張晏源 黃鑫 呂前欣 侯燕 靳丹 高曄 劉富偉 蔡卜磊 孔亮

血管移植常用于口腔頜面部創(chuàng)傷后組織修復(fù)重建，自體血管移植是血運(yùn)重建的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但使用自體血管會(huì)造成供區(qū)損傷，且個(gè)體也無(wú)法提供足夠的血管量來(lái)滿足臨床需求[1-2]。因此人工血管替代自體血管已成為趨勢(shì)。目前人工血管雖然已被用于臨床，但常因動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈破裂、血管內(nèi)膜過(guò)度增生等情況導(dǎo)致移植失敗。其主要原因是人工血管力學(xué)性能低和生物學(xué)性能差[3]。

本研究利用靜電紡絲技術(shù)，使用PCL和PU逐層構(gòu)建彈性仿生人工血管，內(nèi)層、外層均采用PCL微納米紡絲提高生物學(xué)性能[4]，中層采用PCL/PU(W/W, 1/3) 微納米紡絲增強(qiáng)力學(xué)性能，提高血管彈性[5]。隨后，構(gòu)建SD大鼠腹主動(dòng)脈缺損模型，并使用該P(yáng)CL/PU血管修復(fù)缺損，并檢測(cè)其在體內(nèi)的血管重建效果，為PCL/PU血管的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 PCL/PU血管構(gòu)建

聚己內(nèi)酯(PCL)、聚氨酯(PU, Sigma-Aldrich, 美國(guó))； 二氯甲烷(DCM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氫呋喃(THF)(北京化學(xué)試劑有限公司)。 采用靜電紡絲，層層組裝制備PCL/PU血管，接收紡絲的為直徑2 mm的金屬滾軸，滾軸勻速轉(zhuǎn)動(dòng)，使紡絲均勻纏繞并逐漸增厚，內(nèi)層為PCL微納米纖維，中層為PCL/PU(W/W，1/3)混合微納米纖維，外層為PCL微納米纖維，連續(xù)紡絲至形成PCL/PU血管，成通風(fēng)干燥，備用。

1.2 大鼠腹主動(dòng)脈與PCL/PU血管微觀結(jié)構(gòu)比較

掃描電鏡(SEM)(Hitachi, S-4800, 日本)觀察，大鼠腹主動(dòng)脈與PCL/PU血管分別剪裁出長(zhǎng)度0.5 cm，戊二醛固定24 h后，梯度乙醇脫水，無(wú)水乙醇脫水2次，加入鋨酸，干燥，噴金，SEM觀察。

1.3 爆破壓力測(cè)試

將PCL/PU血管(4 cm)固定至爆破壓測(cè)量?jī)x上，在管腔內(nèi)注入蒸餾水，一端連接電子氣壓計(jì)，另一端連接氣瓶，逐漸增加PCL/PU血管管腔內(nèi)壓力，并記錄壓力值，直至PCL/PU血管發(fā)生滲漏。

1.4 模量測(cè)試

獲取大鼠腹主動(dòng)脈和PCL/PU血管，利用萬(wàn)能力學(xué)儀(BOSE 3220,美國(guó))測(cè)量，設(shè)定拉升速度為1 cm/min，重復(fù)測(cè)量5 次。

1.5 動(dòng)物模型建立

選取200～230 g， 8 周齡 SD雄性大鼠10 只，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(0.167 g/100 g)，腹正中切口，用濕棉棒輕柔推開腸道，暴露腹主動(dòng)脈，夾閉腹主動(dòng)，剪斷并用肝素鈉沖洗管腔，使用8-0縫線在顯微鏡下操作縫合，建立SD大鼠腹主動(dòng)脈移植PCL/PU血管模型，術(shù)前、術(shù)后均不使用任何抗凝藥物，并在1 個(gè)月后進(jìn)行取材。

1.6 組織學(xué)切片制作

取材后，用PBS沖洗組織，OCT包埋，在-20 ℃下冷凍切片厚度為7 μm，然后進(jìn)行HE染色、Masson染色，并于正置顯微鏡下拍攝記錄。免疫熒光染色采用CD31(R&D)、 α-SMA(Abcam)， BSA封閉， 4 ℃孵育過(guò)夜，F(xiàn)luor594(CST)避光孵育1 h，封片，激光共聚焦顯微鏡(CLM, OLYMPUS, FV1000, 日本)下拍攝記錄。

2 結(jié) 果

2.1 血管斷面觀察對(duì)比

SEM顯示大鼠腹主動(dòng)脈(n=5)厚度約為(180±32) μm，呈現(xiàn)典型三層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為菲薄的ECs層；中層為結(jié)構(gòu)致密的SMCs層；外層為結(jié)構(gòu)較為疏松的結(jié)締組織層。PCL/PU血管(n=5)厚度較大鼠腹主動(dòng)脈略厚，約為(250±24) μm，也呈明顯的三層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為PCL微納米纖維層；中層為PCL/PU微納米纖維層，外層為PCL微納米纖維層(圖 1)。

圖1 大鼠腹主動(dòng)脈和PCL/PU血管結(jié)構(gòu) (SEM, ×300)

Fig 1 Structure of rat abdominal aorta and PCL/PU aorta graft (SEM, ×300)

2.2 爆破壓測(cè)試效果

測(cè)量?jī)x器最大壓力值120 kPa≈900 mmHg，本實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)抽取PCL/PU血管(n=5)，反復(fù)充壓30 次，充壓時(shí)膨脹，降壓時(shí)收縮，該P(yáng)CL/PU血管均能夠保持彈性，期間PCL/PU血管未出現(xiàn)滲漏，其爆破壓力值超過(guò)900 mmHg，可以耐受正常生理血壓(圖 2)。

圖 2 PCL/PU血管爆破壓測(cè)試

Fig 2 The burst pressure test of aorta graft

2.3 模量測(cè)試結(jié)果

通過(guò)拉伸測(cè)試PCL/PU血管模量達(dá)到(5.60±0.34) MPa，斷裂伸長(zhǎng)率可達(dá)到564%±28%；大鼠腹主動(dòng)脈模量達(dá)到(2.06±0.11) MPa，斷裂伸長(zhǎng)率可達(dá)到170%±20%， PCL/PU血管強(qiáng)度高于大鼠腹主動(dòng)脈(圖 3)。

2.4 PCL/PU血管愈合

SD大鼠腹主動(dòng)脈移植PCL/PU血管術(shù)后30 d取材(n=10), 其中1 只在術(shù)后1 d內(nèi)死亡，探查發(fā)現(xiàn)死亡原因?yàn)镻CL/PU血管吻合口破裂，腹腔內(nèi)出血致死。其余9 只SD大鼠進(jìn)食以及運(yùn)動(dòng)功能等均未見異常。取材樣本大體觀察可見PCL/PU血管均與自體血管融合良好，在外層形成豐富的滋養(yǎng)血管網(wǎng)，血流通暢(圖 4)，縫線吻合處光滑，無(wú)狹窄、無(wú)動(dòng)脈瘤形成(圖 4)。

圖 3 大鼠腹主動(dòng)脈和PCL/PU血管應(yīng)力應(yīng)變曲線

Fig 3 The stress strain curve of rat abdominal aorta and PCL/PU aorta graft

圖 4 PCL/PU血管大體觀察

Fig 4 The gross observation of PCL/PU aorta graft

HE染色可見，大鼠腹主動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為ECs，中層為SMCs，外層為疏松結(jié)締組織(圖 5A、 5B)； PCL/PU血管植入30 d內(nèi)，也形成了類似大鼠腹主動(dòng)脈的管狀結(jié)構(gòu)(EF)。Masson染色觀察，大鼠腹主動(dòng)脈外層可見大量的膠原包裹(CD)；PCL/PU血管中層和外層內(nèi)可見有豐富的膠原纖維相互融合(GH)。

CD31和a-SMA分別為EC和SMC的標(biāo)記蛋白，PCL/PU血管免疫熒光觀察可見，內(nèi)層有ECs覆蓋，ECs結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，為移植血管提供了良好的封閉性(圖 6A)；中層分布較多的SMCs，由內(nèi)到外逐漸減少，推測(cè)PCL/PU血管中層的SMCs來(lái)源為血循環(huán)，因此短期內(nèi)呈現(xiàn)由內(nèi)到外逐漸減少的密度梯度；外層可見SMCs呈環(huán)形分布，說(shuō)明短期內(nèi)周圍組織就有成熟的滋養(yǎng)血管長(zhǎng)入(圖 6B)，為PCL/PU血管的改建提供細(xì)胞來(lái)源。

圖 5 大鼠腹主動(dòng)脈與PCL/PU血管組織組織學(xué)觀察

Fig 5 Histopathological observation of rat abdominal aorta and PCL/PU aorta graft

3 討 論

理想的人工血管需要具備良好的力學(xué)性能，能夠耐受血壓的變化，防止血管破裂；還需要具備良好的生物學(xué)性能，能夠與自體血管相互融合，防止血管阻塞。模擬天然血管的結(jié)構(gòu)和功能，是一種簡(jiǎn)潔、有效的構(gòu)建人工血管方法。

PCL是一種應(yīng)用廣泛的生物材料， 已有其運(yùn)用于組織工程修復(fù)受損的表皮、神經(jīng)、骨缺損、軟骨缺損的報(bào)道，其具有較好的生物學(xué)性能，并且可以完全降解[4-6]。PU是一種柔韌性好具有高度彈性的材料，已有報(bào)道使用PU作為人工血管材料，但因其結(jié)構(gòu)致密，限制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換，愈后不佳等原因并未廣泛應(yīng)用[7]。本研究創(chuàng)新性的結(jié)合兩種材料的優(yōu)點(diǎn)，使用靜電紡絲技術(shù)來(lái)進(jìn)行PCL/PU血管的制造。首先，我們使用致密的PCL紡絲構(gòu)建表面較為平整的內(nèi)膜層，從而有效防止血栓形成并同時(shí)利于ECs粘附。其次，疏松的PCL紡絲構(gòu)建外層，模擬天然血管外層的疏松結(jié)締組織，靜電紡絲提供的高表面積比和高孔隙率，便于細(xì)胞遷入孔隙中。最后，PCL/PU紡絲構(gòu)建中層，PU和PCL有相似的官能團(tuán)，按比例混合可使其力學(xué)性能協(xié)同增強(qiáng)，模擬天然血管中層平滑肌的支撐功能[5]。PCL/PU血管植入30 d，大體觀察可見，其外表面形成的豐富的滋養(yǎng)血管網(wǎng)，更加利于物質(zhì)交換，內(nèi)層縫合處光滑，無(wú)狹窄或血栓；HE染色證實(shí)內(nèi)層形成完整平滑的ECs；中層隨著PCL成分的降解，逐漸增大的孔隙更利于SMCs進(jìn)入紡絲間隙中，Masson染色也證實(shí)中層內(nèi)有豐富的膠原纖維的形成，從而利于PCL/PU血管維持足夠的力學(xué)性能，也促使PCL/PU血管與自體組織融合；免疫熒光染色顯示血管ECs在PCL/PU內(nèi)表面完整覆蓋，而ECs正是止血和減少血栓形成中起著關(guān)鍵細(xì)胞[8-9]。SMCs已長(zhǎng)入血管中層，其細(xì)胞密度由內(nèi)到外逐漸減少，提示SMC的主要來(lái)源為外周血循環(huán)，SMCs的遷入也預(yù)示著PCL/PU血管后期可能會(huì)具有舒張、收縮等血管功能；而PCL/PU血管外膜可見豐富的滋養(yǎng)血管；外層滋養(yǎng)血管長(zhǎng)入能進(jìn)一步促進(jìn)材料的吸收和功能細(xì)胞的遷入[10-12]。

圖 6 PCL/PU血管免疫熒光染色

Fig 6 Immunofluorescent staining of PCL/PU aorta graft

綜上所述，本研究所合成的PCL/PU彈性仿生人工血管具有良好的力學(xué)性能和生物學(xué)性能，并能在體內(nèi)改建同時(shí)維持力學(xué)強(qiáng)度，是一種具有優(yōu)良臨床應(yīng)用潛力的人工血管。