邵光耀　楊軍

[摘要] 目的 對動脈粥樣硬化（AS）病人基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，尋找AS發(fā)生發(fā)展相關的潛在基因。

方法 下載GEO數(shù)據(jù)庫中高通量基因芯片數(shù)據(jù)集GSE43292和GSE28829，行GO基因功能注釋和通路分析，然后進行蛋白相互作用網絡分析并可視化。

結果 經過數(shù)據(jù)分析，將差異表達基因在不同的生物學過程中富集，共篩選出了24個關鍵基因，文獻檢索顯示其中的MMP9、CXCR4、FABP4基因與AS相關。

結論 通過數(shù)據(jù)分析篩選出的24個差異表達基因，可為AS的分子診斷和治療開發(fā)提供算法預測和數(shù)據(jù)分析支持。

[關鍵詞] 動脈粥樣硬化;生物標記;計算生物學;數(shù)據(jù)分析

[中圖分類號] R543.5

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2020）03-0347-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.123

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200610.2131.016.html;2020-06-11 17：05

A BIOINFORMATICS ANALYSIS OF BIOMARKERS FOR ATHEROSCLEROSIS

SHAO Guangyao， YANG Jun

（Department of Cardiology， Yantai Yuhuangding Hospital Affiliated To Qingdao University， Yantai 264000， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the potential genes associated with the development and progression of atherosclerosis （AS） by analyzing the gene chip data of patients with AS.

MethodsHigh-throughput gene chip datasets GSE43292 and GSE28829 were downloaded from the GEO database. The gene ontology function annotation and pathway analysis were performed， followed by protein-protein interaction network analysis and visualization.

ResultsAfter data analysis， the differentially expressed genes were enriched in different biological processes， and 24 key genes were screened out. Literature search showed that MMP9， CXCR4， and FABP4 were associated with AS.

ConclusionThe 24 differentially expressed genes screened out by data analysis can provide the support of algorithmic prediction and data analysis for the development of molecular diagnosis and treatment of AS.

[KEY WORDS]atherosclerosis; biomarkers; computational biology; data analysis

動脈粥樣硬化（AS）是由于動脈的變窄限制了富氧血液流向身體各個部位，從而引發(fā)AS相關臨床表現(xiàn)的疾病。AS與血管壁的炎癥過程、較高的低密度脂蛋白（LDL）水平具有相關性[1]，但導致該疾病的分子機制仍不清楚。AS的風險因素有很多，如膽固醇異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、家族史和不健康的飲食等。傳統(tǒng)的危險因素，如高血壓、糖尿病等，在預測AS方面有一定作用[2]，但不能完全預測AS風險，因此尋找更敏感的生物標志物，是當前研究急需解決的問題。尋找生物標志物有助于闡明疾病的分子機制，為疾病發(fā)生發(fā)展的預測提供更精確的證據(jù)。隨著基因測序及芯片技術的發(fā)展和成本不斷降低，生物信息學技術被廣泛用于分析疾病的基因組層面的變化，這些技術有助于識別芯片數(shù)據(jù)涉及的差異表達基因和功能通路。雖然不同廠商的芯片數(shù)據(jù)差異較大，但不同研究間還是可能具有共同的差異表達基因。因此，本研究下載并分析了來自美國國家生物技術信息中心（NCBI）GEO數(shù)據(jù)庫的2個芯片數(shù)據(jù)集，以獲得AS組織和非AS組織的差異表達基因，尋找AS發(fā)生發(fā)展相關的潛在生物學標志物。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以“atherosclerosis”作為關鍵詞，在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中檢索已公布的AS的基因芯片數(shù)據(jù)集，獲取分別于2013年4月和2011年4月發(fā)表的兩個基因表達數(shù)據(jù)集GSE43292和GSE28829。GSE43292數(shù)據(jù)集來源于里昂第一大學和北奧斯陸大學，采用Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array平臺，含有32個AS樣本和32個正常樣本的表達矩陣;該數(shù)據(jù)集選擇的是愛德華·赫里歐醫(yī)院的32例患有AS的病人，男女

比例為29∶5，平均年齡為（70±10）歲，患有慢性腎臟疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和正在進行類固醇或其他免疫抑制藥物治療的病人均被排除在外。GSE28829來源于馬斯特里赫特大學，采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺，含有14個AS樣本和14個正常樣本的表達矩陣;該數(shù)據(jù)集選擇的是慕尼黑伊利諾伊州立醫(yī)院的尸體和血管外科手術切除的頸動脈組織。

1.2 差異表達基因篩選及可視化

采用R語言的limma包進行基因的差異表達分析，差異表達基因的篩選條件為差異倍數(shù)log fold change>1.5、adjust<0.05;應用R語言的plot數(shù)據(jù)包進行畫圖與展示。

1.3 差異表達基因的功能富集分析

使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫進行GO基因功能分析[3]，并用KEGG數(shù)據(jù)庫進行差異表達基因的通路分析。以P<0.05為具有統(tǒng)計學差異的標準篩選基因并進行可視化展示。

1.4 蛋白相互作用網絡分析

本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org）（版本10.0）進行蛋白相互作用網絡分析，構建差異表達基因的蛋白相互作用網絡，選擇綜合分數(shù)大于0.4的主要蛋白相互作用網絡，將得到的蛋白相互作用網絡導入Cytoscape軟件中進一步分析。Cytoscape（3.4.0版）是一個開源生物信息學軟件平臺，用于可視化分子交互網絡。使用Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網絡，并使用MCODE模塊以MCODE scores>5、degree cut-off=2、node scorecut-off=0.2、Max depth=100、k-score=2為標準確定網絡中重要的區(qū)域，并進行畫圖。

1.5 關鍵基因篩選

對上述網絡進行畫圖得到可能與AS相關的基因。為了驗證所得到的基因是否與AS有關，通過檢索文獻獲得研究支持。

2 結果

2.1 原始數(shù)據(jù)的標準化

進行差異分析之前，為避免原始的基因矩陣中出現(xiàn)缺失值、基因對應多個探針等情況，應用R語言的limma包中normalize Between Arrays函數(shù)進行數(shù)據(jù)的標準化，隨后進行可視化。經標準化處理后兩個芯片數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)分布效果較好（圖1），可以進行下一步差異分析。

2.2 標準化數(shù)據(jù)的聚類分析

使用R語言對標準化的GSE43292、GSE28829數(shù)據(jù)集進行聚類分析并繪制熱圖（圖2）。結果表明，GSE43292、GSE28829數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了聚類的現(xiàn)象，提示在樣本中出現(xiàn)了某些基因的富集。

2.3 差異表達基因的篩選

GSE43292數(shù)據(jù)集經篩選后得到1 086個基因，其中上調基因462個，下調基因624個;GSE28829數(shù)據(jù)集經篩選后得到1 733個基因，其中上調基因1 024個，下調基因709個?；蚝Y選后制作火山圖進行可視化，見圖3。

2.4 差異表達基因的功能分析及通路分析

數(shù)據(jù)集GSE28829的富集分析表明，差異表達基因的細胞組分變化主要富集在細胞表面、血漿膜外側、細胞外體、細胞外區(qū)域、細胞基質等，生物學過程主要富集在免疫球蛋白受體結合、免疫反應、炎癥反應等。GSE43292的富集分析表明，差異表達基因的細胞組分變化主要富集于細胞外區(qū)域、細胞外基質、細胞基質等，生物學過程主要富集在cAMP信號通路、細胞黏附通路、環(huán)狀體強化和色氨酸代謝通路等。見圖4。

2.5 差異表達基因的蛋白相互作用網絡分析

本研究得到可能導致AS的潛在關鍵基因共24個：MMP9、ACP5、SPP1、FABP4、CD84、ITGB2、CHI3L1、FCGR2B、KYNU、SLAMF8、CXCL2、CXCR4、CCL18、CCL19、PL2B、TNFSF13B、APOE、MS4A4A、TIMP1、SERPINA1、IGLL5、IGL5、IGJ、TFE3、IGLL5。進行相關文獻檢索結果顯示，MMP9、FABP4、CXCR4基因與AS相關。見圖5。

3 討論

AS的主要病因因素有很多，包括血液中較高水平的膽固醇和LDL、血液中低水平的高密度脂蛋白（HDL）、高血壓、煙草煙霧、糖尿病、肥胖、不健康的生活方式、家族心臟病史等。然而，該疾病的分子機制仍然沒有被闡明。隨著分子生物學發(fā)展和成本降低，基因分析、精準治療成為新的診斷及治療手段。本研究使用R語言對GSE43292和GSE28829數(shù)據(jù)集進行聚類分析并繪制熱圖，結果表明，在這兩個數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了差異表達基因聚類的現(xiàn)象。通過功能富集及通路分析探索差異表達基因的功能注釋信息，并使用R語言繪制功能分析及通路分析的條形圖，結果顯示，差異表達基因細胞組分主要集中在血漿膜外側、細胞基質等，生物學過程主要富集在cAMP信號通路、細胞黏附通路等。再通過構建蛋白相互作用網絡篩選出了24個關鍵基因，經文獻檢索顯示，其中的MMP9、FABP4、CXCR4基因與AS相關。

3.1 MMP9基因與AS相關性

纖維帽的細胞外基質成分與冠狀動脈AS斑塊的穩(wěn)定性有關，其厚度與斑塊的穩(wěn)定性呈正相關。MMPs是一種蛋白酶系，其作用可加速纖維帽細胞外基質分解，進而導致斑塊破裂。MMPs可降解很多細胞外基質，如膠原、彈性蛋白、纖維連接蛋白等。MMP9是MMPs中的一種明膠酶，它可以分解粥樣斑塊和纖維帽中內皮基底膜的Ⅳ型膠原，增加斑塊的不穩(wěn)定性，進而引發(fā)斑塊的破裂[4]。本研究結果表明，MMP9基因與AS的不穩(wěn)定性相關。提示MMP9可能是AS的潛在生物標志物。

已有實驗研究驗證了MMP9和AS斑塊破裂的相關性[5]。有研究表明，高脂肪攝入的動物相較于低脂肪攝入組具有更高水平的MMP9表達[6]。也有研究應用網絡藥理學方法預測一種治療高脂血癥的傳統(tǒng)中藥的作用靶基因可能為MMP9[7]。

3.2 FABP4基因與AS相關性

脂肪酸結合蛋白（FABPs）是游離脂肪酸的伴侶蛋白，可與膽固醇、花生四烯酸可逆性結合。該蛋白主要表達在脂肪和巨噬細胞中，參與脂肪酸的轉運及脂肪分解，促進三酰甘油在脂肪細胞中的沉積，參與AS的病程。有研究顯示，F(xiàn)ABP4通過作用于脂蛋白酯酶，使血漿游離脂肪酸水平升高，而血漿游離脂肪酸水平升高又可以導致高三酰甘油血癥的形成，進而參與斑塊進展;在氧化低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞形成泡沫細胞的過程中，F(xiàn)ABP4基因表達上調，加速了泡沫細胞中膽固醇和三酰甘油的積累，從而參與斑塊的進展[8]。另有研究結果顯示，F(xiàn)ABP4在代謝綜合征的冠心病病人中表達升高，并且其表達與冠狀動脈AS程度和表皮脂肪組織體積有相關性[9]。也有研究顯示，F(xiàn)ABP4可以成為AS的獨立預測標志物[10]。有回顧性分析研究顯示，血清FABP4水平與外周血管疾病的不良心血管事件具有相關性[11]。有成年小鼠的基因測序研究顯示，心臟內皮細胞中FABP4的表達更高，F(xiàn)ABP4可能成為未來AS的重要靶基因標志物[12]。

3.3 CXCR4基因與AS相關性

CXCR是基質細胞衍生因子-1的受體，參與內皮損傷、修復過程。業(yè)已證實，內皮細胞的損傷誘發(fā)的細胞黏附、血小板聚集等過程，參與了AS過程的開啟。CXCR4可介導平滑肌細胞向損傷區(qū)域的動員，促進損傷區(qū)域血管內膜的增生，進而參與內膜的修復過程。有研究表明，內皮細胞中CXCR4的缺失，可降低細胞的增殖，進而影響創(chuàng)面的愈合，加速巨噬細胞浸潤，從而導致AS過程的進展[13]。此外，有實驗研究表明，小鼠CXCR4的敲除或抑制阻斷了CXCL12對TCF21和ABCA1表達的影響，以及GSK3β和β-catenin的磷酸化，而小鼠中過度表達CXCL12可擴大AS病變區(qū)域，可能導致AS斑塊中巨噬細胞的滲透[14]。

有研究表明，使用新型CXCR4定向正電子發(fā)射斷層掃描示蹤劑，相較于傳統(tǒng)的正電子發(fā)射斷層掃描示蹤劑能夠檢測出更多的AS斑塊[15-16]。另有研究表明，CXCR4在B-1細胞中的表達與血漿中針對malondialdehyde-modified LDL的IgM抗體呈正相關，與冠狀動脈斑塊的程度呈負相關[17]。有基因研究顯示，BPIFB4可能調節(jié)CXCR4，參與小鼠AS和炎癥進展，這為未來的基因治療AS提供了可能[18]。有研究顯示，CXCL12與CXCR4結合可能是AS的新治療靶點[19]。也有研究顯示，亞臨床心血管疾病病人CXCR4表達降低，提示CXCR4可能是亞臨床心血管疾病的保護基因[20]。

綜上所述，本研究共確定了24個關鍵基因，其中文獻支持MMP9、CXCR4和FABP4基因與AS相關，它們可能是AS的生物標志物。除MMP9、FABP4和CXCR4外，其他的21個基因在本研究中差異同樣具有統(tǒng)計學意義，也可能與AS相關，但需要進一步的研究來闡明這些基因與AS發(fā)生發(fā)展的相關性。本研究結果可為AS的分子診斷和治療開發(fā)提供算法預測和數(shù)據(jù)分析支持。

[參考文獻]

[1]HIGHASHI Y， NOMA K， YOSHIZUMI M， et al. Endothelial function and oxidative stress in cardiovascular dieases[J].? Circulation Journal， 2009，73：411-418.

[2]李坤，唐震宇. 生物學標志物與頸動脈粥樣硬化易損斑塊關系的研究進展[J].? 實用臨床醫(yī)學， 2017，18（2）：100-103.

[3]ASHBURNER M， BALL C A， BLAKE J A， et al. Gene ontology： tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium[J].? Nature Genetics， 2000，25（1）：25-29.

[4]李紅平. 氨基末端腦鈉肽前體和超敏心肌肌鈣蛋白T在慢性心力衰竭患者中的檢測意義[J].? 中國醫(yī)藥指南， 2012，10（11）：201-202.

[5]CHEN Peipei， CHEN Yuexin， WU Wei， et al. Identification and validation of four hub genes involved in the plaque deterioration of atherosclerosis[J].? Aging， 2019，11（16）：6469-6489.

[6]LUDVIGSEN T P， PEDERSEN S F， VEGGE A， et al. 18F-FDG PET/MR-imaging in a Gttingen Minipig model of athe-

rosclerosis： correlations with histology and quantitative gene expression[J].? Atherosclerosis， 2019，285：55-63.

[7]LEE A Y， PARK W， KANG T W， et al. Network pharmacology-based prediction of active compounds and molecular targets in Yijin-Tang acting on hyperlipidaemia and atherosclerosis[J].? Journal of Ethnopharmacology， 2018，221：151-159.

[8]FURUHASHI M， HOTAMISLIGIL G S. Fatty acid-binding proteins： role in metabolic diseases and potential as drug targets[J].? Nature Reviews Drug Discovery， 2008，7（6）：489-503.

[9]GORMEZ S， ERDIM R， AKAN G， et al. Relationships between visceral/subcutaneous adipose tissue FABP4 expression and coronary atherosclerosis in patients with metabolic syndrome[J].? Cardiovasc Pathol， 2019，46：107192.

[10]FURUHASHI M， YUDA S， MURANAKA A， et al. Circulating fatty acid-binding protein 4 concentration predicts the progression of carotid atherosclerosis in a general population without medication[J].? Circ J， 2018，82（4）：1121-1129.

[11]HOEBAUS C， HERZ C T， PESAU G， et al. FABP4 and cardiovascular events in peripheral arterial disease[J].? Angiology， 2018，69（5）：424-430.

[12]LOTHER A， BERGEMANN S， DENG L， et al. Cardiac endothelial cell transcriptome[J].? Arteriosclerosis， Thrombosis， and Vascular Biology， 2018，38（3）：566-574.

[13]NOELS H， ZHOU B， TILSTAM P V， et al. Deficiency of endothelial CXCR4 reduces reendothelialization and enhances neointimal hyperplasia after vascular injury in atherosclerosis-prone mice[J].? Arteriosclerosis， Thrombosis， and Vascular Biology， 2014，34（6）：1209-1220.

[14]GAO J H， HE L H， YU X H， et al. CXCL12 promotes athe-

rosclerosis by downregulating ABCA1 expression via the CXCR4/GSK3β/β-cateninT120/TCF21 pathway[J].? Journal of Lipid Research， 2019，60（12）：2020-2033.

[15]KIRCHER M， TRAN G J， KEMMER L， et al. Imaging inflammation in atherosclerosis with CXCR4-directed 68Ga-Pentixafor PET/CT-Correlation with 18F-FDG PET/CT[J].? Journal Nuclear Medicine， 2019，61（5）：25.

[16]DERLIN T， SEDDING D G， DUTZMANN J， et al. Imaging of chemokine receptor CXCR4 expression in culprit and nonculprit coronary atherosclerotic plaque using motion-corrected[68Ga] pentixafor PET/CT[J].? European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging， 2018，45（11）：1934-1944.

[17]UPADHYE A， SRIKAKULAPU P， GONEN A， et al. Diversification and CXCR4-dependent establishment of the bone marrow B-1a cell pool governs atheroprotective IgM production linked to human coronary atherosclerosis[J].? Circulation Research， 2019，125（10）：e55-e70.

[18]PUCA A， CARRIZZO A， SPINELLI C， et al. Single systemic transfer of a human gene associated with exceptional longevity halts the progression of atherosclerosis and inflammation in ApoE knockout mice through a CXCR4-mediated mechanism[J].? Eur Heart J， 2019. doi：10.1093/eurheartj/ehz459.

[19]GAO Jiahui， YU Xiaohua， TANG Chaoke， et al. CXC chemokine ligand 12 （CXCL12） in atherosclerosis： an underlying therapeutic target[J].? Clinica Chimica Acta， 2019，495：538-544.

[20]MUELLER K， HANNA D B， EHINGER E， et al. Loss of CXCR4 on non-classical monocytes in participants of the Womens Interagency HIV Study （WIHS） with subclinical atherosclerosis[J].? Cardiovascular Research， 2019，115（6）：1029-1040.

（本文編輯 馬偉平）

[收稿日期]2019-12-04; [修訂日期]2020-04-30

[基金項目]山東省自然科學基金資助項目（ZR2017LH004）

[第一作者]邵光耀（1993-），男，碩士研究生。

[通信作者]楊軍（1964-），男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師。E-mail：yangjunyhd@163.com。