劉永娟　任紀禎　何才　周子藝　李丹怡　冷向鋒

[摘要]目的 檢測轉(zhuǎn)染抗菌肽LL-37人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSCs）的基因表達及其對金黃色葡萄球菌的抗菌活性。方法 分離、培養(yǎng)hUC-MSCs;構(gòu)建LL-37慢病毒載體轉(zhuǎn)染至hUC-MSCs，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，計算其轉(zhuǎn)染效率;應(yīng)用Western blot方法檢測LL-37表達，酶標比濁法檢測細胞培養(yǎng)上清液抗菌活性。結(jié)果 成功培養(yǎng)hUC-MSCs;獲取包裝滴度為1×1012TU/L的LL-37慢病毒載體，轉(zhuǎn)染至hUC-MSCs后72 h可觀察到細胞呈現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率為85.40%。Western blot檢測顯示，轉(zhuǎn)染組hUC-MSCs過表達LL-37，細胞培養(yǎng)上清液對金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，抑菌率為98.74%。結(jié)論 hUC-MSCs可成功表達具有較強抗菌活性的抗菌肽LL-37。

[關(guān)鍵詞] 金黃色葡萄球菌;間充質(zhì)基質(zhì)細胞;轉(zhuǎn)染;抗菌藥;抗微生物陽離子肽類

[中圖分類號] R978[文獻標志碼] A[文章編號] 2096-5532（2020）04-0379-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.049[HT]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20200325.1005.002.html;2020-03-026 13：34

GENE EXPRESSION OF HUC-MSCS AND ITS ANTIBACTERIAL ACTIVITY AGAINST STAPHYLOCOCCUS AUREUS

LIU Yongjuan， REN Jizhen， HE Cai， ZHOU Ziyi， LI Danyi， LENG Xiangfeng

（Department of Burn and Plastic Surgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective To determine the gene expression of human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUC-MSCs） transfected with antimicrobial peptide LL-37 and its antibacterial activity against Staphylococcus aureus.

Methods The hUC-MSCs were isolated and cultured， and were transfected with a lentivirus vector constructed from LL-37. Cell morphology was evaluated under an inverted microscope， and the transfection efficiency of the cells was calculated. The expression of LL-37 was determined by Western blot. The antibacterial activity of cell culture supernatant was determined by turbidimetry. Results The hUC-MSCs were successfully cultured. The LL-37 lentivirus vector with a packaging titer of 1×1012 TU/L was obtained and transfected into hUC-MSCs. After transfection for 72 h， green fluorescence was observed. The transfection efficiency was 85.40%. Western blot showed that the hUC-MSCs transfected group had overexpressed LL-37; cell culture supernatant had a significant inhibitory effect on S. aureus， with an inhibition rate of 98.74%.

Conclusion HUC-MSCs can successfully express LL-37， an antimicrobial peptide with strong antibacterial activity.

[KEY WORDS] staphylococcus aureus; mesenchymal stromal cells; transfection; anti-bacterial agents; antimicrobial catio-nic peptides

目前，在燒傷治療過程中所出現(xiàn)的感染是導(dǎo)致中重度燒傷病人難以愈合甚至死亡的重要原因之一，危害性極大[1]。其中的金黃色葡萄球菌（金葡菌）為燒傷病人主要條件致病菌之一。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，引發(fā)感染的微生物種類不斷變異，其耐藥性越來越強，微生物對抗菌藥物的耐藥性研究一直是專家學(xué)者關(guān)注的熱點[2]。抗微生物陽離子肽類是潛在的抗生素候選藥物[3]。人們從兩棲類、高等植物、哺乳動物等發(fā)現(xiàn)并分離獲得具有抗菌活性的多肽，由于其對細菌具有廣譜高效殺菌活性，因此命名為抗菌肽[4]?？咕腖L-37是目前發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)唯一抗菌肽家族成員，可以廣泛抵抗多種病原菌，既可以直接殺滅微生物，還可以防止生物膜形成，并具有局部免疫調(diào)節(jié)作用[5]。間充質(zhì)干細胞（MSCs）可以通過再上皮化、促進血管和肉芽組織形成等作用促進傷口愈合[6]，而人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSCs）具有獲取方便，無倫理道德限制等諸多優(yōu)勢[7]。結(jié)合干細胞與抗菌肽的優(yōu)點，本實驗將攜帶有LL-37的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至hUC-MSCs，檢測LL-37在hUC-MSCs中的表達及其上清液對金葡菌的抑菌效果，旨在為臨床治療及合理應(yīng)用不耐藥的非抗生素類藥物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

臍帶來源于我院西海岸院區(qū)產(chǎn)科健康足月剖宮產(chǎn)的新生兒，Apgar評分8～10分，孕婦排除傳染病，胎兒無先天性疾病。特級胎牛血清（FBS，Biological Industry公司）;DMEM/F12（Biological Industry公司）;EVOS FL細胞熒光成像系統(tǒng)（美國Invitrogen）;金葡菌（CCTCC AB 91093，中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供）;[STBX]LL-37基因、GV慢病毒載體系列、pHelper 1.0、pHelper 2.0、293T細胞（吉凱公司）;超濾離心管AmiconUltra-15（MWCO10K-d）;雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）（Solarbio）。

1.2 實驗方法

1.2.1 hUC-MSCs的分離、傳代、培養(yǎng) 參照LIU等[8]方法，在超凈臺內(nèi)取出臍帶組織，PBS洗滌，去除臍靜脈、臍動脈及臍帶外膜，剪碎為1 mm3大小，2 500 r/min離心10 min，棄上清。將1 mm3組織塊按5 mm間距擺放于100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，靜置，加入培養(yǎng)液濕潤培養(yǎng)皿底;置于37.0 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞達85%～90%融合時，胰酶消化，以2×105/cm2密度接種，待融合率達90%傳代。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.2.2 細胞免疫表型的鑒定 應(yīng)用流式細胞儀。取第3代細胞，PBS重懸細胞分裝至2支1.5 mL EP管中，使每管的細胞密度達到5×109/L、液體量為100 μL，避光。第1管為同型對照管，加入CD90 FITC、CD105 PC5.5、CD73 APC、CD34 PE、CD19 PE、CD11b PE、CD45 PE、HLA-DR PE的同型對照抗體各5 μL;第2管為實驗管，加入CD90 FITC、CD105 PC5.5、CD73 APC、CD34 PE、

CD19 PE、CD11b PE、CD45 PE、HLA-DR PE各5 μL。避光孵育30 min，加1 mL PBS離心洗滌，用300 μL PBS重懸，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞表型。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 過表達慢病毒載體構(gòu)建、包裝及檢測 由上海吉凱基因有限公司協(xié)助完成。①過表達慢病毒克隆的制備：酶切、線性化載體，PCR擴增目的基因片段（根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫人LL-37的cDNA序列設(shè)計[STBX]LL-37基因引物，見表1。配制反應(yīng)體系，于PCR儀中進行反應(yīng)）。將PCR產(chǎn)物與線性化載體進行交換，獲得重組質(zhì)粒，冰水浴中冷卻5 min后轉(zhuǎn)化。將10 μL交換反應(yīng)產(chǎn)物加入至 100 μL感受態(tài)細胞中，置冰上30 min。42 ℃熱激 90 s，冰水浴中孵育 2 min。加入LB培養(yǎng)基500 μL，于 37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)1 h。取適量菌液均勻涂布，于恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。配制鑒定反應(yīng)體系，用無菌槍頭挑取單個菌落至20 μL體系中鑒定，于PCR儀中反應(yīng)。將鑒定出的陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種至適量含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，取菌液測序，與目的基因序列比對分析。將測序正確的菌液轉(zhuǎn)接于10 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，提取合格的質(zhì)粒進入下游流程。②包裝慢病毒并做質(zhì)量檢測：采用自失活型慢病毒包裝系統(tǒng)進行包裝，pHelper 1.0、pHelper 2.0、載體質(zhì)粒GV492共同轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)染完成后48～72 h，收獲病毒（即未純化的細胞上清液），濃縮、純化，得到高滴度的慢病毒保存液，熒光法測定滴度。

1.2.4 分組及轉(zhuǎn)染 選取處于對數(shù)生長期的hUC-MSCs，按照細胞密度5×107/L接種于12孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度約30%時，隨機分為3組，每組設(shè)3個復(fù)孔。實驗組：轉(zhuǎn)染LL-37;空載體組：轉(zhuǎn)染空載體慢病毒;對照組：為未做處理的hUC-MSCs。轉(zhuǎn)染方法：根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將病毒滴度稀釋為1×1011TU/L，12孔板每孔加入慢病毒30 μL及感染增強液20 μL，12～24 h換液，轉(zhuǎn)染72 h后，熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體攜帶的綠色熒光（GFP）表達情況，熒光率超過80%表明轉(zhuǎn)染成功，否則重新轉(zhuǎn)染。每3 d換液1次，收集培養(yǎng)上清液按15∶1比例用Ultra-15超濾管濃縮、過濾（0.22 μm）除菌。

1.2.5 LL-37蛋白表達及上清液中LL-37濃度檢測 應(yīng)用Western blot方法檢測各組LL-37蛋白表達，結(jié)果以LL-37蛋白條帶光密度/內(nèi)參光密度值表示。應(yīng)用ELISA法測定各組細胞培養(yǎng)上清液中LL-37濃度。

1.2.6 細胞運動、生長能力檢測 采用細胞劃痕實驗方法。

1.2.7 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)上清液抑菌實驗 采用酶標比濁法[9]。取9支試管分為金葡菌組（A組）、抗生素組（B組）、LL-37轉(zhuǎn)染組（C組）3組，每組3支。各組處理方法見表2。將試管放入37 ℃、200 r/min搖床中過夜。24 h后，試管渦旋、混勻，立即用移液槍每管取200 μL加入96孔板內(nèi)，取1個空白孔只加肉湯作為系統(tǒng)調(diào)零、消除系統(tǒng)誤差，酶標儀檢測各孔600 nm波長的吸光度值（OD值）。計算LL-37抑菌率，LL-37抑菌率=（ODA-ODC）/ODA×100%[9]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Image J圖片處理軟件處理圖片，所得實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0和Graph Pad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s形式表示，多組均數(shù)比較采用單因素設(shè)計方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs細胞形態(tài)

倒置顯微鏡觀察顯示，培養(yǎng)12 d細小組織塊周圍見少量細胞，形態(tài)小而均一（圖1 a）;13 d細胞迅速生長（圖1 b）;14 d部分小組織周圍細胞呈小克隆狀密集分布生長，長勢較強且呈漩渦狀密集分布（圖1 c）;16 d時組織塊周圍細胞呈魚群狀規(guī)律密集排布，可達90%融合度（圖1 d）。消化傳代后，P1代細胞均勻分布生長（圖1 e），計數(shù)板計數(shù)顯示1個100 mm培養(yǎng)皿的細胞總數(shù)約為1.5×106個;培養(yǎng)至P4代細胞長滿視野，呈明顯魚群狀排布（圖1 f）。

2.2 hUC-MSCs的免疫表型

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，細胞表面CD90+100%，CD105+98.04%，CD73+100%，均>95%;CD34+、CD45+、CD11b+、CD19+、HLA-DR+均<5%;符合hUC-MSCs的免疫表型鑒定標準。

2.3 過表達慢病毒載體構(gòu)建及滴度檢測

目的基因載體名稱為GV492;克隆位點為Age Ⅰ;熒光標記為gcGFP。目的基因載體元件的順序為：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin（圖2）。對適量菌液進行測序，將測序結(jié)果與目的基因序列進行Blast比對分析。其測序結(jié)果經(jīng)過DNAssist Version 1.0軟件分析與GenBank中[STBX]LL-37基因（CAMP（NM_004345））CDS序列相一致，證明成功擴增出[STBX]LL-37基因CDS全序列，重組質(zhì)粒pGC-FU-LL-37構(gòu)建成功。熒光法檢測顯示，實驗組包裝病毒滴度為1×1012 TU/L。

2.4 LL-37慢病毒載體轉(zhuǎn)染hUC-MSCs效率

LL-37轉(zhuǎn)染hUC-MSCs 72 h轉(zhuǎn)染效率為85.40%，轉(zhuǎn)染成功的細胞呈現(xiàn)綠色熒光（圖3）。

2.5 各組 LL-37蛋白表達及細胞培養(yǎng)上清液中LL-37含量比較

Western blot檢測顯示，實驗組LL-37蛋白表達高于空載體組、對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=87.281，P<0.05）。見圖4，表3。提示實驗組hUC-MSCs中LL-37過表達。實驗組細胞培養(yǎng)上清液LL-37含量高于空載體組和對照組，差異有顯著性（F=567.838，P<0.05）;空載體組和對照組比較差異無顯著性（P>0.05）。見表3。

2.6 各組細胞運動、生長能力比較

細胞劃痕實驗顯示，實驗組、對照組以及空載體組的hUC-MSCs運動、生長能力均良好（圖5）。培養(yǎng)20 h各組均可見細胞良好的融合、生長效果，表明轉(zhuǎn)染[STBX]LL-37基因或轉(zhuǎn)染空載體均未對細胞生長形態(tài)造成明顯影響。

2.7 各組抑菌實驗結(jié)果比較

抗生素組以及LL-37轉(zhuǎn)染組的抑菌率分別為（99.524±0.242）%、（98.744±0.142）%（其中A組為計算抑菌率而設(shè)，不存在抑菌率），抗生素組、LL-37轉(zhuǎn)染組比較，差異有顯著性（F=23.183，P<0.05）。

3 討論

本文研究應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)抗菌肽[STBX]LL-37基因轉(zhuǎn)染至hUC-MSCs，觀察培養(yǎng)上清液對金葡菌抑制作用，結(jié)果顯示LL-37轉(zhuǎn)染組與抗生素組均有顯著抑菌效果（抑菌率均>95%）?？赡転闊齻麆?chuàng)面金葡菌感染的防治提供新方法。

創(chuàng)面金葡菌感染不僅會影響創(chuàng)面愈合，還會導(dǎo)致創(chuàng)周炎癥、菌血癥甚至感染性休克，嚴重影響燒傷、慢性創(chuàng)面病人康復(fù)。目前抗生素應(yīng)用廣泛，研發(fā)除抗生素外的新型抗菌藥應(yīng)用于臨床，既可以豐富臨床抗菌藥物的多樣性，又可以根據(jù)病人感染狀態(tài)采取個性化的合理抗菌藥。抗菌肽既不容易導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，又具有廣譜抗微生物作用，因而具有極高的應(yīng)用價值[10-11]。CHEREDDY等[12]的研究表明，人抗菌肽LL-37能夠顯著減少傷口周圍細菌黏附，抑制細菌生物膜的形成從而發(fā)揮抗菌的作用。GRONBERG等[13]發(fā)現(xiàn)，機體對LL-37具有良好的耐受性，用其治療下肢靜脈潰瘍導(dǎo)致的難愈性創(chuàng)面，愈合效率明顯提高。添加外源性抗菌肽存在價格昂貴、作用時間短等客觀因素[14]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源性抗菌肽基因轉(zhuǎn)染至種子細胞，使其在修復(fù)缺損部位時能夠持續(xù)表達，有效促進細胞增殖、新生血管形成，具有臨床應(yīng)用的潛力[15]。

LL-37不僅有殺菌作用，而且在獲得性免疫包括細胞因子的釋放、免疫細胞的趨化以及炎癥的發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用[16]?？咕腖L-37在保護結(jié)腸菌群平衡、黏膜穩(wěn)態(tài)、抗炎反應(yīng)和抗癌發(fā)生中

發(fā)揮著重要角色[17]。當機體出現(xiàn)創(chuàng)傷、感染時，在絲氨酸蛋白酶-3和其他蛋白水解酶的作用下，生成活性抗菌肽LL-37，參與機體的防御反應(yīng)[18]。另外，LL-37還可通過激活、募集T淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞以及增強巨噬細胞吞噬等發(fā)揮抗菌作用[19]。人源抗菌肽LL-37不僅具有極高的生物安全性，而且不易導(dǎo)致病原菌發(fā)生抗性突變，是新型抗生素設(shè)計及合成的理想模板[20-21]。

MSCs是基因治療較為理想的靶細胞[22]，能夠相對容易地導(dǎo)入外源基因，且細胞在多次分裂后所導(dǎo)入基因能夠繼續(xù)表達。而慢病毒具有感染效率高、毒性低、不易發(fā)生宿主免疫反應(yīng)、能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因穩(wěn)定感染等特點，是較為理想的基因載體[23]。用[STBX]LL-37基因修飾MSCs，利用培養(yǎng)上清液局部作用于燒傷創(chuàng)面細菌所在區(qū)域，可以達到靶向治療的目的，安全、容易操作，還能起到較好的抑菌效果。MSCs具有多向分化和旁分泌能力，在再生醫(yī)學(xué)中具有相當大的應(yīng)用潛力。SHI等[24]進行的研究顯示，hUC-MSCs在深Ⅱ度燒傷大鼠模型組織修復(fù)中具有促進作用，其分泌的生物活性分子可有效促進傷口愈合。有研究表明，應(yīng)用干細胞培養(yǎng)上清液治療能夠發(fā)揮干細胞的治療效果[25]。KRASNODE-MBSKAYA等[26]將合成的LL-37與大腸埃希菌和銅綠假單胞菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其具有抑制細菌生長的作用;應(yīng)用ELISA方法檢測干細胞培養(yǎng)上清液中的LL-37成分，結(jié)果顯示干細胞可以將LL-37分泌到細胞外。干細胞培養(yǎng)上清液富含干細胞分泌的各種

[LL]細胞因子，可大量生產(chǎn)，易于儲存，可采用濾過的方式來滅菌，治療前無需復(fù)蘇及擴增細胞，這些優(yōu)勢使其具有廣闊的應(yīng)用前景[27]。與直接應(yīng)用干細胞相比，外用干細胞培養(yǎng)上清液既能將干細胞分泌的生物學(xué)成分有效利用，又經(jīng)濾過滅菌，并且避免了直接應(yīng)用干細胞存在的同種異體免疫排斥反應(yīng)，更安全，且簡便易行，

有望成為一種可以應(yīng)用于臨床的治療感染、皮膚缺損等疾病的綜合補充措施之一。本文應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)抗菌肽[STBX]LL-37基因轉(zhuǎn)染至hUC-MSCs，觀察培養(yǎng)上清液對金葡菌的抑制作用，結(jié)果顯示LL-37轉(zhuǎn)染組與抗生素組均有顯著的抑菌效果（抑菌率均>95%），為燒傷創(chuàng)面金葡菌感染的防治提供新方法。

綜上所述，針對燒傷、感染創(chuàng)面等金葡菌感染，目前多采用抗生素治療，其中有些病人對抗生素過敏，不宜使用抗生素治療，因此研發(fā)抗生素以外的新型抗菌藥，有助于增加抗菌藥物的多樣性;同一細菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性也有差異，有肝腎功能損害者需慎用抗菌藥以免加重肝腎損害，針對單一用藥效果不佳者可選用兩種藥物協(xié)同使用。其中轉(zhuǎn)染有LL-37的干細胞培養(yǎng)上清液對金葡菌具有抑菌效果，有望成為一種可以應(yīng)用于臨床的治療創(chuàng)面感染的新方法。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

[收稿日期]2019-11-04; [修訂日期]2020-02-25

[基金項目]山東省自然科學(xué)基金面上項目（ZR2014HM113）

[第一作者]劉永娟（1987-），女，碩士研究生。

[通信作者]冷向鋒（1976-），男，博士，副主任醫(yī)師。E-mail：Lxfzqcn@163.com。