劉艷君 卜曉萌 張巧利 褚春芳 馬延敏 王 雪

子宮內(nèi)膜容受性降低是臨床胚胎移植反復(fù)失敗的主要原因之一[1]。胞突飲是子宮內(nèi)膜容受性的輔助評(píng)估指標(biāo)之一，然而目前還不能準(zhǔn)確檢測(cè)胞突飲發(fā)育情況，因此尋找可靠的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性，可能對(duì)降低胚胎移植失敗率有重要意義[2-3]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factors，IGF-1)及其受體(IGF-1R)分布于人體各組織，對(duì)胚胎早期種植及滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入和遷移有促進(jìn)作用[4]。雌激素(estrogen，E)是一類(lèi)含18個(gè)碳原子的類(lèi)固醇激素，對(duì)乳腺細(xì)胞分化、乳腺導(dǎo)管上皮增生及泌乳均有重要作用[5]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)IGF-1R、雌激素受體(estrogenreceptor，ER)與妊娠高血壓、糖尿病及妊娠期子宮肌瘤之間關(guān)系的研究較多[6-7]，然而IGF-1R、ER在反復(fù)胚胎移植失敗患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及其與子宮內(nèi)膜容受性關(guān)系的研究仍較少。本研究通過(guò)檢測(cè)反復(fù)胚胎移植失敗患者及首次冷凍胚胎移植獲得臨床妊娠的患者子宮內(nèi)膜中IGF-1R、ER mRNA水平及其與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系，以期為探索子宮內(nèi)膜容受性預(yù)測(cè)指標(biāo)開(kāi)辟新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年9月至2018年7月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生殖中心就診的胚胎移植3次均失敗的86例患者為研究對(duì)象(觀(guān)察組)；同時(shí)期選取首次冷凍胚胎移植獲得臨床妊娠的73例患者作為對(duì)照組。兩組年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、不孕年限等資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：①3次及以上胚胎移植均失敗者[胚胎移植15 d測(cè)血人絨毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)≥50 IU/L為生化妊娠，否則均視為胚胎移植均失敗]；②資料齊全者；③B超顯示子宮形態(tài)正常者；④基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常、月經(jīng)規(guī)律者；⑤卵泡晚期內(nèi)膜三線(xiàn)征明顯，厚度≥8 mm者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①3個(gè)月內(nèi)宮腔操作及激素治療者；②子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、多囊卵巢綜合征者；③伴高血壓、先天性心臟病等心血管疾病者；④伴有糖尿病等內(nèi)分泌疾病者。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法 查閱門(mén)診病歷，收集患者入院前一般資料，包括年齡、BMI、不孕年限、不孕原因、不孕類(lèi)型等，所有患者均由2名及以上主治醫(yī)師明確診斷。采用qRT-PCR法檢測(cè)患者子宮內(nèi)膜中IGF-1R、ER mRNA表達(dá)水平；通過(guò)掃描電鏡檢測(cè)子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育情況；采用Pearson法分析患者子宮內(nèi)膜IGF-1R、ER水平與發(fā)育完全胞飲突數(shù)量的相關(guān)性。

1.2.1 子宮內(nèi)膜標(biāo)本采集及保存 所有研究對(duì)象均于種植窗期(排卵第6～8天)取少許子宮內(nèi)膜標(biāo)本，若經(jīng)B超檢測(cè)卵泡發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)不排卵，則放棄本周期檢查。采用直徑0.3 cm的子宮內(nèi)膜取樣器采集中段標(biāo)本，立即用生理鹽水洗去血污，干紗布吸去水分，迅速置于-20℃保存待測(cè)。

1.2.2 控制性超促排卵及胚胎移植方案 所有研究對(duì)象均于體外受精/卵泡漿內(nèi)單精子注射受精-胚胎移植。于控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)周期的月經(jīng)第1～3天起每日肌注促性腺激素(gonadotropin，Gn)(齊一生物科技；批號(hào)：4778-1000，1 mg)并進(jìn)行B超檢測(cè)卵泡發(fā)育。當(dāng)有2～3個(gè)卵泡直徑大于18 mm時(shí)，停用Gn，肌肉注射hCG(上海雅吉，批號(hào)：41115P，100 μL)10 000 IU，36 h后取卵并受精。在取卵后第3～6天選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行冷凍玻璃化保存。采用自然周期法準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜，參考之前月經(jīng)周期規(guī)律，于月經(jīng)結(jié)束第8～12天進(jìn)行陰超檢查，監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育及子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)情況。在優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥14 mm時(shí)檢測(cè)尿促黃體生成素(lutein hormone，LH)；在卵泡直徑≥18 mm時(shí)，檢查患者LH、雌激素(Estradiol，E2)和孕酮(Progesterone，P)。采用快速?gòu)?fù)溫法復(fù)蘇胚胎，孵育2 h后選擇2枚優(yōu)勢(shì)胚胎進(jìn)行移植。

1.2.3 qRT-PCR法檢測(cè)子宮內(nèi)膜IGF-1R、ER mRNA水平 采用上海名勁生物科技有限公司生產(chǎn)的Trizol RNA提取試劑盒(貨號(hào)：5003050)提取子宮內(nèi)膜總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用廣州市百菱生物科技有限公司生產(chǎn)的ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)IGF-1R、ER進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系共10 μL：cDNA(50 ng/μL)1μL，德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的miScript SYBR?Green Mix(貨號(hào)：218076)5 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，雙蒸水 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃、15 s，58℃、1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。IGF-1R、ER及內(nèi)參GAPDH的引物序列見(jiàn)表2。每份樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，采用2-ΔΔCT法對(duì)子宮內(nèi)膜IGF-1R、ER mRNA含量進(jìn)行定量分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.4 子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育檢測(cè) 采用掃描電鏡觀(guān)察子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育狀況，記錄3個(gè)內(nèi)膜面的胞飲突數(shù)目的平均值，發(fā)育程度判斷標(biāo)準(zhǔn)與Mirkin等[8]報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)一致(若在同一子宮內(nèi)膜樣本中觀(guān)察到不同發(fā)育階段的胞飲突，僅記錄其最普遍存在的表達(dá)方式)。膜狀突起開(kāi)始形成，并發(fā)展到整個(gè)細(xì)胞頂部，微絨毛變短、變少、相互融合，即為發(fā)育中的胞飲突；微絨毛完全消失、膜狀突起變大，高于纖毛細(xì)胞，形狀如蘑菇，即為完全發(fā)育的胞飲突；胞飲突開(kāi)始萎縮，微絨毛重新出現(xiàn)，細(xì)胞體積變大，即為退化中的胞飲突。

1.3 觀(guān)察指標(biāo) ①比較兩組控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)及移植情況；②比較兩組子宮內(nèi)膜IGF-1R、ER mRNA水平；③比較兩組子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育情況；④分析IGF-1R、ER與發(fā)育完全胞飲突數(shù)量的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組COH及移植情況比較 兩組Gn用量、Gn使用天數(shù)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、獲卵數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)目、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目、受精率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組COH及移植情況比較

2.2 兩組子宮內(nèi)膜IGF-1R、ER mRNA水平比較 觀(guān)察組子宮內(nèi)膜IGF-1R、ER mRNA水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組子宮內(nèi)膜IGF-1R、ER mRNA水平比較

2.3 兩組子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育情況比較 對(duì)照組子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育完全例數(shù)較多，觀(guān)察組胞飲突發(fā)育中/退化例數(shù)較多，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀(guān)察組子宮內(nèi)膜胞飲突完全發(fā)育數(shù)目低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

2.4 IGF-1R、ER與發(fā)育完全胞飲突數(shù)量的相關(guān)性 IGF-1R、ER水平與完全發(fā)育胞飲突數(shù)量均呈正相關(guān)(r=0.699、0.650，P均<0.05)。見(jiàn)圖1、2。

表5 兩組子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育情況比較

圖1 IGF-1R與發(fā)育完全胞飲突數(shù)量的相關(guān)性

圖2 ER與發(fā)育完全胞飲突數(shù)量的相關(guān)性

3 討論

隨著輔助生殖技術(shù)發(fā)展及胚胎移植技術(shù)日益成熟，不孕患者妊娠率大幅提高，但仍有許多患者胚胎移植反復(fù)失敗，其主要原因是子宮內(nèi)膜容受性較差促使胚胎著床成功率降低[9-10]。目前用于預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物及方法主要有胞飲突、蛋白組學(xué)、子宮內(nèi)膜容受性芯片，為探索生化標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性提供了有利條件[11]。本研究探究子宮內(nèi)膜IGF-1R、ER水平與其容受性的關(guān)系，為IGF-1R、ER作為預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性的生化標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)。

IGF-1與其受體IGF-1R特異性結(jié)合后能激活胰島素受體底物蛋白通路，促進(jìn)細(xì)胞遷移和增生。IGF-1R能作用于卵母細(xì)胞，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟。IGF-1R水平影響子宮內(nèi)膜的增殖和發(fā)育，可能進(jìn)一步影響子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床的成功與否[12-13]。ER在子宮內(nèi)膜的間質(zhì)及腺體廣泛分布且呈周期性表達(dá)，除調(diào)節(jié)雌激素水平外還能控制子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)，控制子宮內(nèi)膜對(duì)激素的應(yīng)答[14]。ER可通過(guò)解除對(duì)某些基因的抑制，在種植窗期起到降調(diào)解作用，從而在子宮內(nèi)膜容受性的形成中發(fā)揮重要作用[15]。

本研究結(jié)果顯示，觀(guān)察組子宮內(nèi)膜中IGF-1R、ER水平低于對(duì)照組，且與發(fā)育完全胞飲突的數(shù)量均呈正相關(guān)，與王巧鳳等[16]研究結(jié)果相似。提示胚胎移植失敗患者子宮內(nèi)膜中IGF-1R、ER水平均低于首次胚胎移植妊娠成功人群，推測(cè)可能原因是IGF-1R、ER通過(guò)降低表達(dá)水平，調(diào)節(jié)雌激素的水平，抑制卵母細(xì)胞的成熟及子宮內(nèi)膜的發(fā)育，影響子宮內(nèi)膜的容受性，進(jìn)一步降低胚胎著床的成功率，使得妊娠失敗。兩者水平與胞飲突呈明顯相關(guān)性進(jìn)一步提示，IGF-1R、ER水平與子宮內(nèi)膜容受性有密切聯(lián)系。胡秋蘭等[17]在研究針灸改善子宮內(nèi)膜容受性的進(jìn)展中表明，可通過(guò)針灸提高ER水平，從而改善胚胎移植反復(fù)失敗患者子宮內(nèi)膜的容受性，提示ER與子宮內(nèi)膜容受性有密切聯(lián)系，與本研究結(jié)論基本一致。本研究中，兩組年齡、BMI、不孕年限、不孕類(lèi)型、助孕方式、Gn用量、Gn使用天數(shù)、基礎(chǔ)FSH、獲卵數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)目、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目、受精率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示基礎(chǔ)因素對(duì)妊娠成功與否影響較小。

綜上所述，IGF-1R、ER水平能作為預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性的參考指標(biāo)，臨床可通過(guò)密切監(jiān)測(cè)其水平，采取合理措施改善妊娠結(jié)局。但本研究受樣本量、地域、實(shí)驗(yàn)條件等因素影響，目前只能將兩者水平作為參考指標(biāo)，不能進(jìn)行臨床應(yīng)用，需加大樣本量對(duì)其臨床應(yīng)用價(jià)值及具體作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究。