陳天平 王亞萍 程 杰 許 喆 李 艷 汪 儉 屈麗君

免疫性血小板減少癥(immunothrombocytopenia, ITP)是由體液和細(xì)胞免疫介導(dǎo)骨髓巨核細(xì)胞成熟障礙所致血小板生成不足，和/或免疫因素所致血小板過度破壞的一類自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，具有明顯的異質(zhì)性[1]。近年來，隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，該病的發(fā)病機(jī)制得以進(jìn)一步闡述，部分既往診斷為慢性ITP的患兒最終確診為遺傳性血小板減少癥。其中，RUNX1基因突變的具有急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)傾向的家族性血小板疾病(familial platelet disorder with predisposition to acute myeloid leukemia, FPD/AML)具有易于向AML轉(zhuǎn)變的特征[2-3]。本研究通過對(duì)2例ITP轉(zhuǎn)化為RUNX1基因陰性的急性巨核細(xì)胞白血病(acute megakaryocytic leukemia,AMKL)患兒進(jìn)行臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查，并結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，探討此類罕見疾病的臨床特征。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集安徽省兒童醫(yī)院血液科2018年1～12月收治的AMKL患兒2例，均為女嬰，就診時(shí)年齡較小，都因出血癥狀就診。追問病史，既往皆有ITP病史，曾行骨髓細(xì)胞學(xué)檢查排除血液造血系統(tǒng)疾病，并行自身抗體譜系等檢查排除自身免疫性疾病。所有患兒均否認(rèn)陽性血液系統(tǒng)疾病家族史，亦否認(rèn)異常孕產(chǎn)史。患兒一般資料見表1。

表1 2例患兒一般資料

1.2 檢查方法

1.2.1 骨髓細(xì)胞檢查 采用局部麻醉，選取髂后上棘為穿刺部位，將抽取的骨髓液迅速涂片3～5張，實(shí)行瑞-吉姆薩染色，使用低倍鏡對(duì)骨髓增生度進(jìn)行觀察判斷，油鏡下觀察骨髓細(xì)胞的分類、形態(tài)及計(jì)數(shù)。

1.2.2 骨髓活組織檢查 局麻處理后，取髂后上棘行骨髓活檢穿刺，鉆取0.4～1.0 cm的骨髓組織。使用Bouin液對(duì)骨髓組織固定，經(jīng)脫水、浸透處理后運(yùn)用塑料包埋，將其制成切片，行HE染色和免疫組化染色。采用顯微鏡對(duì)骨髓病理形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.3 流式細(xì)胞學(xué)分析 取骨髓液1～2 mL，EDTA抗凝，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至(4～10)×109/L，取100 μL骨髓液加入單克隆抗體20 μL，分析60 000個(gè)細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況。以CD45/SSC設(shè)門，按五色免疫熒光直接標(biāo)記法測定骨髓有核細(xì)胞各種抗原的表達(dá)，分別檢測細(xì)胞的CD10、CD19、CD5、CD13、CD33、HLA-DR、CD38、CD34、CD16、CD11b、CD36、CD64、CD56、CD14、CD20、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD22、CD24、cTDT、cCD79a、cCD22、cCD3、cMPO、IgM、CD79b、CD45、CD61等抗原的表達(dá)。所用抗體以及溶血?jiǎng)?、破膜劑購自貝克?庫爾特公司，儀器為貝克曼FC-500MPL。

1.2.4 RT-PCR檢測融合基因 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用多重巢式RT-PCR技術(shù)，定性檢測43種常見的白血病融合基因。使用日本Thermo 公司PTC-200 型PCR 儀，試劑盒為科研用白血病融合基因檢測試劑盒(上海源奇生物公司)。檢測的基因包括MLL/AF4、TEL/AML1、SIL/TAL1、ETV6/RUNX1、dupMLL、MLL/ENL、E2A/PBX1、SET/CAN、BCR/ABL、TLS/ERG、E2A/HLF、CALM/AF10、HOX11L2、HOX11、MLL/AF10、NPM/ALK等。

1.2.5 染色體核型分析 取肝素鈉抗凝新鮮骨髓液約3 mL，應(yīng)用植物血凝素進(jìn)行短期培養(yǎng)(24 h)后立即制片，收集骨髓細(xì)胞中有絲分裂中期細(xì)胞行吉姆薩染液染色，經(jīng)G顯帶于染色體分析儀上，行骨髓染色體核型分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn) 2例患兒既往行骨髓細(xì)胞學(xué)檢查排除血液造血系統(tǒng)疾病，并經(jīng)ANA系列等自身抗體譜檢查排除自身免疫性疾病，診斷為ITP?；純憾荚?jīng)對(duì)激素、丙球顯效或部分顯效?；純?發(fā)病時(shí)年齡較小，在新生兒科曾經(jīng)使用丙球、激素治療，出院后予口服潑尼松維持治療，曾經(jīng)一度血小板恢復(fù)正常，并予激素減停。初診14個(gè)月后，該患兒再次因“發(fā)熱咳嗽5 d，皮膚瘀點(diǎn)瘀斑4 d”入住我科。患兒2在初次診斷時(shí)給予靜脈使用地塞米松治療，出院后予口服潑尼松片維持，但其出院后血小板計(jì)數(shù)反復(fù)減少，約5個(gè)月后，因“反復(fù)便血22 h”入住我院。

2.2 白血病MICM分型 2例患兒入院后，完善骨髓MICM分型檢查?；純?的骨髓細(xì)胞學(xué)即提示AMKL，見圖1。白血病免疫表型：可見約1.10%免疫表型異常髓系原始細(xì)胞，表達(dá)CD41、CD42b、CD61，原始巨核細(xì)胞可能性大，請(qǐng)結(jié)合骨髓形態(tài)學(xué)、小巨核酶標(biāo)等結(jié)果綜合考慮；骨髓染色體：54,XX,+2,+i(6)(p10),+7,+8,+10,+10,+19,+19[16]/46,XX；白血病融合基因篩查及髓系預(yù)后基因篩查(包括RUNX1基因)均為陰性。

圖1 患兒1骨髓細(xì)胞學(xué)(瑞-吉姆薩染色×1 000)

患兒2再次診斷時(shí)骨髓細(xì)胞學(xué)形態(tài)并不典型，見圖2。白血病免疫分型：原始細(xì)胞占有核細(xì)胞總數(shù)約69.4%，該群細(xì)胞表達(dá)為CD4、CD36、CD41，部分表達(dá)為CD7、CD33、CD38、CD61、CD117，少量表達(dá)為CD13，不表達(dá)CD2、CD3、CD5、CD8、CD10、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD42b、CD56、CD64，傾向于AML-M7可能性大；骨髓染色體核型為復(fù)雜核型:46,XX,der(8)t(8;12)(q24;q21),der(9)t(9;10)(p22;p11.2),-10,der(12)t(10;12)(q11.2;q15),add(17)(p13),-19[7]/46,XX[13]；白血病融合基因篩查(包括RUNX1基因)均為陰性。患兒2因經(jīng)濟(jì)原因，未行髓系白血病預(yù)后基因檢測。

圖2 患兒2骨髓細(xì)胞學(xué)(瑞-吉姆薩染色×1 000)

2.3 骨髓病理檢查 患兒1在白血病MICM分型檢查后，進(jìn)行骨髓病理學(xué)檢查。骨髓病理結(jié)果：骨髓有核細(xì)胞增生程度大致正常(60%)；粒/紅比例略高；粒系以偏幼稚細(xì)胞散在易見；紅系以中晚幼紅細(xì)胞為主；未見明顯巨核細(xì)胞；淋巴細(xì)胞散在少數(shù)；骨髓間質(zhì)未見纖維化。骨髓免疫組化提示：CD34小血管(+)；CD117少(+)；CD20散在少(+)；MPO散在(+)；Lyso部分區(qū)域多(+)；CD99少(+)；CD61巨核細(xì)胞(+)，為小淋巴樣巨核細(xì)胞；E-cad偶見(+)。其骨髓病理及組化染色結(jié)果均支持AMKL診斷。見圖3。

圖3 患兒1骨髓病理檢查

2.4 治療與預(yù)后 患兒1入院后，經(jīng)骨髓MICM分型及骨髓病理學(xué)檢查，明確診斷為AMKL，進(jìn)入CCLG-AML2016協(xié)作組方案化療。先后給予誘導(dǎo)化療(DAE方案)、誘導(dǎo)后鞏固化療(IAE方案)、鞏固化療(HA方案)及CLASP方案化療，DAE誘導(dǎo)第28天即達(dá)骨髓細(xì)胞學(xué)完全緩解，已行異基因造血干細(xì)胞移植(臍帶血)，移植術(shù)后恢復(fù)可，目前仍在密切隨訪中。患兒2入院后，經(jīng)骨髓MICM分型診斷為AMKL，最終因經(jīng)濟(jì)原因放棄進(jìn)一步治療，電話回訪時(shí),患兒2已經(jīng)死亡，自其血小板減少起病至死亡時(shí)間僅5個(gè)月余。

3 討論

ITP 是一類自身免疫性疾病，早在1951 年，Harrington等[4]就已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ITP 的病理生理機(jī)制為自身抗體引起的自身免疫功能紊亂，導(dǎo)致網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)過度清除自身血小板。ITP 的發(fā)病機(jī)制甚為復(fù)雜，其病理生理過程主要由體液免疫及細(xì)胞免疫異常介導(dǎo)的血小板生成不足和破壞增多所致[1]，涉及細(xì)胞因子、細(xì)胞程序性死亡、氧化應(yīng)激、感染、妊娠和藥物等諸多方面[5]。無論是成人[6]亦或是兒童[7]，目前在ITP的診斷方面主要強(qiáng)調(diào)“排他性”診斷，即排除其他任何已知明確可致血小板減少的疾病，包括遺傳性血小板疾病。本例報(bào)告中，初診時(shí)2例患兒經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)除外血液造血系統(tǒng)惡性疾病及骨髓衰竭性疾病，并經(jīng)自身抗體譜篩查初步排除其他自身免疫性疾病，結(jié)合2例患兒曾經(jīng)對(duì)激素、丙球有效，故診斷為ITP。

目前，國內(nèi)外報(bào)道血小板減少癥轉(zhuǎn)化為血液造血系統(tǒng)惡性疾病的病例不多，大多轉(zhuǎn)化為髓系惡性疾病，包括AML和骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome, MDS)，但大部分見于成人。兒科患者以具有AML傾向的家族性血小板疾病(familial platelet disorder acute myelogenous leukemia, FPD/AML)最為常見[3,8]。FDP/AML絕大部分都以血小板減少和/或出血傾向?yàn)槭装l(fā)癥狀起病，是由位于21q22.1上的RUNX1基因發(fā)生突變所致，可有陽性血液病家族史[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，20%～65%的FDP/AML患者逐漸發(fā)展成為AML/MDS，其轉(zhuǎn)變過程長短不等，已有M1、M2、M4和M5的報(bào)道。

研究[9-10]顯示，F(xiàn)DP/AML發(fā)生MDS或AML的高峰年齡約40歲，預(yù)后較差，但目前報(bào)道的FDP/AML轉(zhuǎn)化為AML的兒科病例亦不在少數(shù)[11-12]。本研究2例患兒均以血小板減少起病，逐漸出現(xiàn)血象其他兩系改變，后經(jīng)骨髓MICM分型確診為AMKL，融合基因檢查證實(shí)為RUNX1基因陰性，這在兒童血液?？茖?shí)屬罕見，目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。自診斷ITP起病，至AMKL發(fā)病時(shí)間，2例患兒分別為14個(gè)月和5個(gè)月，轉(zhuǎn)化白血病時(shí)間較成人更短。遺憾的是，由于經(jīng)濟(jì)條件限制，本研究2例患兒皆未能完善遺傳性血小板減少癥相關(guān)基因檢測，這也為進(jìn)一步研究帶來了困難。

AMKL系一種較為少見的髓系起源急性白血病，在兒童血液專科，非21-三體伴發(fā)的AMKL被認(rèn)為是一種具有獨(dú)特腫瘤生物學(xué)特征的白血病亞型，其預(yù)后較差，治療強(qiáng)調(diào)早期行造血干細(xì)胞移植[13-14]。隨著流式單克隆抗體免疫標(biāo)記的廣泛應(yīng)用，使得血小板特異性的單克隆或多克隆抗體標(biāo)記可以識(shí)別巨核細(xì)胞，1985年FAB協(xié)作組確立了AMKL的診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]。本研究患兒1骨髓細(xì)胞學(xué)、骨髓病理學(xué)及流式免疫分型均提示AMKL；而患兒2骨髓細(xì)胞學(xué)形態(tài)雖不典型，但其白血病免疫分型提示CD41、CD61、CD36等較特異性的巨核系分化抗原均為陽性，故此診斷AMKL亦可成立。AMKL預(yù)后兇險(xiǎn)，建議在完全緩解后盡早行骨髓移植。本研究患兒1在骨髓完全緩解、配型成功后即行造血干細(xì)胞移植，目前仍然存活。

通過本文病例分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于反復(fù)血小板減少的兒科患者，尤其是小嬰兒，即使病程不長，也應(yīng)密切隨訪骨髓細(xì)胞學(xué)，及時(shí)完善HT相關(guān)基因檢查，達(dá)到及時(shí)診斷、早期治療的目的。同時(shí)，在今后的兒童ITP診療指南中，應(yīng)加入遺傳學(xué)檢查的建議，讓更多的患兒得到規(guī)范、合理的診治。