袁飛飛　陳官芝　王宗嶺　蘇磊　劉珂　張嘉莉

[摘要]目的 了解皮膚科就診病人淺部真菌病病種及其致病菌種的構(gòu)成與分布情況。方法 2018年5月—2019年5月，我院皮膚科門診就診、具有典型淺部真菌病臨床特征、真菌鏡檢及培養(yǎng)均為陽性病人528例，取病人皮損標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過形態(tài)觀察、質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定，對少見及疑難菌株行核糖體DNA（rDNA）ITS區(qū)序列測定。結(jié)果 528例皮膚淺部真菌病病種前3位依次是甲真菌病132例（25.00%）、足癬115例（21.78%）、股癬83例（15.72%）。分離出的致病真菌中紅色毛癬菌居首位（250株，47.35%），其次為須癬毛癬菌92株（17.42%）。不同性別、年齡段淺部真菌病病種的構(gòu)成和分布存在一定差異，其中股癬及體癬男性構(gòu)成比明顯高于女性（χ2=33.905、8.705，P<0.05），甲真菌病及足癬女性構(gòu)成比高于男性（χ2=22.381、9.488，P<0.05）;股癬、馬拉色菌毛囊炎病人主要集中在21～30歲年齡段，甲真菌病、花斑糠疹以31～40歲病人為主，而頭癬的發(fā)病年齡高峰為≤10歲，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.245～15.709，P<0.05）。結(jié)論 本院皮膚科淺部真菌病病人中甲真菌病為最常見病種，淺部致病真菌以皮膚癬菌為主，紅色毛癬菌為優(yōu)勢致病菌。

[關(guān)鍵詞] 真菌病;真菌;癬;真菌學(xué)分型技術(shù)

[中圖分類號] R756[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A[文章編號] 2096-5532（2020）04-0477-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.118

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200611.1703.003.html;2020-06-11 17：04

AN ANALYSIS OF SUPERFICIAL MYCOSIS AND ITS PATHOGENIC FUNGI

YUAN Feifei， CHEN Guanzhi， WANG Zong-ling， SU Lei， LIU Ke， ZHANG Jiali

（Department of Dermatology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the composition and distribution of superficial mycosis diseases and their pathogenic fungi in patients in Department of Dermatology.Methods A total of 528 patients with typical clinical features of superficial mycosis and positive results of microscopic fungal examination and culture who attended the outpatient service of Department of Dermatology in our hospital from May 2018 to May 2019 were enrolled. Skin lesion specimens were collected for isolation and culture， and morphological observation and mass spectrometry were used for strain identification. The sequence of ribosomal DNA （rDNA） ITS was determined for rare and difficult strains. Results Among the 528 patients with superficial mycosis， 132 （25.00%） had onychomycosis， 115 （21.78%） had tinea pedis， and 83 （15.72%） had tinea cruris. Among the pathogenic fungi isolated， Trichophyton rubrum ranked first （250 strains， 47.35%）， followed by Trichophyton mentagrophyte （92 strains， 17.42%）. There were some differences in the composition and distribution of superficial mycosis diseases between the patients with different sexes and ages; the male composition ratios of tinea cruris and tinea corporis were significantly higher than their female composition ratios （χ2=33.905，8.705;P<0.05）， and the female composition ratios of onychomycosis and tinea pedis were significantly higher than their male composition ratios （χ2=22.381，9.488;P<0.05）; most of the patients with tinea cruris and Malassezia folliculitis were mainly observed in the age group of 21-30 years， and onychomycosis and pityriasis versicolor were mainly observed in the patients aged 31-40 years， while most of the patients with tinea capitis were observed in the age group of ≤10 years （χ2=6.245-15.709，P<0.05）. Conclusion Onychomycosis is the most common type of superficial mycosis diseases in our hospital. Dermatophytes are the main pathogenic fungi for superficial mycosis， with Trichophyton rubrum as the dominant pathogenic fungus.

[KEY WORDS] mycoses; fungi; tinea; mycological typing techniques

皮膚淺部真菌病為皮膚科常見疾病，其致病菌的分布特點因地域環(huán)境、社會經(jīng)濟(jì)條件及生活習(xí)性等不同而有所差異。為了解我院皮膚科門診病人淺部真菌病及其病原真菌構(gòu)成與分布特點，本文對就診于我院皮膚科門診的528例淺部真菌病病人進(jìn)行病種及致病菌種分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年5月—2019年5月，在我院皮膚科門診就診、具有典型淺部真菌病臨床癥狀并且真菌鏡檢及培養(yǎng)均為陽性病人528例，其中男305例，女223例;年齡1～81歲，平均（37.30±6.29）歲。

1.2 真菌鏡檢及培養(yǎng)

取病人病變部位的皮屑、甲屑、毛發(fā)或分泌物等。真菌鏡檢：將標(biāo)本置于載玻片上，加1滴100 g/L氫氧化鉀，覆蓋蓋玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察，找到菌絲或孢子為鏡檢陽性。真菌培養(yǎng)：將真菌鏡檢陽性的標(biāo)本接種于含0.05 g/L氯霉素的沙氏培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)雙管培養(yǎng)，期間每周觀察3次菌落生長情況，第4周未見真菌生長者為陰性。念珠菌轉(zhuǎn)種科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基，疑似花斑糠疹或馬拉色菌毛囊炎病人標(biāo)本接種于含橄欖油培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3～5 d。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)菌落的形態(tài)特征及其顏色、生長速度、分生孢子的形態(tài)及菌絲特征等進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2 質(zhì)譜檢測系統(tǒng)鑒定 對純培養(yǎng)菌落應(yīng)用全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，根據(jù)Biotyper軟件得分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀：屬的鑒定閾值下限為1.7，種的鑒定閾值下限為2.0。記錄得分≥2.0的菌株，得分<1.7的菌株進(jìn)行重復(fù)分析，最終仍未得到確切結(jié)果的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定 對少見及疑難菌株行核糖體DNA （rDNA） ITS序列測定，具體步驟如下。①增菌培養(yǎng)及模板DNA提?。菏褂蒙呈弦后w培養(yǎng)基對待檢菌株進(jìn)行震蕩培養(yǎng)（28 ℃，48～72 h），收獲菌絲體以備菌絲提取;使用氯化芐（benzyl chloride）法提取DNA基因組，具體操作方法見參考文獻(xiàn)[1-2]。②rDNA-RTS擴(kuò)增：用真菌通用擴(kuò)增引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系體積共25 μL，其中包括模板DNA 2 μL（20 mg/L），PCR TaqMix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，余體積用滅菌ddH2O補足。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min后，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán);繼而72 ℃保持7 min延伸。PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測[3]。③序列測定與分析：將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物送上海吉美生物醫(yī)藥科技有限公司純化后進(jìn)行雙向基因測序，測序結(jié)果在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）基因核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對鑒定菌種。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 皮膚淺部真菌病病種及病原菌分布

本文528例病人中前3位淺部真菌病為甲真菌病、足癬、股癬。在分離鑒定的528株菌株中，紅色毛癬菌居于首位，其次為須癬毛癬菌、馬拉色菌。各菌株分布見表1。

2.2 皮膚癬菌病中主要病原真菌構(gòu)成情況

甲真菌病主要分離出紅色毛癬菌（59.09%）、酵母菌（18.94%）;手足癬主要分離出紅色毛癬菌（58.50%）、須癬毛癬菌（28.57%）;體股癬主要分離出紅色毛癬菌（60.71%）、須癬毛癬菌（20.00%）;頭癬的主要病原真菌為犬小孢子菌（83.33%）、紅色毛癬菌（16.67%）。見表1。

2.3 病人性別、年齡與淺部真菌病病種的關(guān)系

在528例病人中，男性305例，女性223例，股癬及體癬男性構(gòu)成比明顯高于女性，差異有顯著性（χ2=33.905、8.705，P<0.05）;甲真菌病及足癬女性構(gòu)成比高于男性（χ2=22.381、9.488，P<0.05）;頭癬、手癬、花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎、皮膚黏膜念珠菌病男女性別分布差異無顯著性（P>0.05）。股癬、馬拉色菌毛囊炎病人主要集中在21～30歲年齡段，甲真菌病、花斑糠疹以31～40歲病人為主，而頭癬的發(fā)病高峰為≤10歲（χ2=6.245～15.709， P<0.05），其余4種疾病年齡分布差異無顯著性（P>0.05）。見表2。

3 討論

淺部真菌病是一類常見的真菌感染性疾病，世界范圍內(nèi)人群患病率為20%～25%[4]。隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用及人員流動、環(huán)境變化，淺部真菌病患（發(fā)）病率呈上升態(tài)勢[5]，且淺部真菌病致病菌種的構(gòu)成與分布常表現(xiàn)出地區(qū)差異[6]，也在較長的時間維度下表現(xiàn)出變化[7-8]。了解本院淺部真菌病病種構(gòu)成及病原真菌的分布特點，有助于臨床工作中對淺部真菌病進(jìn)行準(zhǔn)確診斷和防治。

本次研究鑒定的致病真菌以皮膚癬菌為主，其中紅色毛癬菌所占比例最大，須癬毛癬菌次之，這與國內(nèi)部分北方地區(qū)報道結(jié)果相一致[9-10]，而上海及杭州等南方地區(qū)淺部真菌病的致病真菌以紅色毛癬菌和念珠菌為主[11]，由此可見淺部真菌病病原真菌的分布具有地區(qū)差異性。本研究鑒定出的條件致病菌包括漢遜德巴利酵母菌、日本絲酵母菌、暗色真菌及尖端賽多孢子菌等，這些淺部真菌致病菌種文獻(xiàn)中較少提及，其在人類皮膚破損或者免疫功能低下時可導(dǎo)致人體皮膚組織和內(nèi)臟器官的真菌感染。提示臨床皮膚淺部真菌病的致病菌種構(gòu)成與分布可能在不斷發(fā)生變化，可擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步統(tǒng)計分析。

本文的研究結(jié)果顯示，在528例淺部真菌病中，甲真菌病占比最高，這與國內(nèi)部分地區(qū)的研究結(jié)果相一致[10-12]。甲真菌病中女性構(gòu)成比高于男性，其原因可能為：女性經(jīng)常美甲、穿高跟鞋，易造成指（趾）甲損傷，并且女性對自身形象較男性更加關(guān)注，故女性病人就診率高[13]。甲真菌病的致病真菌以紅色毛癬菌占首位，其次為念珠菌，這與一些北方地區(qū)研究結(jié)果類似[9，14]，但海南省、南寧市等南方地區(qū)甲真菌病首位致病菌均為酵母菌[15]。表明我國北方地區(qū)甲真菌病的致病菌多以皮膚癬菌為主，其中以紅色毛癬菌最為常見，隨著地理位置的南移皮膚癬菌所占比例下降，而酵母菌所占比例上升，考慮其原因可能與南方地區(qū)溫暖潮濕的氣候有關(guān)。王瑩瑩等[16]對青島地區(qū)甲真菌病的研究結(jié)果顯示，甲真菌病的致病菌中紅色毛癬菌占比為76.1%，念珠菌占比為10.5%;而本研究結(jié)果顯示，甲真菌病中紅色毛癬菌占比59.09%，念珠菌占比18.94%，與國內(nèi)多個地區(qū)報道的紅色毛癬菌的感染率有下降趨勢而念珠菌株感染率有上升趨勢的特點相符合[15，17]。分析其原因可能與氣候溫度及人們生活習(xí)慣改變以及近年來抗生素濫用、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑廣泛使用有關(guān)。因此，在臨床上應(yīng)重視念珠菌在甲真菌病中的致病性，選擇廣譜抗真菌藥物治療甲真菌病。

本研究中足癬病人人數(shù)僅次于甲真菌病，其中女性病人的構(gòu)成比明顯高于男性，與相關(guān)研究結(jié)果相同[15]。足癬的致病菌種前3位依次為紅色毛癬菌、須癬毛癬菌及白色念珠菌。而重慶地區(qū)調(diào)查顯示，足癬的主要致病菌除了紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌及白色念珠菌等淺部真菌菌種以外，還發(fā)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌等細(xì)菌病原菌定植[18]，提示臨床上病情較重及易反復(fù)的足癬病人可能同時感染高耐藥的細(xì)菌，對該類病人治療時可加用抗細(xì)菌藥物。

股癬為本院第3位常見淺部真菌病，股癬男性構(gòu)成比明顯高于女性，考慮與男性特殊生理結(jié)構(gòu)易造成局部潮濕、不透氣且活動力度強、汗腺及皮脂腺分泌旺盛，從而更有利于皮膚癬菌生長有關(guān)。本研究中股癬致病真菌包括紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、念珠菌、紫色毛癬菌及絮狀表皮癬菌等，與本地區(qū)2011年股癬致病菌分布特點相比較，股癬的主要致病真菌雖未發(fā)生明顯改變，但皮膚癬菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)之前未鑒定出的紫色毛癬菌及絮狀表皮癬菌[19]。其他一些地區(qū)研究結(jié)果亦顯示，紫色毛癬菌及絮狀表皮癬菌可能為股癬的致病菌[15]。表明本地區(qū)股癬的致病菌種分布可能處于動態(tài)變化中。

本次研究淺部真菌病病人主要集中于21～40歲年齡組?？紤]其原因可能為：①中青年活動力度強、社會活動頻繁、汗腺及皮脂腺分泌旺盛，更易感染淺部真菌;②中青年就醫(yī)意識較強。而頭癬病人主要為10歲以下兒童，這與兒童毛發(fā)結(jié)構(gòu)的特殊性有關(guān)，如毛小皮的層數(shù)、厚薄、排列緊密程度與成人不同，頭部皮脂腺不發(fā)達(dá)，局部皮膚缺乏游離脂肪酸;同時也與該年齡段兒童戶外活動較多，喜愛與貓、犬、兔等接觸有關(guān)[15]。

綜上所述，本院皮膚科收治淺部真菌病病種及病原菌的分布大致符合國內(nèi)流行趨勢，但同時也具備自身特點。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

[收稿日期]2019-10-25; [修訂日期]2020-04-14

[基金項目]山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（2014WS0175）

[第一作者]袁飛飛（1994-），女，碩士研究生。

[通信作者]陳官芝（1962-），女，碩士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。E-mail：chenguanzhiqd@126.com。