劉露 翟啟明 張青 劉安琪 劉文佳 金鈁

脫落乳牙牙髓干細(xì)胞(SHED)取自人類自然更替的乳牙牙髓，具有高度增殖能力；且來源于神經(jīng)嵴的外胚間充質(zhì)，又具有胚胎早期間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)良性能，是組織工程技術(shù)中理想的種子細(xì)胞[1-2]。SHED具有多向分化能力，可以成牙本質(zhì)，成牙髓、成骨、成脂、成神經(jīng)甚至成肝細(xì)胞分化等[1]；有廣泛的應(yīng)用前景，如常用于牙髓牙周再生[3]、顱骨頜骨缺損[4]及皮膚損傷[5]等的治療，更因其為神經(jīng)嵴來源，在神經(jīng)損傷修復(fù)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，也可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[6-7]。脊髓屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，脊髓損傷后可引起不同節(jié)段的癱瘓，給患者和家人帶來極大痛苦，因此對它的治療意義重大；然而目前臨床上對脊髓損傷尚無有效療法[8]，對此探究任重道遠(yuǎn)。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已初步證實(shí)SHED聚合體有可能成為治療大鼠脊髓損傷的新療法，且SHED聚合體的療效要優(yōu)于UCMSCs聚合體[9]；本研究想通過聯(lián)合治療來進(jìn)行療效優(yōu)化，探究基于SHED聚合體的治療大鼠脊髓損傷的更優(yōu)療法。大量實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用干細(xì)胞懸液顯微注射，創(chuàng)造有利于脊髓損傷恢復(fù)的微環(huán)境進(jìn)行治療[10-11]?？紤]到在脊髓損傷區(qū)植入的SHED聚合體也需要有利于其存活及發(fā)揮作用的微環(huán)境，且SHED在細(xì)胞來源、神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子分泌及免疫調(diào)節(jié)等方面具有很大優(yōu)勢[12]，猜想聯(lián)合SHED細(xì)胞懸液注射或許能最大限度地激發(fā)SHED對脊髓損傷的修復(fù)潛能。因此，本實(shí)驗(yàn)擬探究聯(lián)合SHED細(xì)胞懸液注射是否能有效提高SHED聚合體治療大鼠脊髓損傷的療效。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)基(Gibco,美國)； 胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司)； 膠原酶、維生素C、 1%戊巴比妥鈉， 4%多聚甲醛， TritonX-100(Sigma,美國)； GFAP抗體、NF抗體(CellSignalingTechnology, 美國)； MBP抗體、HuNu抗體、Fluor488二抗(Abcam, 英國)； Cy3IgG二抗(Jackson,美國)； BDNF、NT-3、NGF的ELISA檢測試劑盒(R&D Systems,美國)； Hamilton微量注射器(Hamilton， 5 μl，瑞士)； WPI顯微注射系統(tǒng)(武漢微科精密儀器有限公司)； EndeavorCR術(shù)中脊髓監(jiān)護(hù)儀(廣州尼高力科學(xué)儀器公司)； 冰凍切片機(jī)(Leica，德國)； 激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性SD大鼠28 只(180～200 g)，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序符合本校動(dòng)物使用及管理委員會規(guī)定。

1.3 SHED聚合體的培養(yǎng)

將P5代SHED以3×105個(gè)/孔的密度接種于12 孔板中，細(xì)胞融合率達(dá)85%左右時(shí)棄去原培養(yǎng)液，換成含VC(50 μg/ml)的α-MEM培養(yǎng)液，隔天換液，培養(yǎng)7 d左右即可形成聚合體(具體方法參見已發(fā)表文章[9])。聚合體培養(yǎng)成熟后立即進(jìn)行體內(nèi)移植治療。

1.4 SHED細(xì)胞懸液的制備

選用P5代SHED，接種至培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞融合率約達(dá)90%時(shí)，消化離心重懸，調(diào)成細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/μl的細(xì)胞懸液。

1.5 大鼠全橫斷脊髓損傷模型建立及分組治療

建模：去除大鼠T8、T9椎板，在暴露的T8-9脊髓的中間部位用顯微剪進(jìn)行全橫斷損傷，之后均勻剪除一段脊髓組織，形成2 mm間隙。脊髓全橫斷后大鼠后肢癱瘓。

治療：間隙內(nèi)可植入SHED聚合體。損傷脊髓的兩斷端可聯(lián)合SHED懸液注射，注射位點(diǎn)：距損傷斷端約2～3 mm,中線兩側(cè)各2 mm處進(jìn)針，注射深度1.5 mm,每個(gè)位點(diǎn)注射2.5 μl(1×105個(gè)/μl)。

實(shí)驗(yàn)分組: ① SHAM組(n=6)：僅去除T8、T9椎板； ② SCI only組(n=6)：僅建模不治療； ③ SHED-CA組(n=8)：建模后，在2 mm間隙內(nèi)移植SHED聚合體治療并在其表面用纖維蛋白膠覆蓋； ④ SHED-CA+SHED組(n=8)：建模后，在2 mm間隙內(nèi)移植SHED聚合體且表面覆蓋纖維蛋白膠，并在脊髓損傷兩斷端聯(lián)合SHED懸液注射治療。

1.6 SHED治療大鼠全橫斷脊髓損傷的觀察指標(biāo)

1.6.1 行為學(xué)評分(BBB評分) 術(shù)后每周進(jìn)行BBB評分檢測，觀察大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。將大鼠逐只放至開放場地中，每只5 min，根據(jù)BBB評分標(biāo)準(zhǔn)由至少兩名實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行盲評。 0 分為完全癱瘓， 21 分為正常。

1.6.2 大鼠脊髓組織免疫熒光染色 第12周末，大鼠心臟灌注后，取損傷區(qū)脊髓組織包埋做冰凍切片，并對GFAP、MBP、NF等神經(jīng)源性標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光染色。加入一抗過夜后，加入熒光二抗避光孵育，染核，封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。所用一抗：GFAP(兔源)1∶300，MBP(兔源)1∶1 000， NF(兔源)1∶1 000，HuNu(小鼠來源) 1∶500； 二抗：Fluor488(驢抗兔)1∶800， Cy3IgG(羊抗小鼠)1∶300。

1.6.3 脊髓損傷后BDNF、NT-3、NGF分泌的ELISA檢測 分別于第1、 4和12 周結(jié)束時(shí)各組隨機(jī)選取1 只大鼠，用生理鹽水心臟灌注后迅速從脊髓損傷區(qū)取出長約2 cm的脊髓組織，用勻漿器及RIPA裂解液制備脊髓組織勻漿，提取上清液進(jìn)行ELISA檢測(具體檢測方法參見試劑盒說明書)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism和SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用ANOVA方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BBB評分

大鼠全橫斷脊髓損傷后，雙后肢完全癱瘓。SCI only組未進(jìn)行治療，BBB評分前3 周基本為0，之后有一定恢復(fù)但最高不超過3 分。SHED-CA組和SHED-CA+SHED組與SCI only組比，后肢運(yùn)動(dòng)功能均有明顯恢復(fù)，分別于第7 周、 第10 周進(jìn)入平臺期；且從第4 周起聯(lián)合SHED懸液注射組的療效要好于單純SHED聚合體治療組，至第9～12 周時(shí)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖 1)。

2.2 脊髓組織免疫熒光染色結(jié)果

GFAP(圖 2)：星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，脊髓損傷后參與瘢痕組織形成，而瘢痕組織會阻礙軸突再生。SCI only組出現(xiàn)大量陽性標(biāo)記，而SHED-CA組僅有極少量陽性標(biāo)記，SHED-CA+SHED組則幾乎無陽性標(biāo)記。表明：SHED-CA可有效減少瘢痕形成，且聯(lián)合SHED懸液注射后能更好地抑制瘢痕形成。GFAP與移植細(xì)胞HuNu共定位結(jié)果顯示陰性，表明：所移植的SHED細(xì)胞沒有出現(xiàn)向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。

圖 1 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評分(*:P<0.05)

Fig 1 BBB scores of the locomotor function of rats' hind limbs(*:P<0.05)

MBP(圖 3)：髓鞘即少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，主要分布于細(xì)胞漿膜面。脊髓損傷后髓鞘細(xì)胞多壞死、凋亡，相應(yīng)的SCI only組幾乎無陽性標(biāo)記。SHED-CA+SHED組有較多明顯的陽性標(biāo)記，而SHED-CA組僅有少量陽性標(biāo)記，表明：SHED聚合體聯(lián)合SHED懸液注射比單純SHED聚合體治療有更好的髓鞘保護(hù)作用或能再生修復(fù)髓鞘損傷。且SHED-CA+SHED組與移植細(xì)胞標(biāo)記HuNu共定位顯示有極少量陽性，說明：SHED聚合體治療可能促進(jìn)了內(nèi)源性髓鞘細(xì)胞再生，其自身并沒有出現(xiàn)向髓鞘細(xì)胞的直接分化，但聯(lián)合SHED懸液注射可能有助于SHED分化為髓鞘細(xì)胞。

圖2 GFAP與HuNu免疫熒光共染 (左：×10， 右：×200)

Fig 2 GFAP and HuNu co-staining with immunofluorescence staining (Left: ×10; Right: ×200)

圖3 MBP與HuNu免疫熒光共染 (左：×10， 右：×200)

Fig 3 MBP and HuNu co-staining with immunofluorescence staining (Left: ×10， Right: ×200)

NF(圖4)：神經(jīng)纖維標(biāo)記物，呈絲線狀分布。脊髓損傷后大量神經(jīng)纖維壞死、凋亡，SCI only組幾乎無陽性標(biāo)記。經(jīng)治療后，SHED-CA+SHED組有較多明顯的陽性標(biāo)記，SHED-CA組有少量陽性標(biāo)記，說明：SHED聚合體聯(lián)合SHED懸液注射對神經(jīng)纖維的修復(fù)效果更好。但與移植細(xì)胞HuNu共定位結(jié)果顯示陰性，表明：SHED可能并不是通過直接分化成神經(jīng)元而發(fā)揮作用，可能促進(jìn)了固有脊髓神經(jīng)元的內(nèi)源性再生。

2.3 脊髓損傷后BDNF、NT-3、NGF分泌的ELISA檢測結(jié)果

神經(jīng)營養(yǎng)因子的存在對脊髓損傷修復(fù)、軸突生長及再生、突觸形成及重組等起著關(guān)鍵性作用。脊髓損傷后BDNF、NT-3、NGF這3 種神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌量在1 周以內(nèi)有少量增加，隨后迅速減少， 4 周后即降到較低水平；而用SHED進(jìn)行治療后，有效促進(jìn)了它們的分泌，且SHED聚合體聯(lián)合SHED懸液注射的效果更好：相同時(shí)間點(diǎn)SHED-CA+SHED組分泌量一直是最多的，且在第12 周時(shí)與SHED-CA組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；雖然4 周后它們的分泌量均逐漸減少，但聯(lián)合SHED懸液注射組降低幅度更小。

3 討 論

有實(shí)驗(yàn)已證明SHED可有效修復(fù)脊髓損傷，使其有較好的功能恢復(fù)，他們采用的是SHED細(xì)胞懸液注射治療，或SHED復(fù)合外源性支架材料的組織工程方法治療[13-14]；而本課題組創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)SHED聚合體治療脊髓損傷更是有不錯(cuò)療效[9]； 并且為探究基于SHED聚合體的具有更佳療效的療法，本實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合治療的方法進(jìn)行研究?？紤]到不同的移植途徑可能發(fā)揮不同的作用：懸液注射治療的細(xì)胞更容易遷徙及分泌各種因子，可能對局部微環(huán)境的調(diào)控起到作用；而聚合體更好地保存了細(xì)胞間天然分子連接及物理、化學(xué)、生物信息，有利于細(xì)胞間信號傳遞并行使功能；故本實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合SHED懸液注射的方法來探究能否提高SHED聚合體的療效。

本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：BBB評分發(fā)現(xiàn)聯(lián)合SHED懸液注射可有效提高SHED聚合體治療大鼠脊髓損傷的療效，第4周之后逐漸明顯，尤其第9～12 周有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，最高評分達(dá)12 分，也高于同類研究中的BBB評分值(8 分)[9,14]。免疫熒光染色結(jié)果顯示與單純SHED聚合體治療組相比，聯(lián)合SHED懸液注射可更好地抑制瘢痕組織形成，并使髓鞘及神經(jīng)纖維出現(xiàn)再生修復(fù)；且與HuNu共定位結(jié)果顯示聯(lián)合SHED懸液注射有助于SHED分化為髓鞘細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)纖維再髓鞘化。同時(shí)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的檢測結(jié)果顯示SHED聚合體治療可明顯增加BDNF、NT-3、NGF的分泌，且聯(lián)合SHED懸液注射增加量更多。BDNF、NT-3主要可增加運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，而NGF對早期感覺功能的發(fā)育及存活作用較大[15]，這也與本研究關(guān)注的大鼠運(yùn)動(dòng)與感覺功能有明顯恢復(fù)這一現(xiàn)象相契合。

圖4 NF與HuNu免疫熒光共染 (左：×10， 右：×200)

Fig 4 NF and HuNu co-staining with immunofluorescence staining (Left:×10， Right:×200)

圖 5 術(shù)后第1、 4、 12 周BDNF、 NT-3、 NGF分泌的ELISA檢測

Fig 5 BDNF, NT-3 and NGF secretion detected by ELISA at 1， 4 and 12 weeks after operation

最終本研究得出初步結(jié)論：聯(lián)合SHED懸液注射能明顯提高SHED聚合體治療大鼠脊髓損傷的療效。本研究采用早期的SHED細(xì)胞，并在誘導(dǎo)成聚合體時(shí)采用高濃度培養(yǎng)，以減少體外培養(yǎng)時(shí)間，盡量保持其神經(jīng)嵴來源的特性；之后未經(jīng)成神經(jīng)誘導(dǎo)而直接植入脊髓損傷后的環(huán)境中，使其得到自然誘導(dǎo)。同時(shí)在脊髓損傷斷端聯(lián)合SHED懸液注射，使其分泌的多種因子能有效調(diào)節(jié)局部微環(huán)境，促進(jìn)軸突再生。本研究推測，有如此好的療效是因?yàn)椋篠HED懸液注射促進(jìn)分泌更多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，創(chuàng)造有利于脊髓損傷恢復(fù)的微環(huán)境，除了促進(jìn)內(nèi)源性脊髓再生，SHED自身也向髓鞘細(xì)胞方向分化，從而重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路，使得運(yùn)動(dòng)和感覺功能有明顯恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)通過聯(lián)合SHED懸液注射的方式，探究到了基于SHED聚合體的治療大鼠脊髓損傷的更為有效的療法，充分探究了SHED在中樞神經(jīng)損傷修復(fù)方面的應(yīng)用，也為臨床治療脊髓損又提供一條新思路。本研究發(fā)現(xiàn)SHED可能通過向髓鞘細(xì)胞分化及旁分泌機(jī)制創(chuàng)造有利于脊髓損傷恢復(fù)的微環(huán)境而發(fā)揮作用，不過具體機(jī)制還有待深入討論。而且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類實(shí)際情況相差還很大，仍需要大量工作去探究此方法在更高級動(dòng)物甚至人體上的可行性及有效性。