蘇秋東 郭敏卓 伊 瑤 畢勝利 賈志遠(yuǎn) 邱 豐

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)屬于黃病毒科肝炎病毒屬，是一種由脂膜包裹的正鏈RNA病毒。其基因組RNA長(zhǎng)約9600nt，包含一個(gè)多蛋白開放閱讀框，編碼約3000個(gè)氨基酸的多聚蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白主要有C、E1和E2，非結(jié)構(gòu)蛋白主要有NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。HCV是慢性肝炎的主要致病因子，預(yù)估全球有7110萬(wàn)慢性丙肝患者，約10%～20%慢性肝炎患者在20～30年里將會(huì)發(fā)展為肝纖維化和肝硬化甚至肝癌[1]。2015年全球HCV感染診斷率僅為20%，其中只有15%確診丙肝患者得到了有效治療，HCV的診斷治療問題亟待解決[2]。在目前直接抗病毒(direct-acting antivirals, DAAs)療法對(duì)HCV有效的情況下，提高診斷及治療率對(duì)于實(shí)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織2030年消除病毒性肝炎的目標(biāo)至關(guān)重要。

HCV實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括核酸和血清學(xué)診斷。需要提取病毒核酸、受型別特異性限制、成本高以及需要專業(yè)操作是核酸檢測(cè)的弊端。而血清學(xué)檢測(cè)簡(jiǎn)單易行，成本低廉，所以一直是HCV臨床診斷的主要輔助手段。HCV病毒蛋白 C、NS3、NS4和NS5區(qū)擁有保守的免疫顯性區(qū)域[3]。因此HCV抗體檢測(cè)用診斷抗原主要圍繞這4個(gè)區(qū)設(shè)計(jì)。第1代HCV抗體檢測(cè)使用NS4的一段抗原，第2代為包含C、NS3和NS4免疫顯性區(qū)的重組抗原，目前使用的第3代檢測(cè)試劑加入NS5區(qū)抗原且優(yōu)化了NS3區(qū)抗原[4]。迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HCV存在8個(gè)基因型和86個(gè)基因亞型[5,6]。因此目前常用的抗體檢測(cè)試劑都使用3～6種重組抗原或合成肽，大大增加了檢測(cè)成本和非特異性反應(yīng)。多表位HCV診斷抗原的設(shè)計(jì)為解決這些問題提供了一條很好的途徑。最早的多表位抗原出現(xiàn)在2006年，隨后不同的設(shè)計(jì)層出不窮[7]。我國(guó)HCV主要流行亞型為1b和2a[8]。此研究將這兩種主要流行亞型的6個(gè)主要免疫區(qū)域進(jìn)行串聯(lián)，制備新型HCV抗體診斷抗原，并利用陰陽(yáng)性血清評(píng)價(jià)其診斷效能。

材料與方法

1.主要材料與試劑:BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。M48載體，為本科室構(gòu)建，由pET43.1a載體，在Nde Ⅰ和Nco Ⅰ酶切位點(diǎn)之間插入Trx標(biāo)簽改造所得。限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ以及T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司。預(yù)螯合Ni2+親和層析介質(zhì)為美國(guó)GE公司產(chǎn)品。山羊抗人IgG H&L(HRP)酶標(biāo)物為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。50份HCV陽(yáng)性血清參照WS213-2018丙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：①生化指標(biāo)異常；②血液抗-HCV陽(yáng)性；③血液HCV RNA陽(yáng)性，核酸定量范圍為4.97(4.52，6.34)[Log轉(zhuǎn)換，中位數(shù)(Q1，Q3)]；④來(lái)源于科室現(xiàn)存血清庫(kù)。50份HCV陰性血清：①血液抗-HCV陰性；②血液HCV RNA陰性；③來(lái)源于科室現(xiàn)存血清庫(kù)。HAV、HBV、HDV及HEV陽(yáng)性血清各20份，由實(shí)驗(yàn)室和臨床確診，來(lái)源于科室現(xiàn)存血清庫(kù)。

2.HCV多表位診斷抗原表達(dá)質(zhì)粒的制備:根據(jù)參考文獻(xiàn)[4,9～13]與相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，將HCV NS3(1b)aa 1201-1464、Core(1b)aa 1-34、NS4A(1b)aa 1681-1735、NS4A(2a)aa 1681-1735、NS4B(2a) aa 1929-1935及NS5A(2a)aa 2273-2307等6個(gè)抗原區(qū)域用(GGGS)3進(jìn)行串聯(lián)，5′端添加CCATGG(Nco Ⅰ)酶切位點(diǎn)，3′端添加CTCGAG(Xho Ⅰ)酶切位點(diǎn)，密碼子優(yōu)化后交由日本TaKaRa公司進(jìn)行基因合成，命名為H65F。利用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶將H65F亞克隆到M48表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。16h后挑取6個(gè)單菌落(1～6號(hào))接種于2ml培養(yǎng)基中(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取液，10g/L NaCl，50μg/ml氨芐霉素)振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)進(jìn)行小量表達(dá)，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序并雙酶切鑒定，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為H65。

3.HCV多表位診斷抗原的制備:選擇4號(hào)作為菌株進(jìn)行大量表達(dá)(3L)，誘導(dǎo)條件為30℃，1mmol/L IPTG，5h。離心(3500r/min, 10min, 4℃)收集沉淀，用溶解緩沖液(20mmol/L 磷酸鹽緩沖液，20mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，pH 7.0)重懸后用超聲儀破碎(功率300W，超聲時(shí)間20s，間歇時(shí)間20s，共20個(gè)循環(huán))，離心(11000r/min, 10min, 4℃)收集上清。將上清加載于預(yù)螯合Ni2+親和層析介質(zhì)中。分別用0、0.1、0.5mol/L咪唑(溶于溶解緩沖液中)進(jìn)行梯度洗脫。取樣進(jìn)行SDS-PAGE(恒流35mA，45min)電泳，分析H65蛋白的含量以及分布情況。將H65蛋白蛋白含量最高、純度最好的洗脫液于PBS (137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4, pH 7.4)中透析，并于0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.HCV多表位診斷抗原抗原性初步分析:H65蛋白抗原性的初步分析利用Western blot法檢測(cè)。取10μl透析后H65蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(恒流35mA，45min)，半干轉(zhuǎn)膜法(恒壓15V，35min)至PVDF膜上。室溫，封閉液(1% BSA，0.05% 吐溫-20，溶于PBS中)振蕩孵育PVDF膜1h。室溫，1∶10稀釋HCV陰陽(yáng)性血清后分別處理兩塊PVDF膜1h，而后用PBS洗膜10min。用山羊抗人IgG H&L(HRP)酶標(biāo)物(1∶5000)室溫處理PVDF膜1h后用高鹽緩沖液(0.5mol NaCl，0.2% SDS，溶于PBS中)洗膜30min后超純水洗膜，用DAB顯色，清水終止顯色。

5.HCV多表位診斷抗原診斷效能評(píng)價(jià):利用蛋白H65建立血清HCV-IgG抗體檢測(cè)間接法ELISA試劑盒，對(duì)“金標(biāo)準(zhǔn)”確診的陰陽(yáng)性血清樣本以及其他肝炎病毒陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其對(duì)陰陽(yáng)性血清標(biāo)本的鑒別能力，并與某商品化試劑盒進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其優(yōu)劣。包被緩沖液(50mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)1∶300稀釋蛋白H65后加入ELISA板中，37℃孵育2h。37℃，封閉液孵育1h后用PBST洗滌。每孔加PBS和待測(cè)血清各50μl，37℃孵育1h后洗滌；加入山羊抗人IgG H&L(HRP)酶標(biāo)物(1∶6000)，37℃孵育1h后洗滌；加新鮮配制TMB液顯色，2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處各孔吸收度值(A值)。

利用某商品化HCV-IgG ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)待測(cè)同批血清，具體操作遵循廠家說明書，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸收度值(A值)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 8.00軟件繪制6組血清A值散點(diǎn)圖。對(duì)HCV陰陽(yáng)性兩組血清A值分布進(jìn)行Wilcox檢驗(yàn)(獨(dú)立樣本Mann-WhitneyU檢驗(yàn))，原假設(shè)為在兩組類別上，A值分布相同。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選取陰性血清A值均值2.1倍作為臨界值。用McNemer檢驗(yàn)及Kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)方法的一致性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.融合表達(dá)層析純化可獲得高純度蛋白H65:HCV 6個(gè)抗原區(qū)域用(GGGS)3串聯(lián)并進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，片段大小為1608bp(圖1A)，構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序、雙酶切鑒定(圖1B)及小量表達(dá)(圖2A)證實(shí)構(gòu)建成功，命名為H65質(zhì)粒。

圖1 H65表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建A.H65表達(dá)區(qū)段示意圖；B.H65表達(dá)質(zhì)粒的鑒定；1.H65表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定；2.H65基因片段

H65蛋白小量表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未誘導(dǎo)菌比較，誘導(dǎo)菌組在約74.2kDa處有明顯表達(dá)條帶(圖2A)，H65蛋白在大腸桿菌中表達(dá)良好。大量表達(dá)(3L)發(fā)現(xiàn)H65蛋白占菌體總蛋白的39.82%(圖2B)。超聲處理后發(fā)現(xiàn)蛋白H65主要存在上清中(圖2B)。經(jīng)親和層析純化后H65蛋白主要存在于0.5mol/L咪唑洗脫液中，濃度為2.991mg/ml，純度為94.53%(圖2B)。

圖2 蛋白H65表達(dá)及純化電泳分析A.小量表達(dá)；B.大量表達(dá)及純化。1.未誘導(dǎo)菌；2～6.誘導(dǎo)菌；7.超聲后總菌體蛋白；8.超聲液上清；9.超聲液沉淀；10.親和層析上樣；11.穿柱；12.0.1mol/L咪唑洗脫液；13.0.5mol/L咪唑洗脫液

2.蛋白H65可以與HCV-IgG陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)：利用Western blot法，初步鑒定蛋白H65的抗原性。HCV陽(yáng)性血清作為一抗，山羊抗人IgG H&L(HRP)酶標(biāo)物作為二抗，在NC膜上相應(yīng)位置出現(xiàn)了明顯條帶(圖3A)；而HCV陰性血清作為一抗，在NC膜上相應(yīng)位置無(wú)條帶(圖3B)。并且無(wú)論是用HCV陰陽(yáng)性血清，無(wú)蛋白H65表達(dá)菌(空載體)都未見明顯條帶(圖3)。

圖3 蛋白H65的Western blot法分析A.HCV陽(yáng)性血清作為第一抗體，羊抗人IgG H&L (HRP)作為第二抗體；B.HCV陰性血清作為第一抗體，羊抗人IgG H&L(HRP)作為第二抗體；1.陰性對(duì)照；2.H65蛋白

3.基于蛋白H65的間接法ELISA可以很好地鑒別HCV-IgG陰陽(yáng)性血清標(biāo)本:蛋白H65作為包被抗原建立間接法ELISA試劑，分別對(duì)50份HCV陽(yáng)性和陰性血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性樣本A值分布為1.487±0.055，陰性血清樣本A值分布為0.082±0.007。兩組數(shù)據(jù)分布比較使用Wilcox檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)分布明顯不同(P<0.01)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)陰性血清A值均值2.1倍作為臨界值得出臨界值為0.171。McNemer檢驗(yàn)顯示結(jié)果，新制備診斷試劑與“金標(biāo)準(zhǔn)”比較，P=1.00，Kappa=0.940，提示診斷結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”一致性優(yōu)異。

圖4 蛋白H65在HCV感染血清學(xué)診斷效果P.陽(yáng)性血清；N.陰性血清

應(yīng)用某商品化試劑盒檢測(cè)相同的血清(按照說明書判定陰陽(yáng)性)，陽(yáng)性結(jié)果46份(46/50)，陰性結(jié)果44份(44/50)。與新型試劑盒進(jìn)行比較，詳見表1，進(jìn)行McNemer檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P=1.00，Kappa=0.900。

表1 新制備與商品化試劑盒比較(n)

討 論

多表位抗原區(qū)域的選擇依賴于4個(gè)關(guān)鍵因素:①免疫顯性區(qū)域；②對(duì)HCV抗體特異；③屬于線性或連續(xù)性表位；④在不同基因型之間進(jìn)化保守[4]。除了NS3區(qū)抗原區(qū)段大小達(dá)到264個(gè)氨基酸外，其他5個(gè)抗原區(qū)段大小都低于60個(gè)氨基酸。Palenzuela等[14]推論NS3蛋白所表現(xiàn)出的高免疫原性很可能是由構(gòu)象型表位觸發(fā)的，因此為了促使NS3區(qū)構(gòu)象型表位的形成，在其區(qū)域片段的選擇上并沒有局限于文獻(xiàn)所報(bào)道的表位區(qū)域。同樣，其他5個(gè)免疫顯性區(qū)域的選擇也在文獻(xiàn)報(bào)道表位區(qū)的基礎(chǔ)上上下游延伸部分氨基酸，以盡力確保完整表位的展現(xiàn)[15，16]?？紤]到我國(guó)HCV的主要流行株為1b和2a，尤其是1b占主導(dǎo)地位[8]。因此在抗原區(qū)域的選擇上，NS3、C和NS4A選取1b基因亞型，NS4A、NS4B和NS5A選取2a基因亞型。其中NS4A在1b和2a基因亞型中不保守，因此共存了這兩個(gè)相似表位[17]。

多表位串聯(lián)表達(dá)增加了蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的呈現(xiàn)及表達(dá)的難度[18]。首先，表位區(qū)域上下游的延伸以及GGGS連接臂的加入大大降低了各抗原區(qū)域之間的相互影響。選取的免疫顯性區(qū)主要為線性表位，加之連接臂的存在，大大降低了錯(cuò)誤折疊的發(fā)生。其次，Trx標(biāo)簽的融合，大大提高了可溶性表達(dá)的概率。再者，密碼子的優(yōu)化并不單單考慮最優(yōu)密碼子的替換，同時(shí)還考慮了轉(zhuǎn)錄和翻譯以及核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的動(dòng)能變化。最后，表達(dá)條件的優(yōu)化讓大部分目的蛋白以可溶性形式存在，且表達(dá)量占菌體總蛋白的39.82%(圖2B)。

基于多表位HCV診斷抗原建立的間接法ELISA敏感度為98.00%(cut-off值為0.171)，特異性為96.00%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.08%，陰性預(yù)測(cè)值為97.96%，符合率為97.00%。雖然與某商品化試劑盒比較不能否定一致性檢驗(yàn)存在差異(Kappa=0.900)，但參考上述指標(biāo)，新制備檢測(cè)試劑更加優(yōu)異。而且包被抗原只使用1個(gè)融合蛋白，相對(duì)于傳統(tǒng)診斷試劑使用3～6個(gè)融合蛋白大大降低了診斷試劑的成本以及假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，為血清學(xué)診斷的普遍使用及HCV診斷率的提高奠定基礎(chǔ)[19]。

本研究不足之處在于沒有評(píng)價(jià)新制備試劑對(duì)不同基因型HCV血清標(biāo)本的診斷效能。下一步工作將利用不同基因型(對(duì)HCV 1b和2a基因型血清標(biāo)本診斷效能優(yōu)異，數(shù)據(jù)未發(fā)表)血清對(duì)抗原的診斷效能進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

總之，多表位HCV診斷抗原能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中可溶性表達(dá)，以這一融合蛋白建立的間接法ELISA能夠?qū)CV陰陽(yáng)性血清標(biāo)本鑒別診斷。