吳艷瓊 張 熙 付學(xué)斌 李 均 王明霞

骨癌痛是腫瘤患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移時(shí)最常見的癥狀之一，伴有自發(fā)痛、痛覺過敏和痛覺超敏等特征，嚴(yán)重影響癌癥患者生存質(zhì)量[1]。胍丁胺(agmatine，AGM)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的神經(jīng)遞質(zhì)和/或調(diào)質(zhì)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在腦和脊髓中合成，主要參與內(nèi)臟活動(dòng)、生長發(fā)育、降壓、認(rèn)知和疼痛等作用[2-3]。目前，AGM對(duì)骨癌痛鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制的研究甚少。本研究擬通過構(gòu)建大鼠脛骨骨癌痛模型，觀察AGM鞘內(nèi)注射對(duì)骨癌痛大鼠痛行為和脊髓CXCL13表達(dá)的影響，探討AGM對(duì)骨癌痛的鎮(zhèn)痛效果及可能機(jī)制，為臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雌性 SD 大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào)43004700)。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，溫度22～24℃，濕度40%～60%。將預(yù)選合格的SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組: 假手術(shù)組(A 組)、骨癌痛組(B 組)、胍丁胺組(C 組)，每組20只。

1.2 骨癌痛模型建立 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥50 mg/kg麻醉后，參照文獻(xiàn)[4-5]方法,縱行切開B、C組大鼠左脛骨上段皮膚，切口長度約0.5～1 cm，仔細(xì)暴露脛骨，取10 mL注射器針頭在脛骨粗隆平面處，與骨面夾角呈30°～45°，向尾部方向進(jìn)行穿刺打孔，再用微量進(jìn)樣器抽取Walker 256細(xì)胞懸液10 μL[6]，由穿刺孔進(jìn)針緩慢注射至骨髓腔內(nèi),出針后迅速骨蠟封閉，無菌生理鹽水局部沖洗，縫合傷口,外涂紅霉素軟膏預(yù)防感染。A 組脛骨髓腔內(nèi)注射等量生理鹽水，其余處理同B、C兩組。造模后12天，取大鼠脛骨行HE染色，鑒定成模情況。

1.3 機(jī)械痛閾值測定 術(shù)前將大鼠置入機(jī)械刺激儀玻璃籠中，每天 30 min，連續(xù)3天，使其適應(yīng)周圍環(huán)境及操作，于造模后12天測量其機(jī)械痛閾值。使用 von frey 纖維絲，垂直方向刺激大鼠左后肢足底中部，記錄儀自動(dòng)記錄大鼠縮足反射閾值，連續(xù)測3次，每次間隔時(shí)間10 min，取平均值作為該時(shí)點(diǎn)機(jī)械痛閾值。

1.4 鞘內(nèi)置管和藥物注射 大鼠麻醉后剔除兩側(cè)髂嵴部位毛發(fā)，兩髂嵴連線為 L5～6 棘突水平，備皮部位消毒3 遍后置于手術(shù)臺(tái)上。于 L5 棘突水平切開皮膚，分離棘突間隙,咬骨鉗咬去 L5 椎體棘突，用1 mL 無菌注射器針頭將硬脊膜刺破后拔出針頭，將 PE-10 導(dǎo)管朝向頭端方向置入蛛網(wǎng)膜下腔，深度約 3 cm 處, 此部位為脊髓腰膨大水平(L1～L2)處，導(dǎo)管置入后見清亮腦脊液從導(dǎo)管流出，為確保導(dǎo)管通暢，用生理鹽水沖洗導(dǎo)管，沖洗后縫合固定導(dǎo)管。經(jīng)導(dǎo)管給予2%鹽酸利多卡因(D17G09Ⅱ, 山東華魯)10 μL，注入局麻藥后再用 10 μL 生理鹽水沖洗導(dǎo)管，保證藥物完全進(jìn)入鞘內(nèi)。觀察大鼠注藥后的反應(yīng)，若注藥 10 s后，雙側(cè)后肢出現(xiàn)拖地現(xiàn)象及運(yùn)動(dòng)障礙，約15 min后大鼠活動(dòng)恢復(fù)自如，證明導(dǎo)管放置成功。A組不做鞘內(nèi)注射，B組和 C組分別經(jīng)導(dǎo)管注射等量0.9%生理鹽水和AGM 160 mg/kg(3 mg/μL)，10 s內(nèi)注射完，連續(xù)注射6天后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.5 免疫熒光法檢測CXCLl3 在脊髓背角神經(jīng)元中表達(dá) 于建模后12天，痛閾測定結(jié)束后，取大鼠L4～L6脊髓，多聚甲醛固定,30%蔗糖脫水至完全沉底，連續(xù)冰凍切片(厚14 μm)，加入5%羊血清抗體封閉液，室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)漂洗后，同時(shí)加入兔源性單克隆CXCL13抗體(1∶500，美國Abcam公司，ab199043)和小鼠源性單克隆NeuN抗體(1∶1 000，美國Abcam公司，ab104224)，4℃孵育12 h后，PBS洗滌3次，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h后，PBS洗滌3次，熒光封片劑封片。激光共聚焦熒光顯微鏡(Leica sp8，德國)觀察CXCL13在脊髓背角神經(jīng)元中的表達(dá)情況。

1.6 Western blot檢測脊髓CXCL13蛋白表達(dá) 造模后12天鞘內(nèi)注藥測痛閾值后，A、B、C 3組大鼠行斷頭處死，迅速取L4～L6脊髓，加細(xì)胞裂解緩沖液勻漿，分離提取總蛋白。 采用Lowry法進(jìn)行蛋白定量，以50 μg蛋白上樣，經(jīng)15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離轉(zhuǎn)膜。將NC膜浸入5%脫脂奶粉室溫封膜1 h。洗膜3次后加入β-actin(1∶3 000，美國Abcam公司，ab179467)及兔源性單克隆CXCLl3抗體(1∶1 000)，洗膜3次后加入二抗(1∶5 000，美國Abcam公司，ab205718)，37℃孵育2 h ，最后用ECL顯像曝光。用灰度掃描儀檢測出相應(yīng)CXCLl3條帶和β-actin內(nèi)參條帶的平均灰度值，用目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比表示樣品中目的蛋白含量。

1.7 RT-PCR法測定CXCLl3 mRNA表達(dá) 造模后第12天，A、B、C 3組大鼠取L4-L6節(jié)段脊髓，遵循PCR引物設(shè)計(jì)原則，以GAPDH作為內(nèi)參。CXCLl3上游引物為: 5′-CTGCTCGGAATCTTAGTGT-3′，下游引物為: 5′-GGTAATGCGTCTGCTTCT-3′；GAPDH上游引物為: 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物為: 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCACTA-3′。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延長1 min，72℃ 再延長7 min。以2-△△CT方法計(jì)算CXCLl3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 模型的鑒定 造模后12天，取大鼠右側(cè)脛骨，經(jīng)HE染色，觀察到正常大鼠骨質(zhì)致密，結(jié)構(gòu)完整(圖1A)。大鼠脛骨骨髓腔移植腫瘤細(xì)胞后，出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞(圖1B)。

圖1 大鼠脛骨HE染色(×100)

2.2 3組大鼠痛行為比較 建模后12天，B 、 C組大鼠機(jī)械縮足反射閾值均明顯低于A組；與B組比較,C 組機(jī)械縮足反射閾值高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表 1。

表1 3組大鼠機(jī)械痛閾值比較

2.2 CXCL13在大鼠脊髓背角神經(jīng)元中的表達(dá)比較 建模后12天，與A組比較，B、C組大鼠CXCL13表達(dá)增加，與B組比較,C 組大鼠CXCL13表達(dá)減少。見圖2。

2.3 CXCL13蛋白含量及其mRNA表達(dá) 建模后12天，與A組比較，B、C組大鼠CXCL13 蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加，與B組比較, C組大鼠脊髓CXCL13 蛋白及mRNA表達(dá)減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖3。

圖2 CXCL13在脊髓背角神經(jīng)元的表達(dá)(免疫熒光雙標(biāo)，×20)

表2 3組大鼠CXCL13 蛋白含量及其mRNA表達(dá)

圖3 3組大鼠CXCL13 蛋白表達(dá)情況

3 討論

骨癌痛是原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性骨腫瘤引起的慢性疼痛，是癌癥患者晚期骨轉(zhuǎn)移后最常見的并發(fā)癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),癌癥患者中約1/3的惡性腫瘤會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。絕大部分骨腫瘤患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的慢性疼痛。由于目前尚無確切治療方法，約50%的骨癌患者疼痛未得到有效控制。長期慢性疼痛給患者及其家人帶來巨大痛苦，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。所以尋找有效的癌痛治療措施，是目前亟待解決的問題。

脛骨癌痛模型是進(jìn)行癌痛研究的常見模型之一，通過將腫瘤細(xì)胞注射到脛骨骨髓腔內(nèi)，模擬骨轉(zhuǎn)移癌的病理學(xué)特征[6]，本實(shí)驗(yàn)采用了癌細(xì)胞脛骨骨髓腔注射的方式建立癌痛模型，通過行為學(xué)檢測和脛骨病理切片檢測，證實(shí)了骨癌痛模型制備成功。

AGM是一種內(nèi)源性陽離子聚胺[3, 7]，幾乎分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的所有器官，可作用于哺乳動(dòng)物神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，同時(shí)調(diào)控天冬氨酸、聚胺及一氧化氮合成與代謝，在機(jī)體病理生理改變及細(xì)胞修復(fù)機(jī)制中起著重要作用。研究[8]證實(shí)，AGM可顯著增加阿片類藥物的鎮(zhèn)痛強(qiáng)度，還能有效地預(yù)防和治療嗎啡的成癮性[9]；在神經(jīng)病理性疼痛模型中，AGM可呈劑量依賴性地增加大鼠機(jī)械痛閾值[10-11]。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠骨癌痛模型，通過連續(xù)鞘內(nèi)注射AGM結(jié)合行為學(xué)檢測，結(jié)果顯示，建模后12天，B 、 C組大鼠機(jī)械縮足反射閾值均明顯低于A組，C 組機(jī)械縮足反射閾值高于B組(P<0.05)，證明AGM可有效緩解骨癌痛大鼠的痛覺過敏，但其疼痛治療的作用機(jī)制尚不清楚。

骨癌痛發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜[12]，目前公認(rèn)的骨癌痛發(fā)病機(jī)制包括局部缺血缺氧微環(huán)境改變、各種細(xì)胞因子高表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及突觸重塑導(dǎo)致的中樞敏化等。事實(shí)上這些機(jī)制可能存在相互協(xié)同作用，在骨癌痛的發(fā)生和維持中意義重大。

趨化因子CXCL13 作為重要的細(xì)胞因子，在疼痛中發(fā)揮的重要作用逐漸受到學(xué)者關(guān)注。研究[13-14]證實(shí)，脊髓CXCL13通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞參與大鼠骨癌痛的形成與維持，CXCL13的活化是調(diào)控大鼠痛覺過敏的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]；神經(jīng)病理性痛模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)脊髓中趨化因子基因上調(diào)，尤其是CXCL13，其基因上調(diào)幅度最大[16]。本研究通過檢測CXCL13在脊髓背角神經(jīng)元上表達(dá)，定量分析顯示，建模后12天，與A組比較，B、C組大鼠CXCL13 蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。提示上調(diào)神經(jīng)元中CXCL13表達(dá)促進(jìn)了骨癌痛的形成過程，其機(jī)制可能與神經(jīng)病理性疼痛相同，與CXCL13激活脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)，說明神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用在疼痛形成過程中有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中通過鞘內(nèi)置管給藥，連續(xù)鞘內(nèi)注射AGM后發(fā)現(xiàn)，與B組比較, C組大鼠脊髓CXCL13 蛋白及其mRNA表達(dá)減低(P<0.05)，說明AGM可通過抑制CXCL13表達(dá)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用可能與CXCL13調(diào)控角質(zhì)細(xì)胞活性有關(guān)。

綜上所述，AGM鞘內(nèi)注射可緩解骨癌痛大鼠的痛覺過敏，其機(jī)制可能為抑制骨癌痛大鼠脊髓神經(jīng)元中CXCL13表達(dá)，抑制中樞敏化形成，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。但AGM是否直接作用于膠質(zhì)細(xì)胞而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用并不清楚。另外，AGM應(yīng)用的副作用以及是否對(duì)腫瘤本身產(chǎn)生作用也有待進(jìn)一步深入研究。