū)儆谠摋l目的基因數(shù)量與該條目中所有基因數(shù)量的比值。

圖3 JTCD治療T2DM 的KEGG通路富集分析

2.5 JTCD治療T2DM“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖4示，將JTCD治療T2DM相關(guān)作用靶點和KEGG通路信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。在導(dǎo)出的網(wǎng)絡(luò)圖中，以不同顏色的圓圈節(jié)點表示成分、靶點以及通路。藍色圓圈節(jié)點代表JTCD的化學(xué)成分，紫色圓圈節(jié)點代表靶點，紅色圓圈節(jié)點代表通路。若某一靶點為某一成分的潛在靶點，則以邊相連；若某一蛋白能夠調(diào)節(jié)某條通路，也通過邊連接。從圖6可以看出，同一成分對應(yīng)多個作用靶點和多個成分對應(yīng)同一靶點的關(guān)系，體現(xiàn)了JTCD多成分、多靶點治療T2DM的作用特點。

圖4 JTCD治療T2DM “活性成分-靶點-KEGG 通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

據(jù)臨床文獻報道，JTCD在治療T2DM上能取得不錯的療效?？道^孔[7]等在西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上加用JTCD治療T2DM 70例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中西醫(yī)結(jié)合療效好于單用西醫(yī)療效，總有效率高達92.9%。孟慶海[8]等用JTCD治療T2DM 35例，治療2個月后患者的空腹血糖 (FBG)、餐后2 h血糖 (2 h PBG)以及糖化血紅蛋白(HbA1c)較治療前有明顯改善。另有藥理學(xué)研究表明[9-11]，JTCD能夠很好地防治T2DM及其引起的并發(fā)癥。朱章志等[12]研究發(fā)現(xiàn)，JTCD能顯著降低糖尿病大鼠的血糖、血脂以及PI3K mRNA、Akt mRNA水平，從而有效地延緩糖尿病大血管病變。徐陽等[13]研究表明，中藥復(fù)方JTCD能夠有效抑制糖尿病大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)表達，并升高胰島素樣生長因子-1(IGF-1)表達，從而有效地抑制糖尿病大血管向纖維化發(fā)展。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究JTCD治療T2DM的作用機制?！癑TCD化學(xué)成分的篩選”結(jié)果表明，β-谷甾醇、表兒茶素等是JTCD關(guān)鍵藥物活性成分。β-谷甾醇是一種天然的藥物成分，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化、抗動脈硬化等作用[14-16]。Ponnulakshmi R[17]等表明，β-谷甾醇能通過2型糖尿病大鼠脂肪組織中的IR和GLUT4來改善血糖水平；表兒茶素是食品、植物和中藥材中的重要活性成分之一，其具有很好的降糖降脂、抑制胰島素抵抗等作用[18]。

“JTCD抗T2DM靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)分析”結(jié)果顯示，AKT1、SRC、EGFR、CASP3、NOS3的Degree值排在45個靶蛋白前5位, 提示這5個靶蛋白很可能在JTCD抗T2DM中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)是PI3K /Akt信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在調(diào)控細胞生存、蛋白合成以及胰島素依賴等方面具有重要作用[19]。余紅等[20]實驗結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎組織中AKT1過度表達，而丹芪合劑可降低AKT1表達水平，阻礙腎臟纖維化，改善糖尿病腎病。另有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病腎組織中表皮生長因子受體(EGFR)表達水平較高，抑制EGFR信號通路表達具有潛在的治療糖尿病腎病的作用[21]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS3)是NO合成途徑的關(guān)鍵酶，血管內(nèi)皮細胞中的NO具有抗炎、抗血栓形成、抗動脈硬化的功能，是維持正常血管內(nèi)皮功能所必需的[22]。國外研究發(fā)現(xiàn)，胰島素可誘導(dǎo)NOS3活化、增加NO合成，抑制糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[23]。目前關(guān)于SRC、CASP3對T2DM作用的文獻報道較少，但本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測SRC、CASP3是JTCD治療T2DM的關(guān)鍵靶蛋白之一，可為其實驗研究提供新的思路。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，JTCD治療T2DM涉及雌激素信號通路、VEGF信號通路、AGE-RAGE信號通路等信號通路。有研究表明[24]，隨著女性年齡的增加，T2DM發(fā)病率增加，提示雌激素可能參與T2DM的發(fā)生。而雌激素可能通過降低血糖血脂、抗氧化應(yīng)激、改善胰島素抵抗等方面對T2DM產(chǎn)生治療作用[25]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是目前最強的促血管生成因子，生理狀態(tài)下VEGF在腎臟、眼等器官低表達，而在T2DM狀態(tài)下其呈過度表達狀態(tài)。該狀態(tài)會促進眼部異常血管增生，亦可增加腎臟濾過膜的通透性，加重蛋白尿，從而導(dǎo)致T2DM眼部、腎臟并發(fā)癥的發(fā)生[26]。AGE-RAGE信號通路是T2DM的經(jīng)典學(xué)說之一，AGE與RAGE結(jié)合，激活細胞內(nèi)多條信號傳導(dǎo)通路，產(chǎn)生多種病理性細胞反應(yīng)，促進T2DM及其并發(fā)癥的形成與發(fā)展[27]。

本研究結(jié)果表明，JTCD治療T2DM的過程涉及多個活性成分、靶點及通路，與中醫(yī)藥治療疾病多成分-多靶標-多通路的特點相吻合。同時，本研究可作為JTCD治療T2DM作用機制的預(yù)測探討，為下一步實驗研究提供思路與參考。