王崇　張程　張湘燕　姚紅方　張小潤

摘要：目的 研究在臨床上，三氧化二砷（As2O3）對人大細(xì)胞肺癌（NCI-H460細(xì)胞）細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以探討新的肺癌治療方法。方法 配制NCI-H460細(xì)胞的細(xì)胞懸液（濃度為5×104個(gè)/mL），給予不同濃度的As2O3干預(yù)，并將其分為4組濃度分別為：10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L ，各組干預(yù)時(shí)間分別為24、48、72 h。細(xì)胞增殖抑制率通過MTT法檢測，各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變通過鏡下觀察；細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)的變化通過原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測，并與陰性對照組進(jìn)行比較；按上述干預(yù)濃度及干預(yù)時(shí)間，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果 As2O3對NCI-H460細(xì)胞增殖的抑制率隨時(shí)間延長和濃度增加而增加（P<0.05）， 凋亡指數(shù)隨時(shí)間延長和濃度增加而增加 （P<0.05）。結(jié)論 As2O3可抑制NCI-H460細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈時(shí)間、劑量依賴性。

關(guān)鍵詞：三氧化二砷；大細(xì)胞肺癌；NCI-H460細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

三氧化二砷，分子式為As2O3，別名：砒霜，是具有代表性的砷化合物，主要用于治療胃癌，胰腺癌、梅毒、結(jié)核等[1]，并在治療急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）過程中有著顯著的療效[2]。因其緩解率高， 和其他抗癌藥物無交叉反應(yīng)性，無骨髓抑制和嚴(yán)重毒副作用而獲得了廣泛重視，并被美國FDA批準(zhǔn)用于APL的治療。臨床研究表明，As2O3對實(shí)體腫瘤如肺癌（A549細(xì)胞）、胰腺癌、胃癌等具有良好的抗癌作用。國內(nèi)外報(bào)道多見應(yīng)用As2O3作用于多種肺癌細(xì)胞方面，如Anip973細(xì)胞、NCI-H69細(xì)胞、A549細(xì)胞的凋亡，但是很少見到有關(guān)As2O3誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡的報(bào)道，繼而本實(shí)驗(yàn)選擇NCI-H460細(xì)胞，觀察As2O3對該細(xì)胞增殖及凋亡方面的影響，為臨床上尋找對該類腫瘤新的治療方法，提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞 NCI-H460細(xì)胞 （由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2試劑 As2O3（哈爾濱伊都藥業(yè)）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche 公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液、 胎牛血清（美國HyClone公司）。

1.3儀器 Bio-Rad 550 酶標(biāo)儀（美國 Bio-Rad公司）；TS100倒置微鏡 （日本Nikon公司）； JNOECXS-212-202生物顯微鏡 （南京江南光電集團(tuán)股份有限公司）；流式細(xì)胞儀（BDFACSAria）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 參見張小潤、王曉宇等研究類似[3]。

1.2.2 MTT法測定As2O3對NCI-H460細(xì)胞的生長抑制率 顯微鏡下觀察細(xì)胞，呈現(xiàn)對數(shù)生長期，0.25%胰酶消化成細(xì)胞懸液，離心1000 rpm/min、10 min，用含10%胎牛血清及青鏈霉素混合液的RPMI-1640全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度約5×104個(gè)/ml。將100 μl/孔的細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，共設(shè)4個(gè)平行組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)1組陰性對照組（100 μl無藥物干預(yù)的上述細(xì)胞懸液），5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，然后每孔加入以生理鹽水溶解的不同濃度的As2O3（10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）50 μl，并向?qū)φ战M加入細(xì)胞培養(yǎng)液50μl，設(shè)定24 h、48 h、72 h為上述5組的反應(yīng)時(shí)間，帶反應(yīng)時(shí)間到達(dá)后，吸去原培養(yǎng)液并用生理鹽水沖洗各孔，然后向各孔加入20 μl MTT，并于4 h后加二甲亞砜（DMSO）200 ul于每孔中，使用酶標(biāo)儀測量吸光度OD（490 nm波長），對應(yīng)3個(gè)復(fù)孔，反復(fù)3次實(shí)驗(yàn)每組濃度。細(xì)胞抑制率%=（1-給藥組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡的形態(tài)通過原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）法檢測 同2.2操作得到細(xì)胞懸浮液5×104個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)到24孔板中培養(yǎng)，400 μl/孔，共設(shè)4個(gè)平行組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置1正常對照組孔（不加藥），37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h使之貼壁，然后加入200 μl不同濃度的As2O3（生理鹽水溶解），藥物終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，分別作用24 h、48 h、72 h，到實(shí)驗(yàn)時(shí)間后，進(jìn)行凋亡檢測，具體步驟參見張小潤、王曉宇等研究[3]。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡指數(shù) 使用上述同樣的方法將細(xì)胞濃度稀釋至5×105/ml，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)到6孔板中培養(yǎng)，2 ml/孔，共設(shè)4個(gè)平行組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置1正常對照組孔（不加藥），37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h使之貼壁，然后加入1000 μl不同濃度的As2O3（生理鹽水溶解），藥物終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，分別作用24 h、48 h、72 h，到實(shí)驗(yàn)時(shí)間后，進(jìn)行凋亡檢測，具體步驟見試劑說明書，凋亡指數(shù)=（Q1+Q2）×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、處理，數(shù)據(jù)以（x±s）差表示，組間多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NCI-H460細(xì)胞形態(tài)變化 在不同濃度As2O3作用后，NCI-H460細(xì)胞隨著藥物濃度的增加、干預(yù)時(shí)間延長， 部分NCI-H460細(xì)胞胞漿內(nèi)開始有空泡形成，細(xì)胞輪廓明顯，少部分細(xì)胞脫落，漂浮于培養(yǎng)液中；亦有少數(shù)細(xì)胞體積增大，胞體腫脹、破裂，呈壞死狀。

2.2 As2O3對NCI-H460細(xì)胞增殖抑制率的影響As2O3能抑制NCI-H460細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間、劑量依賴性。不同濃度As2O3作用不同時(shí)間后NCI-H460細(xì)胞增殖的抑制率比較，濃度10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L作用24 h后NCI-H460細(xì)胞形態(tài)，見圖1，表1。

圖1 濃度10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L As2O3

作用24 h后NCI-H460細(xì)胞形態(tài)（×200）

2.3 As2O3對NCI-H460細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)的影響 TUNEL染色，陰性組見藍(lán)色的凋亡陰性染色；陽性組凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，細(xì)胞呈小片或散在分布，細(xì)胞核碎裂、溶解，形狀不一，易于觀察，伴隨不斷增大的藥物濃度，可見棕黃色的凋亡細(xì)胞的分布不斷擴(kuò)大，見圖2。

圖2 TUNEL法檢測不同濃度As2O3作用于

NCI-H460細(xì)胞24 h后的凋亡圖形

注：A：0 μmol/L；B：10 μmol/L；C：80 μmol/L。

2.4 NCI-H460細(xì)胞的凋亡指數(shù)通過流式細(xì)胞儀檢測 在不同時(shí)間、不同濃度下As2O3對NCI-H460細(xì)胞凋亡作用的影響可通過流式細(xì)胞儀觀察；隨著劑量的增加，時(shí)間的延長，細(xì)胞的的凋亡指數(shù)在不同時(shí)間下呈進(jìn)行性升高。數(shù)據(jù)表明，NCI-H460細(xì)胞的凋亡與As2O3的誘導(dǎo)有明顯關(guān)系，并與劑量和時(shí)間呈現(xiàn)依賴相關(guān)性。（通過圖3能夠發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，Q1+Q2的比例不斷擴(kuò)大），見表2，圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測10 μmol/L As2O3作用于

NCI-H460細(xì)胞不同時(shí)間的凋亡指數(shù)的比較

注：A：24 h，B：48 h，C：72 h。

3 討論

肺癌，為最常見的肺部惡性腫瘤，分為小細(xì)胞肺癌及非小細(xì)胞肺癌，后者中又以大細(xì)胞肺癌惡性程度最高，雖傳統(tǒng)治療以手術(shù)為主，但是因其轉(zhuǎn)移快，手術(shù)后預(yù)后亦欠佳，故化療在其治療過程中起著極其重要的的作用。目前，很多研究顯示，絕大多數(shù)藥物是通過抑制細(xì)胞的生長、增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用的。

三氧化二砷，俗稱砒霜，近年來許多報(bào)道發(fā)現(xiàn)，As2O3在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中發(fā)揮著明顯的抗癌作用，受到全世界的矚目如急性早幼粒細(xì)胞白血病[4]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，As2O3可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，且As2O3在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面與其他藥物相比具有多途徑的優(yōu)勢；其次，As2O3在毒副作用和抗癌廣譜性方面與其他抗癌藥物相比也具有明顯的優(yōu)勢[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，As2O3治療各種實(shí)體瘤如胃癌、胰腺癌和肺癌的主要機(jī)制是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。

劉琳[9]等國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)對于人的大腸癌細(xì)胞，給予As2O3 3 d的劑量，并作用24 h、48 h、72 h，能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并可見凋亡形態(tài)學(xué)變化。借鑒該項(xiàng)研究經(jīng)驗(yàn)，制定本次試驗(yàn)的藥物As2O3濃度分別10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，干預(yù)時(shí)間為24 h、48 h、72 h?，F(xiàn)代的檢測凋亡的方法有流式細(xì)胞儀檢測法、MTT法、TUNEL法，其中流式細(xì)胞儀檢測法具有準(zhǔn)確性好、精度高、速度快等優(yōu)點(diǎn)。在本次試驗(yàn)中，分別使用這三種檢測方法以探討As2O3對NCI-H460細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖指數(shù)的影響。其中MTT法，采用不同時(shí)間及濃度的As2O3作用于NCI-H460細(xì)胞，并通過顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，陰性對照組細(xì)胞折光性好，貼壁良好，無脫落，呈梭行或者不規(guī)則形。對于藥物干預(yù)組，細(xì)胞逐漸變圓，細(xì)胞輪廓更加明顯，部分NCI-H460細(xì)胞胞漿內(nèi)有空泡形成，且折光性差，甚至在細(xì)胞培養(yǎng)液中出現(xiàn)脫落漂浮現(xiàn)象，隨著藥物濃度和作用時(shí)間的的增加，細(xì)胞的具有更明顯的形態(tài)變化。

本次實(shí)驗(yàn)中，在不同時(shí)間及不同濃度下，As2O3作用于NCI-H460細(xì)胞，排除部分因檢測誤差和標(biāo)本例數(shù)少等原因造成濃度抑制率、作用時(shí)間和凋亡指數(shù)無明顯差異性變化。從總趨勢上來說，As2O3不同時(shí)間及不同濃度下對NCI-H460細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且和時(shí)間以及劑量呈現(xiàn)相關(guān)依賴關(guān)系，這與韋國楨，曹琦[10]和Chow等[11]的研究結(jié)果類似，從而可作出推斷，As2O3可抑制NCI-H460的增殖，并與時(shí)間和劑量呈現(xiàn)可能的相關(guān)依賴關(guān)系；另外，姚和瑞[12]等的研究表明，As2O3可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞（NCI-H69）凋亡，并且凋亡指數(shù)與濃度的增大呈進(jìn)行性上升關(guān)系，同樣揭示了As2O3能夠誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡，并具有與時(shí)間及劑量的相關(guān)依賴性。本次研究中檢測NCI-H460細(xì)胞的凋亡指數(shù)采用的是流式細(xì)胞儀，也發(fā)現(xiàn)As2O3能誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡，并且凋亡指數(shù)與劑量及時(shí)間相關(guān)依賴關(guān)系，同樣可推斷出，As2O3能夠誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡，并具有與時(shí)間及劑量的相關(guān)依賴性。與其他相關(guān)報(bào)道結(jié)合，可以看出化療抗腫瘤的機(jī)制可能與多種化療藥物干涉多種癌基因的表達(dá)有關(guān)，如基因bcl-2，P53等，還有報(bào)道更詳細(xì)的指出，三氧化二砷可以通過下調(diào)表達(dá)bcl-2基因與上調(diào)表達(dá)P53基因有關(guān)[13]，更進(jìn)一步明確三氧化二砷抗腫瘤的機(jī)制，有待于更深層次的完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

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編輯/翟辰萬