曾鈺，閆磊，劉亞林，曾紫君，姜存?zhèn)}

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微量元素研究中心/ 資源與環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢430070）

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物之一，其生產(chǎn)健康穩(wěn)定發(fā)展，對我國農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)村經(jīng)濟穩(wěn)定具有重要意義[1]。 近年來，隨著科技的進步，對棉花的可持續(xù)發(fā)展以及不斷提高其有效供給提出了新的挑戰(zhàn)[2]。 硼(B)是作物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一[3]，而棉花屬于中等需硼的作物[4]，一旦缺硼，便會導(dǎo)致棉花生長受阻，同時，對根、葉柄、葉片厚度等都會產(chǎn)生一定的影響[5]。除此之外，缺硼也會導(dǎo)致植物生理功能與代謝的紊亂[6]。例如，缺硼會使細胞膜透性增加，誘導(dǎo)活性氧類物質(zhì)的積累，從而產(chǎn)生脂膜過氧化作用影響細胞正常的結(jié)構(gòu)和功能[7,36]。

脯氨酸(Pro)作為一種多功能的氨基酸，在植物遭受逆境脅迫條件下可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[8]、化學(xué)伴侶[9]，活性氧清除劑[10]以及金屬螯合劑[11]來維持細胞的正常功能。 同時，它還能作為一種信號分子調(diào)控植物的生長發(fā)育[12]。 脯氨酸是植物受到脅迫的一種信號物質(zhì)，許多研究證實，植物中脯氨酸的合成途徑有兩條： 谷氨酸途徑(Glutamate pathway，Glu)和鳥氨酸(Ornithine pathway，Orn)途徑，它們的主要區(qū)別在于初始底物的不同[13]。 其中，合成脯氨酸途徑中涉及的關(guān)鍵酶分為兩類： 一是Glu 中的合成酶， 包括Δ1- 吡咯啉-5- 羧酸合成酶 (Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS) 和Δ1- 吡 咯 啉-5- 羧 酸 還 原 酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)，另一類則是Orn 中的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Ornithine-δaminotransferase，OAT)。 植物中脯氨酸的積累除了可以通過促進脯氨酸的合成，也可以通過抑制其降解來實現(xiàn)。 由脯氨酸到谷氨酸的氧化途徑是在兩種酶的催化下進行的，一個是脯氨酸脫氫酶(Proline dehydrogenase，PRODH)， 另一個為吡咯啉-5- 羧酸脫氫酶(Pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase，P5CDH)。 許多研究發(fā)現(xiàn)，對受到外界環(huán)境脅迫的植株施用外源脯氨酸可以產(chǎn)生預(yù)防或恢復(fù)作用[14]。Paulo 等[15]通過施用不同濃度外源脯氨酸對玉米耐鹽性的研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施脯氨酸可以改變毒性離子和有機溶質(zhì)含量。 Zouari等[16]發(fā)現(xiàn)，外源脯氨酸通過提高幼年棗椰樹的光合活性和抗氧化酶活性以及改善水分狀況來緩解鎘脅迫。 然而，高濃度的脯氨酸會導(dǎo)致代謝失衡，從而損害植物生長與發(fā)育[17]。例如，Bruria[18]發(fā)現(xiàn)在鹽敏感的番茄中，添加高濃度外源脯氨酸不但不能抵消鹽脅迫效應(yīng)，反而還會產(chǎn)生毒性而導(dǎo)致植株死亡。 另外，脯氨酸還可以通過調(diào)節(jié)酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)有效減少氧化損傷[19]。 目前關(guān)于施用外源脯氨酸的研究主要集中于緩解金屬離子毒害，鹽、干旱[20]、冷害[21]脅迫等方面，Wu等[22]在進行缺硼條件下枳殼幼苗根系代謝組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)， 缺硼顯著增加了根中的脯氨酸含量，但是在重新供硼1 周后，其脯氨酸含量能恢復(fù)到正常硼濃度處理的水平，說明脯氨酸對缺硼脅迫的響應(yīng)具有較強的敏感性；近期研究表明，外源脯氨酸的施用能夠緩解缺硼對枳殼幼苗造成的損傷，但加劇了枳殼幼苗的鋁毒害[23]。而對于外源脯氨酸能否緩解棉花的缺硼脅迫尚不清楚。 因此，本試驗以鄂抗8 號棉花品種為材料，分析添加外源脯氨酸對缺硼棉花苗期生長、生理特性以及脯氨酸代謝的影響，揭示外源脯氨酸對缺硼棉花幼苗影響的生理機制，為棉花生產(chǎn)中脯氨酸的施用提供理論依據(jù)。

試驗于2019 年4－5 月在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進行，試驗材料為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳育種研究室提供的鄂抗8 號棉花品種。 采用改良的阿夫多寧和阿農(nóng)營養(yǎng)液培養(yǎng)[24]，配方為：0.240 g·L－1NH4NO3、0.100 g·L－1Na2HPO4·12H2O、0.100 g·L－1NaH2PO4·2H2O、0.360 g·L－1CaCl2·2H2O、0.500 g·L－1MgSO4·7H2O、48.5 mg·L－1Fe-EDTA、1.81 mg·L－1MnCl2·4H2O、0.22 mg·L－1ZnSO4·7H2O、0.08 mg·L－1CuSO4·5H2O、0.09 mg·L－1Na2MoO4·2H2O。 如表1 所示，本試驗設(shè)置以下6 個處理，每個處理4 次重復(fù)，共培養(yǎng)棉花幼苗24 株。

將棉花種子用濃硫酸進行脫絨，之后挑選均勻飽滿的種子， 在36 ℃的烘箱中處理48 h 以破除種子休眠，然后用60 ℃的水浸泡6 h，將浸泡好的種子置于紗布上催芽， 待初生根長至1 cm左右時再將其移到盛蒸餾水的塑料桶上繼續(xù)培養(yǎng)。 待子葉展開之后轉(zhuǎn)移到黑色塑料桶中培養(yǎng)。營養(yǎng)液每7 d 更換1 次， 第1 周采用1/4 濃度培養(yǎng)，第2 周用1/2 濃度處理，從第3 周開始使用全量營養(yǎng)液濃度培養(yǎng)， 每4 h 通氣20 min， 共培養(yǎng)39 d，棉花植株出現(xiàn)明顯癥狀后收獲。

表1 不同硼和脯氨酸濃度處理Table 1 Treatment with different concentrations of boron and proline

試驗完成收樣當天，先從每個處理中挑選有代表性的1 株棉花拍照，之后，將樣品用超純水洗凈，分為根、莖和葉3 個部分；用剪刀分別從每株樣品的同一部位（葉片選取倒3 葉，根選取根尖部分）剪取相同質(zhì)量的樣品，錫箔紙包好放入裝有液氮的泡沫箱中，帶回實驗室用液氮進行研磨，放入－80℃冰箱中保存，用于相關(guān)指標的測定；其余樣品測定完株高、根長、鮮物質(zhì)質(zhì)量之后，于105 ℃的烘箱中殺青30 min，在75 ℃下烘干至恒重，稱完干物質(zhì)質(zhì)量后粉碎過篩用于硼含量的測定。

硼含量測定。 粉碎后的樣品在500 ℃馬弗爐灰化5 h 后使用0.1 mol·L－1的HCl 溶液浸提，取濾液用姜黃素比色法測定硼[25]。

脯氨酸含量測定。 稱取根和葉片鮮樣0.5 g，用3%磺基水楊酸溶液5 mL 進行研磨提取，在沸水浴中提取10 min， 冷卻后吸取2 mL 濾液置于10 mL 離心管中，加入2 mL 冰醋酸和2 mL 酸性茚三酮，沸水浴加熱30 min 后加入4 mL 甲苯顯色，520 nm 處比色[26]。

抗氧化酶以及MDA 含量測定。 根據(jù)Rout等[27]的方法對葉片和根系中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)以及抗壞血酸過氧化物酶(APX) 進行提取； 采用NBT[28]法(EC 1.15.1.1)測定SOD 活性，愈創(chuàng)木酚法[29](EC 1.11.1.7)測 定POD 的 活 性，CAT[30](EC 1.11.1.6)、APX[31](EC 1.11.1.11)用分光光度計(UV-1800，Mapada) 測量不同吸光度下的光密度(OD)變化；MDA 含量用硫代巴比妥酸法測定[32]。

H2O2含量測定。 稱取0.5 g 鮮樣， 用0.067 mol·L－1磷酸緩沖液(PBS)5 mL 提取之后，用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。 脯氨酸代謝酶測定。 P5CS、PRODH、P5CR 和OAT 4 種酶液的提取分別參照Shan 等[33-34]，用江蘇酶標生物有限公司的Elisa 試劑盒測定。

采用Excel 軟件，利用統(tǒng)計分析軟件SPSS21對各處理試驗數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析(ANOVA)，用Origin2017 作圖。

如圖1 所示，LB 處理下棉花幼苗正常的生長發(fā)育受到了抑制，頂芽葉片萎縮，葉片肥厚，根系生長緩慢且呈褐色，側(cè)根膨大加粗；而MB 處理以及CK 處理則未出現(xiàn)此癥狀。 表2 可知，不同硼濃度下添加外源脯氨酸對棉花苗株高和葉片數(shù)的變化無明顯差異；施用外源脯氨酸(CK＋Pro)棉花幼苗葉片鮮物質(zhì)質(zhì)量與干物質(zhì)質(zhì)量分別比CK 下降了35.9%和54.3%，表明CK 處理下添加脯氨酸抑制了棉花幼苗的生長。 而從統(tǒng)計學(xué)水平來看，硼和脯氨酸的交互作用主要抑制了葉片干物質(zhì)質(zhì)量、鮮物質(zhì)質(zhì)量的積累，從而影響棉花植株總干物質(zhì)質(zhì)量、 總鮮物質(zhì)質(zhì)量的變化，而對株高，葉片數(shù)以及根和莖的干物質(zhì)質(zhì)量、鮮物質(zhì)質(zhì)量變化無顯著影響。

圖1 不同處理對棉花幼苗長勢影響Fig. 1 Effects of different treatments on the growth of cotton seedlings

從表3 看出，隨著硼濃度的升高，根、莖和葉中的硼含量均呈顯著上升的趨勢，其中葉片中的硼含量明顯高于根和莖；與LB 處理相比，添加外源脯氨酸(LB＋Pro)增加了根、莖和葉中的硼含量，其中，根、莖部位硼含量比LB 增加1.3 和1.6倍；CK＋Pro 處理的根、 莖和葉中的硼含量相對CK 處理無顯著變化。從統(tǒng)計學(xué)水平上看，硼和脯氨酸的聯(lián)合施用顯著減少了硼向地上部轉(zhuǎn)移和分配，雖然不同硼與脯氨酸濃度分別對根中的硼含量產(chǎn)生顯著影響，但是兩者的交互作用卻對根中硼含量的增加無顯著效應(yīng)。

從外源脯氨酸施用對硼在棉花幼苗各部位的分配可以看出，適硼處理(CK)下施用外源脯氨酸對硼在棉花各部位的分配率變化不明顯。 在MB 和LB 處理下添加外源脯氨酸 (MB＋Pro、LB＋Pro)降低了葉片中硼的分配率，而明顯促進了硼在根中的分配（圖2）。

如表4 所示，隨著硼濃度的升高，葉片中脯氨酸含量均下降。 在葉片中，LB 和MB 處理下，添加外源脯氨酸后(LB＋Pro、MB＋Pro)，脯氨酸含量分別下降了76.2%和36.8%； 而在根中，相較于LB 處理，CK 處理脯氨酸含量顯著下降51.3%， 不同硼濃度處理下添加外源脯氨酸對根中脯氨酸含量無顯著影響。 添加外源脯氨酸在不同硼濃度處理下均使根系中的H2O2含量顯著上升，CK＋Pro、MB＋Pro 和LB＋Pro 比CK、MB和LB 處理分別提高了1.2、1.2 和0.71 倍；CK 和MB 處理下葉片的H2O2含量較LB 處理顯著下降， 添加外源脯氨酸后顯著降低了CK 和LB 處理下葉片中的H2O2含量， 而增加了MB 處理中葉片的H2O2含量。 LB 和MB 處理下添加外源脯氨酸對葉片中MDA 含量無顯著差異， 而CK 處理時添加脯氨酸顯著降低了葉片中MDA 含量；根中LB＋Pro 和CK＋Pro 相較于LB 和CK 處理，MDA 含量分別增加了0.3 和1.6 倍。 以上結(jié)果表明，不同硼濃度下添加外源脯氨酸會使根系中的H2O2及MDA 含量增加， 從而對根系造成一定損傷，但可降低葉片中這些逆境脅迫物質(zhì)的積累。

表2 外源脯氨酸對不同硼濃度棉花幼苗生長指標的影響Table 2 Effects of exogenous proline on growth index of cotton seedlings with different boron concentrations

表3 外源脯氨酸對不同硼濃度棉花幼苗各部位硼濃度的影響Table 3 Effects of exogenous proline on boron content in different parts of cotton seedlings with different boron concentrations mg·kg-1

圖2 外源脯氨酸對不同硼濃度處理棉花幼苗各部位硼濃度分配的影響Fig. 2 Effects of Exogenous Proline on the distribution of boron in different parts of cotton seedlings with different boron concentrations

表4 外源脯氨酸對不同硼濃度棉花幼苗中脯氨酸、過氧化氫和丙二醛含量的影響Table 4 Effects of exogenous proline on the contents of proline, H2O2 and MDA in cotton seedlings treated with different boron concentrations

從表5 看出，葉片中不同硼濃度處理間SOD活性無顯著差異， 根系中LB＋Pro 處理的SOD活性相對于LB 處理增加了34.3%。 在LB 處理下， 添加外源脯氨酸使葉片和根系中的POD 活性下降了38.5%和19.1%。 CAT 活性隨著硼濃度的增加而增加，MB 處理下， 添加外源脯氨酸(MB＋Pro) 顯著增加葉片和根中CAT 的活性；CK＋Pro 相對于CK 處理， 葉片中CAT 活性降低了36.9%而根中增加了36.3%。LB 處理下，外源脯氨酸的施用(LB＋Pro)顯著增加了葉片和根中的APX 活性。 說明外源脯氨酸可以增加植物體內(nèi)APX 酶活性來緩解缺硼脅迫。

表5 外源脯氨酸對不同硼濃度棉花幼苗中抗氧化酶活性變化的影響Table 5 Effects of exogenous proline on the activities of antioxidant enzymes in cotton seedlings treated with different boron concentrations

隨著硼濃度的升高，OAT 和PRODH 酶的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在MB 處理時活性最高， 不添加脯氨酸不同硼濃度對P5CS 酶活性變化無顯著影響； 外源脯氨酸的施用(LB＋Pro、CK＋Pro) 顯著提高了LB 和CK 處理下P5CS 的活性， 分別增加了26.4%和21.8%（圖3A）；LB 和MB 條件下添加脯氨酸 (LB＋Pro、MB＋Pro) 顯著增加了P5CR 活性， 而CK＋Pro相較于CK 處理P5CR 的活性無明顯差異 （圖3B）；LB 條件下添加脯氨酸(LB＋Pro)使OAT 的活性增加了90.0%（圖3C）； 在LB 和MB 處理下，外源脯氨酸的施用(LB＋Pro、MB＋Pro)對葉片中PRODH 的活性呈現(xiàn)相反的趨勢， 相對于LB 處理，LB＋Pro 處理下PRODH 的活性增加了25.6%，而在MB 處理中，添加脯氨酸(MB＋Pro)使PRODH 活性下降了27.3 %，CK 濃度下添加脯氨酸(CK＋Pro)對棉花葉片的PRODH 活性影響不大， 雖有上升的趨勢， 但差異不顯著 （圖3D）。

低硼對多數(shù)植物的生長具有抑制作用。 研究表明，適量施用外源脯氨酸能夠緩解植物生長過程中所遭受的逆境脅迫，但施用過高濃度脯氨酸也會在一定程度上抑制植物的生長，甚至加重脅迫損傷[35]。 Bruria[18]發(fā)現(xiàn)無論是否遭受逆境脅迫，施用外源脯氨酸均顯著降低了番茄幼苗的鮮物質(zhì)質(zhì)量。 在本試驗也發(fā)現(xiàn)適硼濃度條件下施用脯氨酸會顯著降低棉花幼苗的總干物質(zhì)質(zhì)量、總鮮物質(zhì)質(zhì)量（表2），這可能是由于施用外源脯氨酸產(chǎn)生了一定的毒性作用而抑制了植株的生長。 同時，本研究還發(fā)現(xiàn)缺硼條件下添加外源脯氨酸可以顯著促進棉花根系對硼的吸收（表3，圖2），說明脯氨酸的添加對于緩解缺硼脅迫在一定程度上產(chǎn)生了積極作用。

圖3 外源脯氨酸對不同硼濃度棉花幼苗葉片脯氨酸代謝酶活性的影響Fig. 3 Effects of exogenous proline on proline metabolizing enzyme activities in leaves of cotton seedlings treated with different boron concentrations

研究表明， 缺硼會導(dǎo)致細胞膜透性升高，誘導(dǎo)活性氧類物質(zhì)的積累，從而產(chǎn)生脂膜過氧化作用[36]。正常情況下，植物可以激活體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)（包括SOD、POD、CAT 和APX 等細胞膜保護酶）清除細胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)，而減少對細胞質(zhì)膜的氧化損傷[37]，但是，缺硼對抗氧化酶活性的改變會影響植物清除活性氧類物質(zhì)的能力[38]。 已有研究表明，脯氨酸能增強植物體內(nèi)CAT、SOD 和POD 等抗氧化酶活性來清除活性氧[39]，本試驗中發(fā)現(xiàn)，低硼條件下添加脯氨酸能增加根和葉片中SOD 和APX 活性， 而降低了POD 的活性 （表5），這與宋敏等[40]在鎘脅迫下添加外源脯氨酸對小麥幼苗生長的影響得出的結(jié)果相似。 Ghaffari等[41]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下施用脯氨酸顯著降低甜菜葉片中H2O2含量，這與本試驗研究結(jié)果一致，說明脯氨酸的添加使葉片受到的氧化損傷減弱。 李愛軍等[42]研究表明，脯氨酸處理對低溫脅迫下高粱葉片MDA 含量的降低有一定影響， 但是與不添加脯氨酸相比差異不顯著，這與本試驗發(fā)現(xiàn)的研究結(jié)果類似。 以上結(jié)果說明缺硼脅迫下添加外源脯氨酸通過增強抗氧化酶活性同時減少葉片中MDA 和H2O2含量以保護細胞質(zhì)膜完整性（表4）。

Suekawa 等[43]通過對比施用外源脯氨酸對水稻和煙草生長的影響，發(fā)現(xiàn)外源脯氨酸顯著增加了水稻培養(yǎng)細胞的脯氨酸含量，而對煙草細胞無明顯影響，說明煙草和水稻對外源脯氨酸的吸收可能不同，并且也表明脯氨酸的施用對植物生長產(chǎn)生的影響因植物的種類不同而存在差異。 Yu等[44]在探究施用外源脯氨酸對水稻鎘脅迫的影響時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時間在72 h 之后，根中脯氨酸含量與對照相比無顯著差異，這與本試驗中無論是否缺硼，添加脯氨酸之后根中脯氨酸含量與不添加脯氨酸相比均無顯著差異的結(jié)果相似，因此也說明，脯氨酸含量的變化可能與培養(yǎng)時間的長短有關(guān)。 在本試驗中，通過對棉花幼苗葉片中脯氨酸相關(guān)代謝酶的活性變化分析發(fā)現(xiàn)，與適硼處理相比， 低硼脅迫顯著降低了P5CR 和OAT 合成酶的活性， 而對P5CS 合成酶和PRODH 分解酶的活性變化不顯著，在低硼處理下施用外源脯氨酸之后發(fā)現(xiàn)以上4 個酶的活性均顯著增加（圖3）。本研究中，外源脯氨酸的施用反而降低了棉花幼苗葉片中脯氨酸含量，其原因可能是低硼條件下外源脯氨酸的添加雖然使得P5CS、P5CR 及OAT 合成酶活性升高，但同時分解酶PRODH 活性顯著增加，導(dǎo)致了脯氨酸降解高于合成，從而葉片中脯氨酸的積累降低，這與Paulo 等[45]的研究結(jié)果相似，即玉米在鹽脅迫下施用脯氨酸在培養(yǎng)時間7 d 時葉片內(nèi)源脯氨酸含量顯著增加，此時P5CS 活性降低，而PRODH 的活性增加，從而防止脯氨酸可能產(chǎn)生的毒害作用，但隨著培養(yǎng)時間的增加，在14 d 時脯氨酸含量呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢。

在適硼濃度下添加外源脯氨酸對棉花的生長有一定的抑制作用。 在缺硼處理時施用外源脯氨酸促進了根系對硼的吸收，通過提高葉片中抗氧化酶APX 活性而降低葉片中膜脂過氧化物質(zhì)的積累。 另外，與適硼處理相比，低硼脅迫導(dǎo)致植株體內(nèi)脯氨酸的積累，而低硼處理添加脯氨酸會降低葉片中脯氨酸的含量，其誘因主要是影響了脯氨酸代謝途徑（谷氨酸和鳥氨酸途徑）中關(guān)鍵的合成酶和分解酶活性，主要是由于促進分解代謝的脯氨酸脫氫酶活性顯著增加所致。