李學玲，李 茜，徐懷生，張建強

普洱學院生物與化學學院，云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南 普洱 665000

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃果茄果實采自云南省8 個不同州縣（普洱市思茅區(qū)、普洱市景東縣、曲靖市羅平縣、曲靖市師宗縣、紅河州個舊縣、昆明市尋甸縣、文山州馬關縣、楚雄州武定縣），曬干，粉碎，密封保存；綠原酸標準品購自合肥博美生物科技有限責任公司；乙醇、甲醇、丙酮、鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純試劑。

島津UV-2550 紫外-可見分光光度計，HH-6恒溫水浴鍋，F(xiàn)A3204B 電子天平。

1.2 方法[8～10]

1.2.1 綠原酸標準溶液的配制

稱取綠原酸標準品5.0mg，精密稱量，置于100ml 容量瓶中，繼續(xù)加入70%的乙醇溶解、定容、搖勻待用，此時濃度為50μg/ml。

1.2.2 最大吸收波長的確定

取綠原酸標準液20ml 于50ml 的容量瓶中，用70%乙醇定容，于紫外分光光度計下在200nm-500nm 波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖2。

圖2 綠原酸的吸收光譜

由圖2 可以看出在328nm 處出現(xiàn)了最大吸光度，故綠原酸的最大吸收波長確定為328nm，后續(xù)檢測波長均設定為328nm。

1.2.3 標準曲線的繪制

分別取綠原酸標準液0.00ml、2.00ml、4.00ml、8.00ml、12.00ml、16.00ml、20.00ml 于7 個50ml 容量瓶中，加70%的乙醇定容，搖勻，測吸光度，繪制標準曲線，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 綠原酸的標準曲線

由圖3 得出綠原酸的標準曲線的方程為Y=0.0285X-0.011，R2=0.9989，線性關系良好。

1.2.4 樣品中綠原酸的提取

稱取黃果茄粉末（紅河州個舊縣）2g（精確至0.01g）于250ml 圓底燒瓶中，加入160ml 70%乙醇溶液，加熱回流1.5h，冷卻至室溫減壓過濾，記錄濾液的體積，取其提取液1.00ml 于50ml 容量瓶中，70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，測其吸光度，計算提取率。

提取率E（%）=（C×V）/M

式中：C 表示濾液中綠原酸的含量（g/ml）；V 表示濾液的體積（ml）；M 表示黃果茄粉末質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對黃果茄綠原酸提取率的影響與討論

2.1.1 提取劑對黃果茄綠原酸提取率的影響

選取不同的提取劑在其他條件相同的條件下回流提取黃果茄中的綠原酸，根據(jù)濾液吸光度大小即可得出最佳提取劑，實驗結(jié)果如圖4 所示。

圖4 不同提取劑對綠原酸提取率的影響

如圖4 可知，不同的提取劑對綠原酸的提取效果不同，結(jié)果表明乙醇＞蒸餾水＞甲醇＞丙酮，其中乙醇和蒸餾水的提取率相差不大，考慮到環(huán)保、經(jīng)濟成本和實用性等因素，最終選取蒸餾水作為綠原酸的提取劑。

2.1.2 液料比對黃果茄綠原酸提取率的影響

準確稱量6 份黃果茄樣品0.60 g 于150ml 圓底燒瓶中，分別按液料比（ml/g）20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1 加入蒸餾水，在相同的溫度、時間條件下回流提取黃果茄中的綠原酸，冷卻至室溫，減壓過濾，分別記錄濾液的體積，取其提取液1.00ml 于50ml 容量瓶中稀釋定容，測其吸光度，計算綠原酸提取率。平行測定3 次，實驗結(jié)果如圖5 所示。

圖5 液料比對綠原酸提取率的影響

由圖5 可以看出液料比為40:1 之前，提取率隨液料比的增加而增大；當液料比達到40:1 時，綠原酸的提取率最大0.196%；之后隨著液料比的增加而略有下降，可能是因為液料比增加蒸發(fā)濃縮和減壓過濾的負荷，導致提取率略有下降。故綠原酸提取的最佳液料比為40:1。

2.1.3 溫度對黃果茄綠原酸提取率的影響

準確稱量6 份黃果茄樣品0.60g 于150ml 圓底燒瓶中，按液料比40:1 加入蒸餾水，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下的恒溫水浴鍋中，回流提取相同的時間，冷卻至室溫，減壓過濾，分別記錄濾液的體積，取其提取液1.00ml 于50ml 容量瓶中稀釋定容，測其吸光度，計算綠原酸提取率。平行測定3 次，實驗結(jié)果如圖6 所示。

圖6 溫度對綠原酸提取率的影響

由圖6 可知，80℃之前，提取率隨溫度升高而增大；當溫度為80℃時，綠原酸的提取率最大0.113%；超過80℃提取率略下降，這可能是由于綠原酸分子結(jié)構中的鄰苯二酚結(jié)構不穩(wěn)定，溫度過高時部分綠原酸會氧化分解，使提取率下降。故綠原酸的最佳提取溫度為80℃。

2.1.4 pH 對黃果茄綠原酸提取率的影響

準確稱量6 份黃果茄樣品0.60g 于150ml 圓底燒瓶中，按液料比40:1，加入pH 為2、3、5、7、9、11蒸餾水，分別在80℃的恒溫水浴鍋中回流提取相同時間，冷卻至室溫，減壓過濾，分別記錄濾液的體積，取其提取液1.00ml 于50ml 容量瓶中稀釋定容，測其吸光度，計算綠原酸提取率。平行測定3 次，實驗結(jié)果如圖7 所示。

圖7 pH 對綠原酸提取率的影響

由圖7 可知，當pH＜3 時，綠原酸的提取率隨pH 增大而增大；當pH=3 時，提取率最大0.102%；當pH＞3 時，提取率隨pH 增加而降低，這可能是因為綠原酸是極性酸，在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定，隨著pH的增加，綠原酸會有溶解的現(xiàn)象，導致其提取率下降。故綠原酸提取劑的最佳pH 為3。

2.1.5 時間對黃果茄綠原酸提取率的影響

準確稱量6 份黃果茄樣品0.60g 于150ml 圓底燒瓶中，按液料比40:1，加入pH 為3 的蒸餾水，分別在80℃的恒溫水浴鍋中回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，冷卻至室溫，減壓過濾，分別記錄濾液的體積，取其提取液1.00 ml 于50ml 容量瓶中稀釋定容，測其吸光度，計算綠原酸提取率。平行測定3 次，實驗結(jié)果如圖8 所示。

由圖8 可知，當提取時間t＜1.5h 時，綠原酸的提取率隨時間的增加而增大；當t=1.5h，綠原酸的提取率最大0.098%；當t＞1.5h 時，這可能是由于綠原酸分子結(jié)構中的鄰苯二酚結(jié)構不穩(wěn)定，長時間的加熱會使綠原酸氧化分解，導致提取率下降。提取率隨時間的增加而下降，故綠原酸提取的最佳提取時間為1.5h。

圖8 時間對綠原酸提取率的影響

2.2 響應面優(yōu)化設計結(jié)果與討論

2.2.1 響應面優(yōu)化實驗方法[11～13]與結(jié)果

在單因素實驗基礎上，確定液料比、溫度、時間、pH=4 個因素及水平值，運用 Design-Expert 10.0 軟件進行Box-Behnken 響應面設計和數(shù)據(jù)分析。每個因素的高中低水平分別 以1、0、-1 進行編碼，各試驗因素及水平值見表1。

表1 試驗因素及水平

采用Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，液料比40∶1、溫度80℃、時間1.5h、pH 為4。試驗設計及結(jié)果如表2 所示。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0 Trial 軟件對表2 中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得表3。

表3 回歸模型及其顯著性檢驗

通過軟件模擬出最后的回歸線方程為：

Y=-2.38904+0.022925A+0.041658B+0.329C+0.14917D+0.000028AB+0.0029AC-0.0002AD-0.0021BC-0.000125BD-0.0125AC-0.00034A2-0.00024B2-0.089C2-0.02D2，其中：A 表示液料比；B表示溫度；C 表示時間；D 表示pH。

由方差分析結(jié)果可知，該回歸方程呈極顯著性（P＜0.01），模型失擬項也呈極顯著性（P＜0.01）。A、C、A2、B2、C2、D2對綠原酸提取率的影響極顯著（P＜0.01）；B、D、AB、AC、AD、BC、BD 對綠原酸提取率的影響不顯著（P＞0.05）。

通過回歸方程的模擬，四個單因素之間兩兩相互響應對綠原酸提取率的影響，得到相應的響應面結(jié)果如下：

圖9-2 中提取率隨著溫度的變化，先增加后減小，液料比的變化趨勢相似。溫度90℃，液料比50:1時，提取率最大,溫度的變化曲面比較陡。由圖9-1來看，溫度方向等高線密集，說明溫度對提取率的影響大于液料比對提取率的影響。

圖9-1 溫度與液料比對提取率的影響等高線圖

圖9-2 溫度與液料比對提取率的影響

圖10-2 中提取率隨溫度的變化，先增加后減小，pH 的變化趨勢相似，溫度80℃，pH=3，提取率最大，pH 的變化曲面比較陡。由圖10-1 來看，pH 方向等高線密集，說明pH 對提取率的影響大于溫度的影響。

圖10-1 溫度和pH 對提取率的影響等高線圖

圖10-2 溫度和pH 對提取率的影響

圖11-2 中提取率隨著時間的變化，先增加后減少，溫度的變化趨勢相似，溫度80℃，時間1.5h，提取率最大，時間的變化曲面比溫度的變化曲面陡。由圖11-1 來看，時間方向等高線密集，說明時間對提取率的影響大于溫度的影響。

圖11-1 溫度和時間對提取率的影響等高線圖

圖11-2 溫度和時間對提取率的影響

圖12-2 中提取率隨著pH 的變化，先增加后減小，液料比的變化趨勢相似，pH=4,液料比50:1，提取率最大，pH 的變化曲面比較陡。由圖12-1 來看，pH 方向的等高線密集，說明pH 對提取率的影響大于液料比的影響。

圖12-1 液料比和pH 對提取率的影響等高線圖

圖12-2 液料比和pH 對提取率的影響

圖13-2 中提取率隨著時間的變化，先增加后減小，液料比的變化趨勢相似，時間2h，液料比50:1，提取率最大，時間的變化曲面比液料比的變化曲面陡。由圖13-1 來看，時間方向的等高線密集，說明時間的影響大于液料比對提取率的影響。

圖13-1 液料比和時間對提取率的影響等高線圖

圖13-2 液料比和時間對提取率的影響

圖14-2 中提取率隨著pH 的變化，先增加后減小，時間變化趨勢相似，pH=3，時間1.5h，提取率最大，時間的變化曲面相比于pH 的變化曲面陡。由圖14-1 來看，時間方向的等高線密集，說明時間對提取率的影響大于pH 的影響。

圖14-1 pH 和時間對提取率的影響等高線圖

圖14-2 pH 和時間對提取率的影響

2.2.2 結(jié)果驗證與討論

由響應面優(yōu)化結(jié)果，結(jié)合實驗室實際情況得出黃果茄中綠原酸的最佳提取方案是：以蒸餾水作為提取劑，液料比為50:1，溫度為90℃，pH 為2，時間為1h，綠原酸的提取率最大0.28%。在所選取的各因素范圍內(nèi)，按照響應值的影響順序，4 個因素對綠原酸提取率的影響順序是：時間＞pH＞溫度＞液料比。

2.3 不同地區(qū)黃果茄中綠原酸含量比較

根據(jù)響應面得出的最佳提取方案，對不同地區(qū)黃果茄中綠原酸進行了含量比較，黃果茄中均含有一定量的綠原酸；不同地區(qū)綠原酸的含量有所不同，普洱市思茅區(qū)的黃果茄中綠原酸含量最高，曲靖市師宗縣的黃果茄中綠原酸含量最低，主要是因為地勢和氣候的影響，導致綠原酸的含量存在差異。

3 結(jié)論與展望

試驗采用響應面優(yōu)化法，以液料比、溫度、時間、pH 為自變量，提取率為因變量，利用線性回歸方程和二項式擬合，對黃果茄中綠原酸的最佳提取工藝是：蒸餾水作為提取劑，液料比50:1，溫度90℃，pH 為2，時間1h，綠原酸的提取率最大0.28%，與預測0.268%相近。其中4 個條件對綠原酸提取率的影響程度從大到小為：時間＞PH＞溫度＞液料比。

對于黃果茄中綠原酸的提取率，除了用回流提取法外，還可以借助微波輔助提取、超聲波輔助提取。此外，劉藝等[14]通過超臨界流體萃取綠原酸，避免了提取過程中綠原酸的氧化分解。溫度對綠原酸的穩(wěn)定性和提取效率起到雙重影響的作用。本次實驗還進行了不同地區(qū)黃果茄中綠原酸的含量比較，可以看出普洱思茅的黃果茄中綠原酸的含量相對于其他地方略高，但總體來看，黃果茄中綠原酸的含量差異不大。