孫菁陽　肖華　潘曉雯　劉雯　張忠廣

[摘要]目的 探討微管相關(guān)蛋白9（MAP9）對EB病毒（EBV）陽性胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法 用小干擾RNA（siRNA）干擾陽性胃癌細(xì)胞系GT38中MAP9基因的表達(dá)，蛋白免疫印跡（Western blot）方法檢測干擾效果，細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（CCK-8）檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期，Western blot方法檢測細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDK6、CDK2）表達(dá)。結(jié)果 MAP9 siRNA感染GT38細(xì)胞后，MAP9表達(dá)下降，差異有顯著性（F=1 039.00，P<0.001）;細(xì)胞增殖數(shù)量明顯升高，處于S期細(xì)胞比例明顯增高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，CDK6、CDK2蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79.350～576.700，t=2.880、4.699，P<0.001）。結(jié)論MAP9可能通過調(diào)控CDK相關(guān)周期激酶而抑制EBV陽性胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在EBV 相關(guān)胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用。

[關(guān)鍵詞] 皰疹病毒4型，人;微管相關(guān)蛋白質(zhì)類;胃腫瘤;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R735.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A[文章編號] 2096-5532（2020）04-0432-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.077

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.0940.011.html;2020-04-18 16：48

EFFECT OF MICROTUBULE-ASSOCIATED PROTEIN 9 ON THE BIOLOGICAL BEHAVIOR OF EPSTEIN-BARR VIRUS-POSITIVE GASTRIC CANCER CELLS

SUN Jingyang， XIAO Hua， PAN Xiaowen， LIU Wen， ZHANG Zhongguang

（Department of Medical Microbiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of microtubule-associated protein 9 （MAP9） on the biological behavior of Epstein-Barr virus （EBV）-positive gastric cancer cells.Methods A small interfering RNA （siRNA） was used to interfere with the expression of MAP9 gene in positive gastric cancer cell line GT38， and Western blot was used to observe the interference effect. CCK-8 assay was used to measure cell proliferation， flow cytometry was used to measure cell apoptosis and cell cycle， and Western blot was used to measure the expression of the cyclin-dependent kinases CDK6 and CDK2. Results There was a significant reduction in the expression of MAP9 after GT38 cells were infected with MAP9 siRNA （F=1 039.000，P<0.001）. There were significant increases in cell proliferation and the proportion of cells in S phase， a significant reduction in cell apoptosis rate， and significant increases in the protein expression of CDK6 and CDK2 （F=79.350-576.700，t=2.880，4.699;P<0.001）.ConclusionMAP9 may inhibit the proliferation and promote the apoptosis of EBV-positive gastric cancer cells by regulating the cyclin-depen-dent kinases， and thus it may play the role of tumor suppressor gene in the development and progression of EBV-related gastric cancer.

[KEY WORDS] herpesvirus 4， human; microtubule-associated proteins; stomach neoplasms; cell proliferation; apoptosis

EB病毒（EBV）是最早發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤相關(guān)病毒，在人群中廣泛存在，全球約有95%以上的人感染EBV[1-2]。已有研究證實(shí)，EBV與多種腫瘤有密切關(guān)系，尤其是淋巴細(xì)胞源性和上皮細(xì)胞源性惡性腫瘤，如胃癌、鼻咽癌、淋巴瘤等[3-4]。胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，預(yù)后差，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高[5-6]。EBV相關(guān)胃癌（EBVaGC）約占胃癌的10%，是除微衛(wèi)星不穩(wěn)定性胃癌、基因組穩(wěn)定胃癌和染色體不穩(wěn)定性胃癌之外的一個(gè)特殊胃癌亞型[7-10]。微管相關(guān)蛋白（MAPs）是一類與細(xì)胞骨架微管相互作用的蛋白質(zhì)，細(xì)胞中某些MAPs的異常表達(dá)能夠引起微管動(dòng)態(tài)系統(tǒng)的失衡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[11-12]。微管相關(guān)蛋白9 （MAP9）是一種細(xì)胞周期相關(guān)的微管蛋白，定位于有絲分裂紡錘體，在雙極紡錘體組裝和有絲分裂的過程中起關(guān)鍵作用[13]。MAP9表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致紡錘體異常，從而引起染色體集合和分離出現(xiàn)錯(cuò)誤，形成非整倍體細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤的特征之一[14];而抑制MAP9表達(dá)可形成多極紡錘體，使有絲分裂延遲，引起胞質(zhì)分裂失敗或細(xì)胞死亡[15]。因此MAP9異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生

密切相關(guān)，但是迄今為止尚未有病毒感染與MAP9相關(guān)性的研究報(bào)道[16]。前期研究發(fā)現(xiàn)，EBV陽性胃癌細(xì)胞系中MAP9蛋白呈高表達(dá)，而在EBV陰性胃癌細(xì)胞系則呈低表達(dá)[17]。本文研究以EBV陽性胃癌細(xì)胞系作為研究對象，探討MAP9生物學(xué)作用，分析EBV對MAP9差異表達(dá)可能產(chǎn)生的影響，為闡明EBVaGC的發(fā)生發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料

實(shí)驗(yàn)所用GT38為EBV陽性胃癌細(xì)胞系;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司; MAP9、β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司， CDK2、CDK6抗體購自美國CST公司;凋亡檢測試劑盒Annexin V-APC和PI均購自美國EBioscience公司;細(xì)胞周期檢測試劑盒購自美國Abcam公司;細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒CCK-8購自Solarbio公司;所用引物由上海吉瑪公司合成，種類及其序列見表 1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 siRNA轉(zhuǎn)染 GT38細(xì)胞以每孔5×104個(gè)接種于6孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日待細(xì)胞貼壁80%后即進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，8 h后更換含有血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48、72 h，把轉(zhuǎn)染陰性對照以及MAP9 siRNA的細(xì)胞分別設(shè)置為si-NC組、si-MAP9組。

1.2.2 蛋白免疫印跡（Western blot）方法測定干擾效果 取轉(zhuǎn)染之后的細(xì)胞分別用PBS洗滌2次，再加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，于冰上孵育30 min。以BCA法測定蛋白樣品的濃度，每孔加入30 μg蛋白樣品，85 V、120 min電泳，從玻璃板中間取出凝膠。將PVDF膜置于甲醇中孵育10 s后，300 mA、110 min轉(zhuǎn)膜。加入50 g/L脫脂奶粉封閉60 min，加入一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗10 min（共3次），加入適當(dāng)比例稀釋后的二抗，室溫孵育60 min，TBST洗10 min（共3次），暗室內(nèi)曝光。采用Image J分析內(nèi)參β-actin和目的條帶MAP9的灰度值，以MAP9的灰度值/β-actin的灰度值表示MAP9蛋白水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（CCK-8）檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)期生長的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度至1×107/L，鋪96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，分別在轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h每孔加10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)37 ℃孵育1 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后，PBS洗2次，棄PBS，細(xì)胞沉淀加入提前預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)0.66乙醇輕輕混勻，4 ℃固定至少2 h，最長可儲(chǔ)存4周。上機(jī)前準(zhǔn)備：4 ℃取出固定好的細(xì)胞，加入300～400 μL的PBS重懸，吹散成單細(xì)胞懸液，加入5 μL的RNase，放置15 min后加入5 μL濃度為10 pmol/L的PI。暗盒中避光，4 ℃孵育20～30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，用Flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，觀察細(xì)胞各期的比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后，PBS輕洗細(xì)胞2次，加入300 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，盡量吹打均勻呈單細(xì)胞懸液。采用Anne-xin V-APC和PI雙染，取100 μL細(xì)胞懸液置于新的EP管中，依次加入5 μL APC和5 μL PI輕輕混勻。避光孵育15～30 min，1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀，上機(jī)檢測兩組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)變化

按照1.2.2部分的Western blot方法，分別檢測各組不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞CDK6、CDK2蛋白表達(dá)的變化，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用Students t檢驗(yàn)或方差分析（ANOVA）。以 P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA干擾后GT38細(xì)胞中MAP9蛋白表達(dá)

Western blot檢測顯示，應(yīng)用GT38細(xì)胞轉(zhuǎn)染MAP9基因siRNA后24、48和 72 h，MAP9蛋白的表達(dá)水平分別為0.41±0.03、0.62±0.03、0.70±0.04，與si-NC組（2.25±0.04）比較均明顯下降，差異有顯著性（F=1 039.00，P<0.001）。表明該序列可有效沉默MAP9的表達(dá)。見圖1。

2.2 干擾MAP9表達(dá)對胃癌陽性細(xì)胞GT38細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，干擾MAP9表達(dá)后，細(xì)胞增殖數(shù)量升高，72、96 h時(shí)si-MAP9組吸光度值高于si-NC組，差異有顯著意義（F=6.686、7.857，P<0.001）。見表2。

2.3 干擾MAP9表達(dá)對EBV陽性胃癌細(xì)胞GT38細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示， si-MAP9組處于S期細(xì)胞比例高于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.880，P<0.05）。見表3。表明干擾MAP9表達(dá)可促進(jìn)GT38細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變。

2.4 干擾MAP9表達(dá)對EBV陽性胃癌GT38細(xì)胞凋亡的影響

AnnexinV-FITC和PI試劑雙染檢測結(jié)果顯示，si-MAP9組細(xì)胞凋亡率明顯低于si-NC組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=4.699，P<0.05）。見表3。干擾MAP9表達(dá)后EBV陽性胃癌GT38細(xì)胞凋亡率明顯降低。

2.5 干擾MAP9表達(dá)對EBV陽性胃癌GT38細(xì)胞CDK6、CDK2周期蛋白表達(dá)影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，干擾 MAP9表達(dá)后，EBV陽性胃癌 GT38細(xì)胞中周期蛋白CDK6和CDK2表達(dá)水平升高，與si-NC組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79.350、102.800，P<0.001）。下調(diào)MAP9能促進(jìn)CDK6、CDK2蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。見圖2、表4。

3 討論

誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生基因組不穩(wěn)定是EBV促進(jìn)腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，EBV潛伏感染可通過引起宿主細(xì)胞DNA損傷、影響DNA損傷修復(fù)及干擾正常的細(xì)胞周期調(diào)控，進(jìn)而誘發(fā)宿主細(xì)胞基因組不穩(wěn)定[18-19]。在細(xì)胞有絲分裂過程中，雙極紡錘體的形成是保證遺傳物質(zhì)在子代細(xì)胞間平均分配的必要條件;單極或多極紡錘體的形成會(huì)導(dǎo)致染色體的異常分離，形成非整倍體，其被認(rèn)為是腫瘤的特征之一。細(xì)胞有絲分裂是個(gè)連續(xù)變化的過程，任何基因的異常都可能導(dǎo)致有絲分裂的失敗或錯(cuò)誤，造成染色體缺失或重復(fù)，影響細(xì)胞分裂和DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的形成[20]。SHUMILOV等[21]的研究結(jié)果顯示，EBV感染分裂中的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形成過多的紡錘體極，使染色體不再被準(zhǔn)確而平均地分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中，導(dǎo)致染色體異常，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生，說明EBV參與了腫瘤形成的早期過程。EBV誘發(fā)的胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，EBVaGC預(yù)后差，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，目前臨床上整體治療效果仍不理想，尋找早期診斷的分子標(biāo)志、治療靶標(biāo)及預(yù)后監(jiān)測因子，對胃癌的治療有重要作用[22]。

MAP9作為細(xì)胞周期的微管蛋白，調(diào)控細(xì)胞有絲分裂處于穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡，MAP9表達(dá)異常可導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性，進(jìn)而參與惡性腫瘤的形成[23]。然而，目前對MAP9與腫瘤關(guān)系的研究尚處于初期階段[24-25]。VENOUX等[26]的研究結(jié)果表明，在骨肉瘤U-2OS、乳癌Cal51PE和Burkitt淋巴瘤Daudi等細(xì)胞系中均檢測到了MAP9表達(dá)，而在結(jié)直腸癌LS174、早幼粒白血病NB4和淋巴瘤細(xì)胞系U937等細(xì)胞系中未檢測到MAP9表達(dá)。ROUQUIER等[27]對結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的檢測結(jié)果顯示，MAP9在癌組織中低表達(dá)。目前研究尚未能明確MAP9在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，而且MAP9轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控機(jī)制也無相關(guān)報(bào)道[28]。MAP9在腫瘤組織中表達(dá)及其作用可能與腫瘤組織和細(xì)胞類型有關(guān)，而EBVaGC是胃癌中的一種獨(dú)特亞群[29]。我們的前期研究結(jié)果顯示，MAP9蛋白在EBV陽性胃癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，而MAP9 mRNA和蛋白在EBV陰性胃癌細(xì)胞系中低表達(dá)或不表達(dá)，提示EBV促進(jìn)MAP9表達(dá)可能是EBV參與胃癌發(fā)生的一種機(jī)制[17]。

一些研究表明，MAP9在DNA損傷的早期發(fā)揮作用，在受損細(xì)胞中MAP9與P53結(jié)合，可誘導(dǎo)P53蛋白的乙酰化和積累，抑制MDM2介導(dǎo)的P53降解。MAP9在EBV陽性細(xì)胞系中的異常高表達(dá)是一種失衡和紊亂，因此，作為DNA損傷的受體成分，MAP9的突變和失衡可能通過P53信號通路參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)而調(diào)控EBVaGC細(xì)胞的增殖和凋亡[30]。

細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDK）是一組與細(xì)胞周期過程相對應(yīng)的Ser/thr激酶，所有類型的CDK在細(xì)胞周期中交替激活，磷酸化相應(yīng)的底物，使細(xì)胞周期過程有條不紊地繼續(xù)下去[31]。CDK6和CDK2在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要的作用，是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程中G1期限制點(diǎn)的關(guān)鍵分子，相關(guān)研究結(jié)果表明，CDK6和CDK2蛋白的表達(dá)對正常細(xì)胞周期進(jìn)程至關(guān)重要[32]。

本文研究結(jié)果顯示，應(yīng)用siRNA干擾EBV陽性胃癌細(xì)胞系GT38中MAP9基因的表達(dá)后，細(xì)胞S期比例上升，增殖能力增強(qiáng)，CDK6、CDK2周期蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率降低，提示MAP9可能通過調(diào)控CDK相關(guān)周期激酶而抑制EBV陽性胃癌細(xì)胞系GT38的增殖，并且MAP9能促進(jìn)GT38細(xì)胞的凋亡。說明MAP9可能通過調(diào)控CDK相關(guān)周期激酶而抑制EBV陽性胃癌細(xì)胞系GT38的增殖。本文細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MAP9能促進(jìn)GT38細(xì)胞的凋亡。該結(jié)果提示MAP9可能是胃癌發(fā)生發(fā)展中一個(gè)重要的抑癌因素，在EBVaGC的發(fā)生發(fā)展中起到抑癌基因的作用。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

[收稿日期]2019-09-16; [修訂日期]2020-02-10

[基金項(xiàng)目]山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2018WSA-03028）

[第一作者]孫菁陽（1994-），女，碩士研究生。

[通信作者]張忠廣（1965-），男，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：zhangzhong-guang@126.com。